Istituzione e caratterizzazione degli spheroeroidi del tumore intestinale piccolo intestinale

Riepilogo

I tumori neuroendocrini (NET) provengono da cellule neuroendocrine della cresta neurale. Sono in crescita lenta e impegnativi per la cultura. Vi presentiamo una strategia alternativa per far crescere le piccole viscere cullandoli come sferoidi. Questi sferoidi hanno piccoli marcatori di rete intestinale e possono essere utilizzati per i test antidroga.

Abstract

I tumori neuroendocrini intestinali piccoli (BNCR) sono tumori rari provenienti da cellule enterocrombaffina dell'intestino. La ricerca in questo campo è stata limitata perché sono state generate pochissime linee cellulari SBNET derivate dal paziente. Le cellule SBNET ben differenziate sono a crescita lenta e sono difficili da propagare. Le poche linee cellulari che sono state stabilite non sono prontamente disponibili, e dopo il tempo nella coltura potrebbero non continuare ad esprimere le caratteristiche delle cellule NET. La generazione di nuove linee cellulari potrebbe richiedere molti anni perché le cellule SBNET hanno un lungo tempo di raddoppio e sono necessari molti passaggi di arricchimento per eliminare i fibroblasti associati al cancro. Per superare questi limiti, abbiamo sviluppato un protocollo per la coltura delle cellule SBNET dai tumori rimossi chirurgicamente come sferoidi nella matrice extracellulare (ECM). L'ECM forma una matrice tridimensionale che incapsula le cellule SBNET e imita il microambiente tumorale per consentire alle cellule SBNET di crescere. Qui, abbiamo caratterizzato il tasso di crescita degli sferoidi SBNET e descritto i metodi per identificare i marcatori SBNET usando la microscopia immunofluorescenza e l'immunohistochimica per confermare che gli sferoidi sono cellule tumorali neuroendocrine. Inoltre, abbiamo usato sferoidi SBNET per testare la citotossicità della rapamicina.

Introduzione

I tumori neuroendocrini intestinali piccoli (BNCRIT) provengono da cellule enterochromaffine dell'intestino tenue. Anche se gli SBNET sono generalmente noti per crescere lentamente, comunemente metastatizzano al fegato¹. Mentre la rimozione chirurgica o l'ablazione del tumore può essere considerata in molti casi, la ricorrenza è quasi universale e, quindi, la terapia medica svolge un ruolo importante nella gestione. Sono stati investiti enormi sforzi per generare nuove linee cellulari SBNET per i test antidroga. Tuttavia, c'è stato molto poco successo. Solo 6 linee di celle SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) sono state segnalate^2,3,4^,5; e purtroppo una linea cellulare non esprime più i marcatori NET⁶ e altre tre linee cellulari SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) sono state determinate per essere derivate da linfoblasti trasformati invece di NET⁷. Al fine di accelerare l'identificazione dei farmaci per il targeting degli SBNET, sono necessari metodi alternativi per il test dei farmaci in vitro.

Qui, sfruttiamo la disponibilità di SBNET resezionati e abbiamo stabilito un modo per coltivare questi SBNET derivati dal paziente come sferoidi in crescita in ECM. L'obiettivo generale di questo manoscritto è quello di descrivere un metodo alla cultura SBNET come una cultura tridimensionale (3D) e delineare le procedure per caratterizzare questi sferoidi per la conservazione dei marcatori SBNET mediante colorazione immunofluorescenza e immunohistochimica.

Inoltre, dimostriamo come questi sferoidi SBNET possono essere utilizzati per testare l'effetto della rapamicina, un farmaco anti-cancro per NET⁸. La logica alla base di questo protocollo è quello di sviluppare un nuovo metodo per far crescere le cellule SBNET in vitro e usarle per i test antidroga. Il vantaggio di questa tecnica rispetto al metodo tradizionale di stabilire una linea cellulare SBNET è che le colture 3D di SBNETs possono essere rapidamente ottenute e test antidroga possono essere eseguiti entro 3 settimane. Gli sferoidi SBNET potrebbero essere potenzialmente utilizzati come modello per l'esecuzione di schermi di farmaci in vitro per identificare nuovi farmaci per i pazienti SBNET. Poiché le linee cellulari SBNET non sono ampiamente disponibili, le colture 3D degli sferoidi SBNET possono servire come nuovo modello in vitro per studiare gli SBNET e possono essere condivise tra gli scienziati del settore.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che utilizzano campioni di tumore neuroendocrino umano sono stati approvati dal comitato IRB dell'Università dell'Iowa Hospital and Clinics (numero di protocollo 199911057). Un elenco di tutti i materiali e le attrezzature è descritto nella Tabella dei Materiali. Un elenco di supporti di crescita e soluzioni chiave è disponibile nella tabella 1.

1. Raccolta di tumore intestinale piccolo (SBNET) e dissociazione cellulare

1. Ottenere campioni SBNET paziente resezionati dopo la conferma dei tessuti tumorali dal nucleo di patologia chirurgica.
2. Tagliare gli SBNET a cubetti da 5 mm e conservare in 25 mL di mezzo DMEM/F12 in un tubo conico per il trasporto al laboratorio.
3. Trasferire i tumori in DMEM contenenti 1% FBS, 1% penicillina /streptomycin (Pen/Strep), 1% glutammina (mezzo di lavaggio) e incubare in questo mezzo di lavaggio per 15 min.
4. Trasferire i tumori a un nuovo piatto e tritare i tumori a pezzi meno di 1 mm utilizzando forbici curve sterili.
5. Trasferire i tessuti macinati in un nuovo tubo da 50 mL contenente 25 mL di Wash Medium.
6. Centrifugare il campione a 500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
7. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente i pellet in 10 mL di Wash Medium contenenti collagenasi (100 U/mL) e DNase (0,1 mg/mL).
8. Lasciare che la digestione dei tumori macinati si verifichi in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con agitazione lenta (50 giri/min) per 1,5 h.

2. Cultura degli SBNET come sferoidi tumorali in ECM

1. Una volta completata la digestione (passaggio 1.8), centrifugare a 500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi, scartare il supernatante e risospendere il pellet in 15 mL di Wash Medium.
2. Posizionare un colino a 70 m sopra un nuovo tubo da 50 mL e trasferire 10 mL del mezzo di lavaggio sopra il colino cellulare. Swirl il mezzo di lavaggio per coprire il lato del tubo di plastica per evitare che le cellule NET si attacchino al lato del tubo di plastica.
3. Filtrare la sospensione cellulare attraverso il colino cellulare.
4. Centrifuga a 500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi, scartare il supernatante, rimettere in sospensione il pellet in 200 l of Wash Medium (il volume totale è di 250 gradi) e posizionarlo sul ghiaccio.
5. Trasferire 5 o L di cellule a 500 l of Wash Medium (fattore di diluizione 1/100). Utilizzare le celle diluite per il conteggio cellulare utilizzando un emocitometro per ottenere il numero di cellule per millilitro. Moltiplicare per 100 per correggere il fattore di diluizione.
6. Moltiplicare il numero di celle per mL ottenuto al punto 2,5 per il volume totale delle cellule in sospensione ottenuto al passo 2,4 (250 .
7. Centrifuga a 500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi, scartare il supernatale e sospendere nuovamente le cellule in ECM liquido (1 x 10⁶ cellule / mL) e tenere il ghiaccio.
8. Trasferire 5-20 l di sferoidi SBNET in ECM in una piastra di 96 pozzetti e lasciare che l'ECM liquido si solidifichi mettendo la piastra in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 5 min.
9. Aggiungete a ciascuno degli sferoidi SBNET 200 L di SBNET (DMEM/F12 ) e 10% di FBS , 1% PEN/STREP , 10 m di nicotina, 10 m di nicotina, 10 g/mL di insulina) a ciascun pozzetto della piastra di 96 pozzetti contenente gli sferoidi SBNET in ECM.
10. In alternativa, coltura organoidi SBNET nei media delle cellule staminali simili a quello che è stato descritto in precedenza per la coltivazione di fegato umano o organoidi pancreatici⁹ ed elencati nella Tabella dei Materiali.
11. Cambiare i supporti ogni 5-7 giorni.

3. Quantificazione della dimensione dello sferoide SBNET utilizzando ImageJ

1. Scatta 5-10 foto di sferoidi SBNET al Giorno 1, 4, 7, 14, 23 e 97 della cultura utilizzando un obiettivo 10x.
2. Aprire le immagini salvate in ImageJ. Vai alla scheda Analizza, seleziona l'opzione Imposta misure e inserisci un segno di spunta sull'opzione Area.
3. Usate lo strumento di selezione ovale dalla barra degli strumenti per generare un ellissoide o un cerchio attorno a uno sferoide ben focalizzato.
4. Passare alla scheda Analizza e selezionare l'opzione Misura. Ripetere i passaggi 3.4 e 3.5 per ottenere la misurazione dell'area da 25-50 sferoidi SBNET. I valori sono forniti in quadrato di pixel.
5. Convertire l'area del pixel in m² dividendo le dimensioni di ogni pixel con la lunghezza di ogni pixel in fattore di conversione m delle immagini di microscopia.
   NOTA: le cellule SBNET crescono principalmente come sferoidi e talvolta come ellissidi.

4. Caratterizzazione degli sferoidi SBNETS per immunofluorescenza

1. Trasferire gli organoidi coltivati in ECM in un tubo da 1,5 mL utilizzando una pipetta P1000.
2. Centrifuga a 1.500 x g per 1 min e rimuovere il supernatante.
3. Lavare la coltura organoide aggiungendo 1 mL di PBS, mescolare, centrifugare a 1.500 x g per 1 min e rimuovere il supernatante.
4. Fissare gli organoidi aggiungendo 500 gradi l del 4% di paraformaldeide e incubare per 15 min.
5. Lavare la coltura due volte con 1 mL di PBS.
6. Permeabiliizzare la coltura aggiungendo 500 L di PBS - 3% BSA - 0,1% Triton X 100 per 5 min.
7. Quindi lavare per tre volte con 1 mL di PBS - 3% BSA.
8. Incubare per 1 h con anticorpi primari contro la sinaptophysin (SYP)¹⁰ a 1/600 di luia o cromogranina A (CgA)¹¹ e recettore somatostatino 2 (SSTR2) 12 a 1/400 diluizione nel buffer anticorpale (2,5% di albumina di siero bovina, 0,1% recisto somatostatico 2 (SSTR2)¹² a 1/400 diluizione nel buffer anticorpale (2,5% di albumne di sornio bovino, 0,1% del retinistrazione di sodica bovina, 0,1% del sodiumato azide, 25 mM Tris pH 7.4, 150 mM di cloruro di sodio).
   NOTA: Utilizzare 300 o più di soluzione anticorpale per tubo.
9. Lavare tre volte con 1 mL di PBS - 3% BSA.
10. Incubazione con anticorpi secondari accoppiati al FITC a 1/500 di diluizione nel buffer anticorpale per 1 h. Utilizzare 300 o più di soluzione anticorpale per tubo.
11. Lavare 3 volte con 1 mL di PBS - 3% BSA. Assicurati di aspirare e scartare tutti i supernatali.
12. Aggiungere 5 - L di supporto di montaggio contenente la macchia nucleare DAPI.
13. Utilizzare una pipetta P20 per trasferire 5 o più l of the SBNET sferoids dal passaggio 4.12 a uno scivolo di vetro e sigillare con uno slittamento di copertura.
14. Scatta immagini utilizzando un microscopio fluorescente usando gli obiettivi 10x, 20x o 40x.

5. Caratterizzazione sferoidi SBNET per immunohistochimica (IHC)

1. Trasferire sferoidi SBNET dalla piastra di coltura a un tubo da 1,5 mL utilizzando una pipetta P1000.
2. Centrifuga a 1.500 x g per 1 min e rimuovere il supernatante.
3. Fissare gli sferoidi SBNET aggiungendo al tubo 500 - L di formalina del 10% al tubo e incubare a temperatura ambiente per 2-5 giorni prima dell'incorporamento della paraffina e tagliare sezioni di sferoide spesse 4 m.
4. Deparaffina, reidrata e utilizza il recupero dell'epitopo indotto dal calore nella soluzione di recupero dell'antigene a pH 9 riscaldando a 97 gradi centigradi per 20 minuti utilizzando la stazione di elaborazione automatica dei vetrini 3-in-1 per preparare i vetrini per l'incubazione degli anticorpi.
5. Bloccare i vetrini e incubare con anticorpi primari contro SYP¹⁰ a una diluizione di 1/100 per 15 min, CgA¹¹ a una diluizione 1/800 per 15 min e SSTR2¹² a una diluizione 1/5,500 per 30 min.
6. Incubare con il sistema secondario di rilevamento degli anticorpi per 15 min per la colorazione anti-SYP e CgA e 30 min per la colorazione anti-SSTR2. Scattare foto utilizzando un obiettivo 400x.

6. Trattamento degli organoidi SBNET con rapamicino

1. Sciogliere la rapamicicina in DMSO per ottenere una soluzione di 10 mM.
2. Preparare il supporto di coltura SBNET con DMSO (ad es., 1 mL di misura di coltura SBNET - 1 -L di DMSO) e il mezzo di coltura SBNET con 10 M di rapamicina (ad esempio, 1 mL di sbil di coltura SBNET medio - 1 luna di 10 mM di soluzione di rapamicina).
3. Trasferire 200 supporti con un mezzo di coltura SBNET con DMSO o 10 rapamicino a colture sferoidi SBNET.
4. Incubare sferoidi SBNET per 5 giorni in 37 gradi centigradi.
5. Aggiungere 1 M di ethidium homodimer e incubare per 30 min. Rimuovere il mezzo contenente ethidium homodimer, lavare con 200 l di PBS e trasferire 200 .L di PBS in ogni pozzo.
6. Scatta immagini microscopiche di sferoidi SBNET con e senza trattamento farmacologico utilizzando il cubo di filtro rosso con gli obiettivi 10x, 20x o 40x di un microscopio fluorescente.
   NOTA: Le cellule morte macchiate di Ethidium homodimer appaiono rosse utilizzando il cubo del filtro rosso G di un microscopio disponibile in commercio (Tabella dei materiali). In alternativa, il segnale può essere catturato utilizzando uno spettrofotometro a 535 nm eccitazione e 624 nm emissioni.

7. Divisione sferoidi SBNET

NOTA: Questo viene fatto per l'espansione e per la condivisione con altri ricercatori.

1. Utilizzare una pipetta P1000 per rompere meccanicamente l'ECM e aspirare l'ECM con sferoidi SBNET a un tubo sterile da 1,5 mL.
2. Centrifuga a 1.000 x g a 4 gradi centigradi, rimuovere tutto il supernatante e posizionare il tubo sul ghiaccio.
3. Aggiungere 2-4 volte il volume del nuovo ECM al pellet. Mescolare il nuovo ECM con i vecchi sferoidi ECM e SBNET pipetting su e giù 10x. Evitare l'introduzione di bolle d'aria.
4. Trasferire 5-20 l della miscela di sferoidi ECM e SBNET su una nuova piastra e lasciare che ECM si solidifichi.
5. Coprire con il nuovo supporto SBNET e trasferire all'incubatrice. Il tasso di recupero è di circa il 95-100%.
6. Per la spedizione di sferoidi SBNET in un altro laboratorio, trasferisci sferidi SBNET con il nuovo ECM su un pallone T25 e consenti a ECM di solidificare.
7. Riempire il pallone T25 con il mezzo sferoide SBNET, avvitare saldamente il tappo e preparare il pacco di spedizione.
8. Dopo aver ricevuto una cultura sferoide SBNET, rimuovere il mezzo di coltura ed eseguire il passaggio 7.1 a 7.5 per riportare gli sferoidi SBNET nella cultura.

8. Cryostorage e recupero di sferoidi SBNET

1. Trasferire sferoidi SBNET da 5-10 piccoli pozzi a un tubo da 15 mL. Centrifuga a 500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi, rimuovere il supernatale, rispendere nel mezzo di congelamento (90% FBS - 10% DMSO), conservare in un contenitore di congelamento cellulare, e posizionare questo a -80 gradi centigradi.
2. Trasferire all'azoto liquido per una conservazione più lunga.
3. Per recuperare sferoidi SBNET, posizionare la fiala congelata sul ghiaccio e attendere che il contenuto sia completamente scongelato. Invertire il tubo e riposizionare sul ghiaccio per accelerare il processo di scongelamento.
4. Una volta scongelato il campione, collocato all'interno di una centrifuga pre-raffreddata e ruotato a 1.000 x g per 10 min.
5. Rimuovere il supernatante e risospendere gli sferoidi in ECM. Tenere il tubo sul ghiaccio, trasferire 20 o più l su una nuova piastra e attendere che l'ECM si solidifichi.
6. Trasferire 200 l di misura di coltura SBNET con 10 s di inibitore ROCK (Y-27632)¹³ e trasferirlo all'incubatrice.
7. Consentire agli sferoidi SBNET di recuperare e crescere per 1 settimana. Rimuovere il vecchio mezzo di coltura, ricostituire con 200 L di SBNET misura coltura e tornare all'incubatrice.
8. Consentire agli sferoidi SBNET di continuare a crescere.
   NOTA: Ci vuole almeno 1 settimana per sferoidi in rapida crescita per iniziare a recuperare dopo la crioconservazione¹³. SBNET sferoidi prendono un minimo di 2-4 settimane per iniziare a crescere. Molte cellule SBNET moriranno entro le prime 2 settimane e il tasso di sopravvivenza è inferiore al 10%. Poiché si tratta di un processo di rendimento molto lungo e basso, è meglio condividere con altri ricercatori sferoidi SBNET nei flaconi di coltura (come descritto nel passaggio 7). Cryostorage e ripristino dovrebbero essere utilizzati solo come piano di backup in caso di contaminazione batterica.

Risultati

Attualmente ci sono solo 2 linee cellulari SBNET stabilite e pubblicate^2,3,4,5 e non sono prontamente disponibili per molti ricercatori. Qui, proponiamo alla cultura SBNET come sferoidi in ECM e usiamo questo come un modello alternativo per studiare la sensibilità ai farmaci SBNET. Il tumore derivato dal paziente da un SBNET che metastatizzato al fegato è stato raccolto, digerito per rilascia...

Discussione

Le colture 3D tumorali sono diventate una risorsa preziosa per i test preclinici sui farmaci¹⁵. Varie biobanche organoidi tumorali sono stati recentemente stabiliti da cancro al seno e tumori del cancro alla prostata^16,17. In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato alla cultura SBNET come sferoidi e un metodo semplice e veloce per convalidare le colture sferoidi per i marcatori NET mediante immunofluorescenza e testare la sensibi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-rabbit FITC	Jackson ImmunoResearch	11-095-152	Secondary antibody couple to a green fluorophore
Antigen Retrieval Solution	Agilent Dako	S2367	Solution at pH 9 for preparing slides for IHC
Autostainer Link 48	Agilent Dako	Not Available	Automated system for antibody staining
Cell freezing container	Thermo Scientific	5100-0001	Container to for freezing cells
CellSence	Olympus	Version 1.18	Computer software for using fluorescent microscope
Chromogranin A antibody	Abcam-45179	RB-9003-PO	Antibodies for IF
Chromogranin A antibody (clone LK2H10)	Thermo Scientific	MA5-13096	Antibodies for IHC
Collagenase	Sigma	C0130	Enzyme for digesting tumor tissue
DMEM	Gibco	11965-092	Medium for tissue preparation
DMEM/F12	Gibco	11320-033	Medium for organoid cultures
DMSO	Sigma	D8418	Solvent for dissolving drug
DNAse	Sigma	DN25	Enzyme for digesting tumor tissue
Ethidium Homodimer	Chemodex	CDX-E0012-T1E	DNA and RNA binding dye
FBS	Gibco	16000044	Reagent for culture media
Fluorescent microscope	Olympus	CKX35	Microscope for taking pictures of SBENT spheroids
Glutamine	Gibco	A2916801	Reagent for culture media
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.51	Computer software for image analysis
Insulin	Sigma	I0516	Reagent for culture media
Matrigel	Corning	356235	Matrix to embed and anchore organoids
Mounting medium (VECTASHIELD)	Vector Laboratories	H-1200	Fixative for labelled-cells with a nuclear stain
Nicotinamide	Sigma	72340	Reagent for culture media
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagent to fix cells
PEN/STREP	Gibco	15140-122	Reagent for culture media
PT Link	Agilent Dako	Not Available	Automated system to prepare slides for IHC staining
Rapamycin	Alfa Aesar	J62473	Drug that can inhibit NET growth
Secondary antibodies for IHC	Agilent Dako	K8000	Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system
SSTR2 antibody	GeneScritp	A01591	Antibodies for IF
SSTR2 antibody (clone UMB1)	Abcam	ab134152	Antibodies for IHC
Synaptophysin antibody	Abcam	32127	Antibodies for IF
Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)	Agilent Dako	M7315	Antibodies for IHC
TritonX	Mallinckrodt	3555 KBGE	Reagent to permeablize cells
Y-2763 ROCK inhibitor	Adipogen	AG-CR1-3564-M005	To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw