عدوي المكورات الرئوية من خلايا بطانة الإنسان الاساسيه في التدفق المستمر

Summary

تصف هذه الدراسة الرصد المجهري للالتزام بالمكورات الرئوية لسلاسل عامل فون ويلبراند المنتجة علي سطح الخلايا البطانية الاساسيه البشرية المتمايزة تحت ضغط القص في ظروف التدفق المحددة. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل التصور التفصيلي للهياكل الخلوية المحددة والقياس الكمي للبكتيريا عن طريق تطبيق إجراءات المناعة التفاضلية.

Abstract

يتم التوسط في تفاعل العقديه الرئوية مع سطح الخلايا البطانية في تدفق الدم عن طريق البروتينات الميكانيكية مثل عامل فون ويلبراند (vwf). هذا البروتين السكري يغير التشكيل الجزيئي الخاص به استجابه للإجهاد القص ، التالي تعريض مواقع ملزمه لمجموعه واسعه من التفاعلات المضيف-ligand. بشكل عام ، من المعروف ان زراعه الخلايا البطانية الاوليه تحت تدفق القص محدده لتعزيز التمايز الخلوي محدده وتشكيل طبقه بطانية مستقره ومرتبطة باحكام تشبه فسيولوجيا البطانة الداخلية للاوعيه الدموية . وهكذا ، فان التحليل الوظيفي للتفاعلات بين مسببات الامراض البكتيرية والاوعيه الدموية المضيفة التي تنطوي علي البروتينات الميكانيكية يتطلب إنشاء أنظمه ضخ التي يمكن محاكاة قوي تدفق الفسيولوجية المعروف ان تؤثر علي سطح خلايا الاوعيه الدموية.

ويتيح الجهاز المجهري المستخدم في هذه الدراسة أعاده تدوير مستمرة ونبضه للسوائل بمعدل تدفق محدد. يطبق نظام مضخة ضغط الهواء الذي يتحكم فيه الكمبيوتر ضغطا محددا للقص علي أسطح الخلايا البطانية عن طريق توليد تدفق متوسط مستمر وأحادي الاتجاه ومتحكم فيه. يمكن رصد التغيرات المورفولوجية للخلايا والملحقات البكتيرية مجهريا وتحديدها كميا في التدفق باستخدام شرائح قناه خاصه مصممه لتصور مجهري. علي النقيض من العدوى الخلوية الساكنة ، والتي تتطلب بشكل عام تثبيت العينات قبل وضع العلامات المناعية والتحاليل المجهرية ، فان الشرائح الصغيرة تتيح الكشف القائم علي الفلورية للبروتينات والبكتيريا والمكونات الخلوية بعد تثبيت العينة ؛ المسلسل تلطيخ المناعي. والكشف المباشر القائم علي الفلورية في الوقت الحقيقي. في تركيبه مع البكتيريا الفلورية والأجسام المضادة المسمية الفلورية المحددة ، يوفر هذا الاجراء العدوى نظام التصور مكون متعددة فعاله لطيف ضخم من التطبيقات العلمية المتعلقة بعمليات الاوعيه الدموية.

Introduction

وتتميز الاصابه بالتهابات المكورات الرئوية بتفاعل متعدد الأوجه مع تنوع مركبات مصفوفة خارج الخلية ومكونات الأرقاء البشري ، مثل البلازمينوجين و vwf^{1،2، 3،4،5،6،7،8}. البروتين السكري متعدد المجالات VWF بمثابه منظم الرئيسية من الأرقاء متوازنة عن طريق التوسط في التوظيف الجلطات والتاسيس الفيفيبين في موقع تشكيل خضيه الاوعيه الدموية⁹. ويتجلى اهميه الوظيفية ، VWF النشطة للسيطرة علي النزيف والتئام الجروح من قبل المرض فون ويلبراند ، وهو اضطراب النزيف الموروثة المشتركة¹⁰.

يدور vwf الكروي في نظام الدم البشري بتركيز يصل إلى 14.0 ميكروغرام/مل^11,10. ردا علي أصابه الاوعيه الدموية ، والإفراج المحلي من vwf بواسطة الهيئات البطانية weibel palade (wbp) زيادة ملحوظة^11،12. وتبين الدراسات السابقة ان التصاق بالمكورات الرئوية للخلايا البطانية البشرية وإنتاجها من السموم التي تشكل المسام بنيوموليسين بشكل كبير يحفز التلالؤ VWF إفراز¹³. القوي الهيدروديناميكية لتدفق الدم للحث علي فتح الهيكلية للمجالات VWF الألى المستجيبة. في معدلات التدفق من 10 داين/سم² و vwf multimerizes إلى سلاسل البروتين طويلة تصل إلى عده مئات ميكرومتر في الطول التي لا تزال تعلق علي سوبيندوثيليوم^10,12.

لفهم وظيفة السلاسل VWF multimerized المتولدة تحت الضغط القص في التفاعل من المكورات الرئوية مع سطح بطانية ، تم تاسيس نهج العدوى ثقافة الخلية القائمة علي ميكروفلويديك. تم استخدام جهاز ميكروفلويدريك مع نظام مضخة ضغط الهواء التي تسيطر عليها البرمجيات. وقد مكن ذلك من أعاده التدوير المستمرة أحاديه الاتجاه لمتوسط ثقافة الخلية بمعدل تدفق محدد. التالي ، طبق النظام إجهادا محددا للقص علي سطح الخلايا البطانية ، والذي ظل ملتصقا داخل شرائح القناات المتخصصة. وقد مكن هذا النهج من محاكاة قوه القص داخل مجري الدم لنظام الاوعيه الدموية البشرية ، الذي تولد فيه سلاسل VWF علي خلايا بطانية متباينة تحت ظروف تدفق ثابته محدده. لهذا الغرض ، تم زراعه الخلايا البطانية في شرائح قناه محدده (انظر جدول المواد) ، والتي تم تكييفها للتحليلات المجهرية اثناء التدفق. وقد وفر نظام المضخة ميكروفلويديك وضع الإجهاد القص المحدد بدرجه عاليه والمتحكم به والمطلوب لتشكيل سلاسل vwf الموسعة علي طبقه الخلايا البطانية المتموجة. بعد تحفيز VWF-إفراز خلايا الوريد الحبل السري البشري كونفلوينتلي نمت (HUVEC) بواسطة مكملات الهيستامين ، وكان المستحث تشكيل سلسله من خلال تطبيق الضغط القص (ԏ) من 10 داين/سم². يتم تعريف الإجهاد القص كقوة تعمل علي طبقه الخلية. وتحسب تقريبا وفقا لكورنيش et. al.¹⁴ مع المعادلة 1:

حيث ԏ = القص الإجهاد في داين/سم²، η = اللزوجة في (داين ∙ s)/سم²، h = نصف ارتفاع القناة ، ث = نصف عرض القناة ، و Φ = معدل الجريان في مل/دقيقه.

تعتمد نتيجة المعادلة 1 علي الارتفاعات والعروض المختلفة للشرائح المختلفة المستخدمة (انظر جدول المواد). في هذه الدراسة تم استخدام شريحة قناه Luer من 0.4 μm الناتجة في عامل الشريحة الغرفة من 131.6 (انظر الصيغة 2).

اللزوجة من الوسط عند 37 درجه مئوية هو 0.0072 داين ∙ s/cm ² وتم استخدام الضغط القص من 10 داين/سم ². ونتج عن ذلك معدل تدفق 10.5 مل/دقيقه (انظر الصيغة 3).

هنا ، يتم وصف التكيف والتقدم من الخلية ميكروفلويدريك اجراء التنظير باستخدام نظام تدفق الصفعي أحادي الاتجاه للتحقيق والتصور من أليات العدوى البكتيرية في الاوعيه الدموية المضيف بالتفصيل. يمكن أيضا تحفيز توليد سلاسل VWF علي طبقات بطانية باستخدام أنظمه المضخات الأخرى التي هي قادره علي تطبيق الإجهاد القص مستمرة وثابته¹⁵.

بعد زراعه الخلايا البطانية الاوليه للتقاء في تدفق وتحفيز تشكيل سلسله VWF ، تمت أضافه المكورات الرئوية التي تعبر عن البروتين الأحمر الفلوري (عروض العروض)¹⁶ إلى طبقه الخلايا البطانية تحت السيطرة المجهرية المستمرة. تم مجهريا تصور ومراقبه المرفق من البكتيريا إلى سلاسل VWF علي سطح الخلايا البطانية ورصدها لمده تصل إلى ثلاث ساعات في الوقت الحقيقي باستخدام الأجسام المضادة المحددة بالنيون التي تحمل علامة الفلورسنت. مع هذا النهج ، تم تحديد دور VWF كعامل التصاق تعزيز التعلق البكتيرية لبطانة الاوعيه الدموية⁸.

بالاضافه إلى التصور المجهري لإفراز البروتين وتغييرات المطابقة ، يمكن استخدام هذه الطريقة لمراقبه الخطوات الفردية لعمليات العدوى البكتيرية في الوقت الحقيقي ولقياس كميه البكتيريا المرفقة في نقاط زمنيه مختلفه من العدوي. كما يوفر نظام المضخات الذي يتم التحكم فيه بواسطة البرامج امكانيه لاستزراع الخلايا البطانية في ظروف التدفق الثابتة المحددة لمده تصل إلى عده أيام وتمكين الحاضنة المتوسطة التدفق المحددة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة باستخدام أنواع مختلفه من الخلايا. تكييف بروتوكول تلطيخ أيضا تمكن من الكشف والتصور من البكتيريا التي تم استيعابها في الخلايا النواة.

تصف هذه المخطوطة هذا البروتوكول التجريبي المتقدم الذي يمكن استخدامه كنهج محدد وموثوق به وقابل للتكرار لتوصيف العمليات الفسيولوجية المرضية بطريقه تتسم بالكفاءة والتنوع.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد أجريت زراعه الخلايا المجهرية مع خلايا بطانة الوريد السري البشري الرئيسية التجارية (HUVEC). وقد عزلت الشركة الزنزانات بموافقه مستنيرة من الجهة المانحة. تمت الموافقة علي هذه الدراسة من قبل لجنه الأخلاق من غرفه الأطباء في الدولة الاتحادية بادن-فيرتمبرج مع الرقم المرجعي 219-04.

ملاحظه: انظر جدول المواد للوازم المراسم.

1. بريكولتيفيشن الخلايا البطانية الاوليه

1. ذوبان قارورة الجلسرين المجمدة التي تحتوي علي 1 × 10⁵ HUVEC الابتدائية من ثلاثه مانحين مختلفين برفق في 37 درجه مئوية والبذور الخلايا في 7 مل من متوسط نمو الخلايا البطانية المعتدلة (ecgm ، وعلي استعداد للاستخدام مع المكملات الغذائية) في 25 سم² خليه قارورة.
   ملاحظه: تفقد الخلايا البطانية الاساسيه القدرة علي التمايز بعد أكثر من 5 دورات الانتشار. ولذلك ، يمكن استخدام الخلايا التي تحتوي علي اقل من 5 مقاطع فقط إذا كانت الدرجات العالية من تمايز الخلايا مطلوبه.
2. زراعه الخلايا في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO₂ جو لمده 60 دقيقه للسماح المرفقات السطحية وتبادل المتوسطة الخلية ecgm الثقافة للتخلص من بقايا من الحفظ.
3. مواصله زراعه الخلايا في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO₂ الغلاف الجوي حتى انها تشكل طبقه خليه سوبكونفلوينت.
   ملاحظه: يجب ان لا ينمو HUVEC إلى طبقه متموج منذ الاتصالات خليه خليه ضيقه منع تشكيل طبقه خليه مستقره في وقت لاحق في التدفق.

2. بريكولتيفيشن العقديه الرئوية

تحذير: العقديه الرئوية هي عامل مستوي السلامة البيولوجية 2 ويسمح فقط ليتم استزراعها في مختبرات مستوي السلامة الاحيائيه 2. استخدام مقعد نظيفه تصنف لمستوي السلامة 2 لجميع العلاجات البكتيرية ، وتجنب بدقه تشكيل الهباء الكتروني ، واستخدام جهاز الطرد المركزي مع حماية الهباء الكتروني لترسب البكتيريا.

1. تطعيم لوحه أجار الدم كولومبيا مع العقديه الرئوية العزلة السريرية ATCC11733 المستمدة من الأسهم الجلسرين تخزينها باستمرار في-80 درجه مئوية وزراعه لوحه أجار بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO₂.
2. اعداد 40 مل من المرق السائل تود هيويت تستكمل مع 1 ٪ استخراج الخميرة (THY) و 15 مل من الفوسفات معقمه-مخزنه المالحة (تلفزيوني) pH 7.4 ، للزراعة البكتيرية وخطوات الغسيل.
3. استخدام أنبوب معقم للزراعة البكتيرية وتطعيم مرق الثقافة السائلة مع كتله البكتيريا. السيطرة علي كميه من التلقيح عن طريق قياس فوتومتري من 1 مل قسامات في 600 نانومتر ضد مرق السائل غير تطعيم كمرجع. أملا الكتلة البكتيرية في المرق السائل حتى يصل إلى كثافة بصريه عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) 0.15.
4. احتضان مرق السائل تطعيم دون اهتزاز في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO₂ وتحديد OD₆₀₀ كل 30 دقيقه عن طريق قياس 1 مل قسامات باستخدام cuvettes البلاستيك.
5. بمجرد ان الثقافة البكتيرية قد وصلت إلى₆₀₀ OD من 0.4 ، والذي يتوافق مع مرحله النمو الاسي ، الطرد المركزي تعليق الثقافة البكتيرية لمده 10 دقيقه في 1,000 x g في درجه حرارة الغرفة (RT).
   ملاحظه: لا تسمح للثقافة المكورات الرئوية للوصول إلى₆₀₀ OD من أكثر من 1.0 ، لان كثافة ثقافة المكورات الرئوية العالية ومن المعروف ان تؤدي إلى التحلل التلقائي البكتيري ، والتي قد تؤثر علي اللياقة البدنية البكتيرية الشاملة.
6. أعاده تعليق الرواسب البكتيرية برفق مع 10 مل تلفزيوني والرواسب مره أخرى لمده 10 دقيقه في 1,000 x g في RT.
7. أعاده تعليق الرواسب البكتيرية المغسولة برفق في 1 مل تلفزيوني وتحديد OD₆₀₀ من 10 μl من تعليق البكتيرية باستخدام 1 مل من تلفزيوني كمرجع.
8. ضبط كميه البكتيريا في الاذاعه التلفزيونية إلى₆₀₀ OD من 2.0. وفقا لجرد البكتيرية المحددة سابقا ،₆₀₀ OD من 2.0 يقابل 2 × 10⁹ مستعمره تشكيل وحدات (كفو). علي الفور المضي قدما في اجراء العدوى لمنع انحلال الذاتي البكتيرية.

3. زراعه الخلايا البطانية من HUVEC تحت شروط ميكروفلويدريك

1. افصل الخلايا البطانية الاساسيه من قارورة ثقافة الخلية بواسطة التحلل البروتيني المتحكم به. قم بتنفيذ الخطوات التالية في بيئة معقمه باستخدام مقعد نظيف. اعداد حجم 15 مل من التعقيم التلفزيوني لخطوات الغسيل.
   1. أزاله ECGM من طبقه HUVEC سوبكونفلوينتلي نمت وغسل طبقه الخلية مع 10 مل تلفزيوني باستخدام ماصه المصلية للتخلص من الخلية ثقافة المتوسطة.
   2. احتضان HUVEC غسلها مع 3 مل من 37 درجه مئوية محلول التفكك الخلية المسخن لمفرزه الخلية لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية. مراقبه انفصال الخلايا البروتينية عن طريق الرصد المجهري في كل دقيقه.
   3. ماصه التعليق خليه منفصلة في أنبوب يحتوي علي 7 مل من ECGM تستكمل مع 2 ٪ مصل العجل الجنين (FCS) لوقف التحلل البروتيني والرواسب الخلايا لمده 3 دقائق في 220 x g في RT.
   4. أزاله ماده طافي وأعاده تعليق huvec في 250 μl من ecgm تستكمل مع 5 ٪ FCS و 1 ملم mgso₄. استخدام 10 μL من تعليق الخلية لعد الخلايا باستخدام خليه نويباور غرفه العد وضبط عدد الخلايا إلى 4 × 10⁶ خلايا/مل ecgm تستكمل مع 5 ٪ FCS و 1 ملم mgso₄.
      ملاحظه: لكل تجربه تدفق 30 مل من متوسط ECGM تستكمل مع 5 ٪ FCS ومع 1 ملم MgSO₄ سيكون مطلوبا. من هنا علي هذا التكوين المتوسط يسمي ECGMS المتوسطة. زيادة تركيز FCS في الوسط الثقافي من 2 ٪ إلى 5 ٪ يدعم مرفق الخلية وبقاء الخلية من HUVEC المصنفة في شريحة القناة. المتوسطة ملاحق FCS و MgSO₄ استقرار إلى حد كبير المرفق الخلية من HUVEC تحت ظروف الإجهاد القص.
2. البذور وزراعه HUVEC في شريحة قناه. العمل في بيئة معقمه باستخدام مقعد نظيف. وسوف تزرع الخلايا تحت ضغط القص لمده 2 أيام تليها العدوى مع البكتيريا والرصد المجهري لمده 2 ساعة أخرى.
   1. تتوازن شريحة قناه ، مجموعه ترويه 1.6 mm في القطر و 50 سم في الطول ، وهو قسامه من المتوسطة ecgms ، وشريحة قناه luer 0.4 μm في الارتفاع ، ل 24 ح في حاضنه مع 5 ٪ CO₂ الغلاف الجوي في 37 درجه مئوية للحد من عدد من فقاعات الهواء.
      ملاحظه: ينصح بهذا الاجراء لأزاله الغاز من المعدات البلاستيكية وتسخين الوسط والأنابيب المنصهرة والخزانات. إذا تم تخزين المواد أو السوائل في RT أو في الثلاجة ، سيتم الإفراج عن الغازات المذابة في البلاستيك والسوائل عندما يسخن في الحاضنة اثناء التجربة. ثم ستظهر فقاعات الغاز. التخلص من جميع المكونات البلاستيكية قبل التجربة سيزيل هذا التاثير. في كل مره يتم فيها إخراج النظام من الحاضنة ، تبدا عمليه امتصاص الغاز مره أخرى. ولذلك ، والعمل بسرعة في RT وأبدا ترك وحده فلويديك خارج الحاضنة لفترات زمنيه أطول.
   2. استخدم ماصه لحقن 100 μL من محلول الجيلاتين العقيم المصفي بنسبه 2% في محلول البث التلفزيوني في أحد خزانات شريحة القناة المعايرتهاه بدرجه الحرارة. احتضان الحل الجيلاتين ل 1 ح في 37 درجه مئوية وشطف قناه الشريحة مع 1 مل تلفزيوني تحت ظروف معقمه باستخدام حقنه Luer 1 مل.
   3. ضع شريحة القناة المغلفة بالجيلاتين علي طبقه البوليسترين الرقيقة أو لوحه الستايروفوم لمنع حدوث انخفاض في درجه حرارة الشريحة. أضافه 100 μL من 4 × 10⁶/مل تعليق HUVEC مع حقنه luer 1 مل في الشريحة.
      ملاحظه: وضع شريحة القناة علي سطح المعدن البارد من مقاعد البدلاء نظيفه يمكن ان تقلل من درجه حرارة أسفل الشريحة ، التالي توليد الإجهاد البارد إلى الخلايا البطانية. اثناء وضع الأنابيب الخلية عقد الشريحة قليلا صعودا للسماح فقاعات الهواء ترتفع وتختفي من داخل الشريحة.
   4. احتضان الشريحة قناه مع HUVEC ل 60 دقيقه في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO₂ وتملا الخزانات المتوسطة في كلا طرفي الشريحة القناة مع 60 ΜL ecgms-متوسطه لكل منهما. احتضان ل 1 ح في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO₂.
3. ضبط مضخة ميكروفلويديك وإعدادات البرنامج.
   1. توصيل مجموعه معايرتها ترويه إلى وحده مضخة ، وملء مع 13.6 mL من ecgms-المتوسطة ، وبدء تشغيل البرنامج مضخة التحكم. حدد مجموعه ترويه كافيه ونوع من الشريحة الغرفة باستخدام التمرير لأسفل النوافذ في القائمة من وحده فلويديك اعداد. اختر 0.007 (داين ∙ s/cm²) في البرنامج للزوجة المتوسطة. (راجع إعدادات برامج ضخ الضغط التي تم وضع علامة عليها بالأسهم الحمراء في الشكل التكميلي 1).
   2. خارج الحاضنة ، قم بتوصيل زجاجه مملوءة بحبات السيليكا المجففة إلى أنابيب ضغط الهواء (راجع الشكل 1، أقحم 3). الهواء من مضخة الضغط يدور بين الخزانات ترويه والمضخة ويجب ان تكون جافه قبل أعاده إدخال جهاز المضخة. حدد تدفق المعلمات في القائمة البرمجيات ، وتعيين الضغط علي 40 mbar ، ومسح أنابيب مضخة مع المتوسطة السائلة من خلال بدء تدفق متوسطه مستمرة. (ويشار إلى هذه الإعدادات أيضا بواسطة الأسهم الحمراء في الشكل التكميلي 1).
   3. برنامج دورات الإجهاد القص المطلوبة للزراعة تدفق. تبدا مع 5 داين/سم²، والسيطرة بومبينج الخزان متوازنة وأؤكد انه لا يتم تعميم فقاعات الهواء في نظام المضخة.
      ملاحظه: يعتمد الضغط القص الجدار في شريحة قناه علي معدل التدفق واللزوجة من الوسط ترويه. إذا كنت تستخدم نظام ضخ آخر ، يرجى الرجوع إلى المعادلات الموصوفة في مقدمه لتعيين معدل تدفق توليد مستوي الإجهاد القص المطلوب. تتوافق الإعدادات الموصوفة مع معدل تدفق 5.42 مل/دقيقه. (تظهر لقطه شاشه مثاليه تظهر إعدادات معلمه التدفق الكافية في برنامج ضخ الضغط في الشكل التكميلي 2).
   4. وقف تدفق الدورة الدموية في البرنامج التحكم مضخة وعقد تدفق المتوسطة في أنابيب ترويه عن طريق لقط الأنابيب بالقرب من اتصالات luer. توصيل شريحة القناة ، التالي تجنب فقاعات الهواء ، ووضع وحده فلويديك مع شريحة قناه متصلة في حاضنه co₂ في 37 درجه مئوية و 5 ٪ co₂. بدء الإجهاد القص في 5 داين/سم² لمده 30 دقيقه للتكيف بسلاسة الخلايا إلى القوات المتولدة عن الإجهاد القص قبل تسريع مستوي الإجهاد القص (انظر الشكل التكميلي 3).
      ملاحظه: الحرص علي ان لا تبقي فقاعات الهواء في نظام أنبوب أو في الشريحة بعد connectinng إلى نظام أنبوب لان حركه فقاعات الهواء في تدفق قد يؤدي إلى مفرزه الخلية.
   5. تسريع الضغط القص إلى 10 داين/سم² (التي تتوافق مع 10.86 mL/min في هذا الاعداد تدفق) واحتضان شريحة القناة في الإجهاد القص المستمر ل 48 h في حاضنه صغيره co₂ في 37 درجه مئوية و 5 ٪ co₂ للسماح التمايز الخلية ( ويشار إلى البرنامج المعني بالأسهم الحمراء في الشكل التكميلي 4).
      ملاحظه: خلايا HUVEC تميل إلى فصل من سطح القناة إذا بدات زراعه تدفق مباشره في 10 داين/سم². تبقي الخلايا تعلق علي سطح الغرفة إذا بدات زراعه التدفق مع اقل القص الإجهاد باستخدام 5 داين/سم² لمده لا تقل عن 30 دقيقه تليها زيادة الإجهاد القص ببطء حتى المطلوب 10 داين/سم². الضغط القص من 10 داين/سم² هو الحد الأدنى للقيمة في هذا الاعداد ترويه المطلوبة لتشكيل سلسله vwf.
   6. بعد 24 ساعة من زراعه الخلايا المجهرية ، توقف التدفق المتوسط مع برنامج التحكم في المضخة بالبالضبط عندما يتم الوصول إلى مستوي متوسط متوازن في كل من الخزانات المتوسطة. ضع وحده فلويديك في مقعد نظيفه وأزاله 10 مل من المتوسطة زراعه الموزعة من الخزانات ترويه باستخدام ماصه المصلية 10 مل. أضافه 10 مل من ecgms-متوسطه في الخزانات لتجديد المتوسطة ، ووضع وحده فلويديك مره أخرى في الحاضنة₂ co في 37 درجه مئوية و 5 ٪ co₂، وأعاده تشغيل زراعه فلويدريك باستخدام مضخة التحكم البرمجيات.
      ملاحظه: وظيفة مضخة الضغط يمكن ان تتعطل فجاه من قبل آلات المختبرات مثل أجهزه الطرد المركزي الكبيرة ، والتي قد تخلق اضطرابات المجال المغناطيسي قويه. قد يؤدي هذا الاضطراب المفاجئ إلى انفصال الخلايا. انتبه ان هذه آلات ليست نشطه بالقرب من مضخة الضغط اثناء التجربة.
   7. بدء الاحترار من غرفه الحضانة درجه الحرارة التي تغطي مرحله المجهر مضان إلى 37 درجه مئوية لدرجه الحرارة تاخيرمن 24 ساعة قبل التصور المجهري. بعد ان يتم تسخين المجهر ، بدء التحكم في البرامج المجهر وضبط الإعدادات الرئيسية للرصد المجهرية مضان عن طريق تحديد إعدادات مرشح المناسبة (540 nm/590 نانومتر للكشف عن البكتيريا والتعبير عن عروض العروض 470 nm/515 نانومتر للكشف عن الانبعاثات الفلوريسئينه من الأجسام المضادة الخاصة المترافقة مع FITC). يسخن غرفه تسخين اضافيه لاحتضان وحده فلويدريك عند 37 درجه مئوية.
      ملاحظه: خلال تحليلات العدوى والرصد المجهري درجه حرارة الشريحة القناة والمتوسطة المتداولة لا ينبغي ان تنخفض إلى حد كبير ، لان هذا من شانه ان يولد الإجهاد البارد علي الخلايا. بشكل عام ، وحجم غرف درجه الحرارة التي تغطي مرحله المجهر ليست كافيه لتغطيه وحده فلويديك كله. ولذلك ، ينصح باستخدام غرفه تسخين اضافيه إلى 37 درجه مئوية.
   8. بالنسبة للتصور المجهري ، ضع وحده فلويدريك في 37 درجه مئوية التسخين المسبق للغرفة ووضع شريحة القناة علي مرحله من 37 درجه مئوية المجهر الذي تم تسخينه مسبقا.
      ملاحظه: بالنسبة للتصورات المجهرية ، تحتاج وحده فلويدريك وشريحة القناة إلى ازالتها من حاضنه CO₂ بسبب الطول المحدود لأنابيب التروية. إذا العدوى مرات ورصد المجهرية أطول من 180 دقيقه مطلوبه خارج 5% CO₂ جو للتخزين المؤقت لدرجه الحموضة ، وينبغي استخدام متوسط الحموضة المخزنة للزراعة ميكروفلويديك.
   9. السيطرة علي الشكل الخلية وسلامه طبقه HUVEC قبل حقن الهستامين والبكتيريا إلى تدفق الدورة الدموية طوال الوقت من التجربة تدفق وبعد الانتهاء من تجربه تدفق باستخدام وضع حقل مشرق من المجهر.

4. التعريفي من VWF-الإفراج والتصور من سلاسل VWF Multimerized

1. الحفاظ علي تدفق الاعداد ، وذلك لان الضغط القص من 10 داين/سم² مطلوب لتحريك multimerization من vwf لسلاسل طويلة تصل إلى 200 MDa. حمل الإفراج عن vwf من البطانية wpb عن طريق حقن 136 μl من 100 mM الحل الأسهم الهيستامين في ecgms-متوسطه تعميمها في أنابيب ترويه باستخدام منفذ الحقن. سيكون التركيز النهائي من الهستامين في المتوسطة تدفق 1 مم. إذا لم يتوفر منفذ حقن ، يمكن أضافه الهستامين بدلا من ذلك عن طريق الأنابيب في وسط خزانات المضخة.
2. للكشف عن المناعي لسلاسل VWF multimerized ، ووقف تدفق عندما يتم التوصل إلى مستوي متوسط متوازن في الخزانات ، وحقن 20 ميكروغرام من الأجسام المضادة الخاصة FITC-مترافق في حجم 200 μL تلفزيوني (pH 7.4) في تعميم 13.6 مل من ECGMS-متوسطه باستخدام منفذ حقن. إذا لم يتوفر منفذ حقن ، يمكن أضافه الجسم المضاد بدلا من ذلك عن طريق النفخ في وسط خزانات المضخة. وهذا يؤدي إلى تركيز الأجسام المضادة النهائية من 1.3 ميكروغرام/مل.
3. للمسح المجهري لعده مجالات من الرؤية في وقت قصير ، استخدم وحده مضان من المجهر مع جهاز الفلورية زينون في السلطة 30 ٪ وكاميرا العدسة. راقب شكل وتشكل طبقه HUVEC مع وضع الحقل الساطع لتحديد الخلايا التمثيلية المناسبة لمرئيات السلاسل VWF.
4. لتصور الأخضر الفلورسنت سلاسل VWF ، حدد الهدف النفط 63x/1.40 وتصفيه الكشف عن 470 nm في القائمة الوحدة الفلورية من البرنامج المجهر (LasX). إنشاء لقطات من المكدسات Z علي الأقل 50 عرض الحقل التمثيلي ، تحتوي كل منها علي ما يقرب من 10 HUVEC سليمه شكليا. للقياس الكمي لسلاسل VWF الفلورية الخضراء في نقاط زمنيه مختلفه ، امسح عده حقول من العرض.

5. التقييم المجهري للمرفق البكتيري لسلاسل VWF في التدفق في الوقت الحقيقي

1. قياس مرفق المكورات الرئوية إلى سلاسل VWF التي تم إنشاؤها علي أسطح الخلايا HUVEC عن طريق الكشف عن المناعي.
   1. عقد تدفق وحقن 1.35 x 10⁸ كفو/ml عروض العروض-التعبير عن المكورات الرئوية في حجم الحد الأقصى من 1 مل في ecgms-متوسطه باستخدام منفذ الحقن. بدلا من ذلك ، ماصه البكتيريا في الوسط في خزان المضخة. أعاده تشغيل الضغط القص في 10 داين/سم² للسماح للبكتيريا تعميم داخل نظام المضخة.
   2. حدد الهدف الغمر النفط 63x للتكبير المجهر وضبط إعدادات فلتر مضان في برنامج المجهر لعروض القناات (540 nm الكشف فلتر) للكشف عن المكورات الرئوية التعبير عن عروض العطاءات.
   3. لتحديد الكمية من المرفقات البكتيرية لسلاسل VWF ، ووقف تدفق وإنشاء لقطات من Z-أكوام من ما لا يقل عن 30 وجات النظر الميدانية التمثيلية ، كل منها يحتوي علي ما يقرب من 10 السليمة شكليا HUVEC ، وحساب كميه المكورات الرئوية.
   4. استخدم خوارزميه الإحصائيات الاحاديه ANOVA لتقييم البيانات ، متبوعه باختبار عينه غير مزدوجة غير مقترنة لآخرين للمقارنة الاحصائيه المفصلة. واعتبرت قيم P البالغة < 0.05 ذات دلاله احصائيه.

6. التقييم المجهري للمرفقات البكتيرية لسلاسل VWF بعد تثبيت العينة

1. عينه التثبيت قبل تلطيخ المناعي.
   1. وقف تدفق ، وأزاله 10 مل من ECGMS-متوسطه من خزانات المضخة ، وأضافه 10 مل من تلفزيوني تستكمل مع بارافورمالدهيد 5 ٪ (PFA). السماح للحل PFA تعميم لمده 10 دقيقه في الإجهاد القص من 10 داين/سم².
   2. افصل شريحة القناة من وحده المضخة.
2. قم بحظر مواقع الربط غير المحددة علي سطح الخلية ونفذ التطعيم المناعي لسلاسل VWF والبكتيريا المرفقة.
   1. اعداد 4 مل من محلول الغسيل التي تحتوي علي 100 mM Na₂CO₃ (pH 9.2) تستكمل مع 4 ٪ السكروز لجميع خطوات الغسيل. اعداد 1 مل من حل منع التي تحتوي علي 100 mM Na₂CO₃ (pH 9.2) تستكمل مع 4 ٪ السكروز و 2 ٪ الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسنيين) لعرقله مواقع ملزمه غير محدده.
   2. اغسل الشريحة القناة المحتضنة 3x باستخدام حقنه Luer 1 مل لحقن 200 μL من محلول الغسيل واحتضان الشريحة لمده 120 دقيقه في RT مع 200 μL حجب الحل.
   3. اعداد 4 مل من آخر حل الحجب التي تحتوي علي 100 mM Na₂CO₃، (pH 9.2) تستكمل مع 4 ٪ السكروز و 0.5 ٪ بوسنيا لتخفيف الأجسام المضادة. استخدام 200 μL من هذا الحل حجب لتخفيف المكورات الرئوية الخاصة الأرنب انتيسيس# يروم 1:100. استخدام 200 μL من هذا الحل منع لتمييع الأجسام المضادة الماوس الخاصة VWF 1:50 لجعل تركيز الأجسام المضادة المحددة VWF من 4 ميكروغرام/مل. تمييع الأجسام المضادة AlexaFluor488-مترافق الثانوية من 2 mg/mL الأسهم الحل 1:100 في 200 μL من تلفزيوني (pH 7.4) لتوليد تركيز نهائي من 20 ميكروغرام/مل.
      ملاحظه: في الإعدادات المناعية الموصوفة ، حقق اكتشاف الأجسام المضادة نتائج مثلي عندما تم تخفيف الأجسام المضادة في المخزن المؤقت للكربونات القلوية المذكورة أعلاه. استنادا إلى النتائج السابقة ، والحلول الموصي بها حجب وكميه الأجسام المضادة هي مناسبه للعديد من التطبيقات. ومع ذلك ، قد تتطلب التجارب المختلفة التحسين الفردي لتركيبه الأجسام المضادة ، وتركيز الأجسام المضادة ، ووقت الحضانة ، ودستور الحاجز المانع. وكبديل لذلك ، قد يكون النظام المخزن بالفوسفات مع نطاق الحموضة المحايد مناسبا أو حتى مفضلا كمخزن مؤقت للحضانة. في حاله الإشارات الفلورية الضعيفة ، ينبغي زيادة تركيز الأجسام المضادة الثانوية. إذا تم الكشف عن الكثير من الضوضاء غير محدده مضان الخلفية ، يجب زيادة كميه المواد المانعة.
   4. لتلطيخ VWF-المناعي ، وغسل الشريحة قناه باستخدام 1 مل حقنه Luer عن طريق حقن 200 μL من الحل الغسيل 3x واحتضان الشريحة مع الأجسام المضادة المخففة 1:50 المحددة VWF لمده 30 دقيقه في RT. بعد ذلك ، اغسل الشريحة القناة مره أخرى 3x مع 200 μL من محلول الغسيل واحتضان الشريحة مع 1:100 المخفف الجسم المضادة للماوس AlexaFluor488-مترافق الخاصة لمده 30 دقيقه في RT. وأخيرا ، اغسل الشريحة القناة مره أخرى 3x مع 200 μL من محلول الغسيل.
      ملاحظه: اليكسافلور-فلوبوهورس حساسة لتبيض. ولذلك ، يجب حماية الشريحة بالاحتفاظ بها في غرفه مظلمة اثناء خطوات الحضانة مع الأجسام المضادة المترافقة مع الفلوكوفيري.
   5. لتطعيم المكورات الرئوية ، احتضان الشريحة مع 1:100 الجسم الهوائية المخففة الرئوية الخاصة الأرانب لمده 30 دقيقه في RT. بعد ذلك ، وغسل الشريحة قناه 3x مع 200 μL من محلول الغسيل واحتضان الشريحة مع 1:100 المخفف AlexaFluor568-الأجسام المضادة الخاصة بالأرانب لمده 30 دقيقه في RT. اغسل الشريحة القناة مره أخرى 3x مع 200 μL من محلول الغسيل.
   6. لوصمه الخلايا الخلوية مع فلوفيسين الفلورسنت ، يتخلل HUVEC بالحضانة مع 120 μL من 0.1 ٪ تريتون X-100 لمده 5 دقائق في RT. اغسل الشريحة القناة 3x مع 200 μL من محلول الغسيل واحتضان الشريحة مع 120 μL من 1:1000 المخفف AlexaFluor350-المترافقة phسبائك. وهذه الخطوة حضانة تصور بلمره الاكتين خلوي والسماح برصد شكل الخلية والتغييرات المورفولوجية الناجمة عن الإجهاد المحتملة.
   7. اغسل شريحة القناة 3x مع 200 μL من محلول الغسيل. وأخيرا ، اغسل الشريحة 4x مع 200 μl ddh₂O وتصور السلاسل الفلورية الخضراء vwf ، والبكتيريا الفلورية الحمراء ، والأزرق الفلورسنت الاكتين خلوي باستخدام إعدادات التصفية المناسبة علي المجهر مضان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الزراعة الاوليه huvec في تدفق أحادي الاتجاه الثابت يؤدي في تشكيل متموج ومعباه باحكام طبقه الخلية التي تروج لتوليد الشبكات الخلوية مليئه vwf الميكانيكية^13،14. يصف هذا البروتوكول استخدام مضخة ضغط الهواء ، ونظام أعاده تدوير نبض لتحليل العدوى التي تتطلب محاكاة الو?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

محاكاة التفاعل البكتيري مع البروتينات المضيفة الميكانيكية مثل VWF يتطلب نظام ثقافة الخلية القابلة للاستخدام التي تمكن جيل من تدفق محدده ، أحاديه الاتجاه ، ومستمر من السوائل ، التالي توليد الإجهاد القص موثوق بها . وقد تم بالفعل وصف عده أنظمه ضخ ميكروفلويدريك. ويلخص استعراض شامل من Bergmann وآخر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-syringe	Fisher Scientific	10303002	with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe	Sarstedt	9077136	For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase	eBioscience now thermo fisher	00-4555-56	protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin	Abcam	ab176751	no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody	Thermo Fisher Sientific	A11001	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11011	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-25G	solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter	TPP	90026	subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R	Beckman Coulter Life Sciences	392304	spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK	Hermle	305.00 V05 - Z 216 M	spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing	ibidi	10821	for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator	Fisher Scientific	MIDI 40	incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-Incubator	Sanyo	MCO-18 AIC	for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar plates	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer	Dell	Latitude 3440	Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)	Leica	DMi8	An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3904.1	used for PBS buffer
Drying material	Merck	101969	orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix	Promocell	C-39215	supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMS	Promocell	C-22010	ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)	Promocell	C-22010	culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)	biochrome now Merck	S 0415	supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody	Abcam	ab8822	stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit	ibidi	10903	fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)	Sigma Aldrich	G-1890-100g	for precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochloride	Sigma Aldrich	H-7250-10MG	for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)	Promocell	C-12203 Lot-Nr. 396Z042	primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)	Santa Cruz	sc73268	stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port	ibidi	10820	for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope	Zeiss	Axiovert 35M	inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)	ibidi	80176	physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)	Sigma Aldrich	M7506-500G	For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump	ibidi	10905	air pressure pump
Neubauer cell counting chamber	Karl Hecht GmbH&Co KG	40442002	microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710-S	for cross linking of samples
Perfusion Set	ibidi	10964	Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)			the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes	Sarstedt	67,741	(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum	Pineda		raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate			this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	6781.1	used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)	ibidi	v1.5.4	Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mL	Sarstedt	72.706/ 72.695.500	required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volume	Sarstedt	6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci	National Collection of Type Cultures, Public Health England	10,319	Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mL	Sarstedt	86.1253.025/ 86.1254.025	for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)	Sigma Aldrich	451614-25G	for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	P030.2	used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22	Biochrom	80-2115-20	measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G	for preparation of blocking buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-500ML	Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract	oxoid	LP0021	bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY