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要約

本研究では、定義された流路条件におけるせん断応力下で分化したヒト一次内皮細胞の表面上で産生されるフォン・ヴィレブランド因子ストリングに対する肺炎球菌の視認性の顕微鏡的モニタリングについて述べている。このプロトコルは、微分免疫染色手順を適用することにより、特定の細胞構造の詳細な可視化および細菌の定量に拡張することができる。

要約

肺炎レンサ球菌と内皮細胞の表面との相互作用は、フォン・ヴィレブランド因子(VWF)などのメカノ感受性タンパク質を介して血流中に媒介される。この糖タンパク質は、せん断応力に応答して分子立体構造を変化させ、それによって宿主リガンド相互作用の広いスペクトルの結合部位を露出させる。一般に、定義されたせん断流の下で一次内皮細胞の培養は、血管の内層の生理学に似た安定で密接に連結された内皮層の形成と特異的な細胞分化を促進することが知られている.したがって、メカノ感受性タンパク質を含む細菌病原体と宿主血管系との相互作用の機能解析には、界面に影響を及ぼすことが知られている生理学的流動力をシミュレートできるポンプシステムの確立が必要である。血管細胞。

本研究で用いられるマイクロ流体デバイスは、定義された流量で流体の連続的かつパルスレスな再循環を可能にする。コンピュータ制御の空気圧ポンプシステムは、連続的、単方向、制御された媒体流れを生成することにより、内皮セル表面に定義されたせん断応力を適用します。細胞および細菌結合の形態学的変化は顕微鏡的視覚化のために設計されている特別なチャネルスライドを使用して流れの顕微鏡的に監視され、定量することができる。一般に、免疫標識と顕微鏡分析の前にサンプル固定を必要とする静的細胞培養感染とは対照的に、マイクロ流体スライドは、タンパク質、細菌、および細胞成分の蛍光ベースの検出の両方を可能にするサンプル固定後;連続免疫蛍光染色;リアルタイムで直接蛍光ベースの検出を行います。蛍光細菌および特異的蛍光標識抗体と組み合わせることで、この感染手順は、血管プロセスに関連する科学的応用の巨大なスペクトルのための効率的な多成分可視化システムを提供します。

概要

肺炎球菌感染症の病因は、プラスミノーゲンおよびVWF1、2などのヒト止血症の細胞外マトリックス化合物および成分の多様性との多面的相互作用によって特徴付けられます。3,4,5,6,7,8.マルチドメイン糖タンパク質VWFは、血管血栓形成9の部位における血栓細胞リクルートおよびフィブリンの組み込みを媒食することにより、バランスのとれた止血症の主要な調節体として機能する。出血制御および創傷治癒のための機能的、活性VWFの重要性は、フォン・ヴィレブランド病、一般的な遺伝性出血性疾患10によって実証される。

球状VWFは、最大14.0μg/mL11、10の濃度でヒト血液系を循環する。血管損傷に対して、内皮ワイベルパレードボディ(WBP)によるVWFの局所放出は著しく増加する11、12である。これまでの研究では、肺炎球菌がヒト内皮細胞に付着し、細孔形成毒素肺炎の産生が発光VWF分泌13を有意に刺激することが示されている。血流の流体力学的力は、メカノレスポンシブVWFドメインの構造開口部を誘導する。10 dyn/cmの流量で、VWFは、サブ子宮皮10、12に取り付けられたままの長さ数百マイクロメートルまでの長いタンパク質ストリングに多量化する。

肺炎球菌と内皮表面との相互作用においてせん断応力下で発生する多量体化VWF弦の機能を理解するために、マイクロ流体ベースの細胞培養感染アプローチが確立された。ソフトウェア制御空気圧ポンプシステムを備えたマイクロ流体装置を使用した。これにより、定義された流量を有する細胞培養培地の連続的な単方向再循環が可能にされた。それによって、システムは、特殊なチャネルスライド内に取り付けられたままの内皮細胞の表面に定義されたせん断応力を適用した。このアプローチにより、定義された一定の流れ条件下で分化した内皮細胞にVWF弦が生成される、ヒト血管系の血流中のせん断力のシミュレーションが可能となった。この目的のために、内皮細胞を特定のチャネルスライドで培養した(材料表参照)。マイクロ流体ポンプシステムは、コンフルエント内皮細胞層上の拡張VWF弦の形成に必要な高度に定義され、制御されたせん断応力状況を提供しました。ヒスタミン補充によりヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を収縮的に増殖させたヒト臍静脈内皮細胞のVWF分泌の刺激後、弦形成は10dyn/cm2のせん断応力(・△)を加えることによって誘導された。せん断応力は、細胞層に作用する力として定義されます。コーニッシュetに従って計算される。al.14方程式 1:
figure-introduction-1740

ここで、dyn/cm2のせん断応力、ε = 粘度(dyn∙s)/cm2、h= チャネル高さの半分、w = チャネル幅の半分、および Φ = 流量 (mL/min) です。

方程式 1 の結果は、使用するさまざまなスライドの高さと幅によって異なります (「材料表」を参照)。本研究では、0.4μmのルアーチャンネルスライドを用い、チャンバースライド係数131.6を用いた(式2参照)。
figure-introduction-2118

37°Cでの媒体の粘度は0.0072 dyn∙s/cm²であり、10dyn/cm²のせん断応力を使用した。その結果、流量は10.5mL/分になります(式3を参照)。
figure-introduction-2300

ここで、宿主血管系における細菌感染機構の調査及び可視化のための単方向層流システムを用いた微小流体細胞培養手順の適応及び進歩について詳細に説明する。内皮層上のVWF弦の生成は、連続的で安定したせん断応力15を適用することができる他のポンプシステムを使用することによって刺激することができる。

VWF弦形成の流れと刺激に合流する一次内皮細胞の培養後、赤色蛍光タンパク質(RFP)16を発現する肺炎球菌16を、一定の顕微鏡制御下で内皮細胞層に添加した。内皮細胞表面のVWF弦への細菌の付着は、VWF特異的蛍光標識抗体を用いて顕微鏡的に可視化し、最大3時間リアルタイムで監視した。このアプローチにより、血管内皮への細菌付着を促進する接着補因子としてのVWFの役割が8と判定された。

タンパク質分泌と立体構造変化の顕微鏡的可視化に加えて、この方法は、細菌感染プロセスの単一ステップをリアルタイムで監視し、異なる時点での付着菌の量を定量化するために使用することができる感染。特定のソフトウェア制御ポンプシステムはまた、内皮細胞を定義された一定の流れ条件で数日間培養する可能性を提供し、定義されたパルス媒体フローインキュベーションを可能にする。さらに、このメソッドは、異なるセルタイプを使用して適用することができます。染色プロトコルを適応させることは、真核細胞に内部化された細菌の検出および可視化も可能にする。

この原稿では、病態生理学的プロセスの効率的かつ汎用的な特性評価のための定義された、信頼性が高く、再現可能なアプローチとして使用できるこの高度な実験プロトコルについて説明します。

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プロトコル

マイクロ流体細胞培養は、市販の原発性ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)で行った。同社は、ドナーのインフォームド・コンセントで細胞を分離した。この研究は、参照番号219-04で連邦州バーデン・ヴュルテンベルク州医師会の倫理委員会によって承認されました。

注:プロトコル供給については、材料表を参照してください。

1. 原発性内皮細胞の事前培養

  1. 37°Cで3つの異なるドナーから1 x 105一次HUVECを含む凍結グリセロールバイアルを解凍し、25cm2細胞フラスコで前温内皮細胞増殖培地(ECGM、サプリメントで使用する準備ができている)の7mLで細胞を播種する。
    注:一次内皮細胞は、5回以上の増殖サイクルの後に分化能力を失う。したがって、高いグレードの細胞分化が必要な場合は、5箇所未満の細胞のみを使用できます。
  2. 細胞を5%CO2雰囲気中37°Cで60分間培養し、表面付着を可能にし、ECGM細胞培養培地を交換して凍結保存から残留物を取り除きます。
  3. 5%CO2雰囲気中の37°Cで細胞を培養し続け、サブコンフルエント細胞層を形成します。
    注:HUVECは、タイトな細胞間接触が後の流れの安定な細胞層の形成を防ぐので、コンフルエント層に成長してはならない。

2.肺炎レンサ球菌の事前培養

注意:肺炎レンサ球菌は、バイオセーフティレベル2剤であり、バイオセーフティレベル2の実験室でのみ培養することが許可されています。すべての細菌治療の安全レベル2に分類されたクリーンベンチを使用し、エアロゾル形成を厳密に避け、細菌の沈沈沈下のためのエアロゾル保護付き遠心分離機を使用してください。

  1. 常に-80°Cで保存されているグリセロールストックに由来する肺炎球菌臨床単離体ATCC11733を有するコロンビア血液寒天板を接種し、37°Cおよび5%CO2で一晩寒天プレートを栽培する。
  2. 1%酵母エキス(THY)と15mLの無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.4を補充したトッドヒューイット液体ブロスを40mL調製し、細菌の培養および洗浄工程を行います。
  3. 細菌の培養には滅菌チューブを使用し、液体培養液を細菌塊で接種します。非接種液体ブロスに対する600nmでの1mLアリコートのフォトメトリック測定により接種量を制御する。0.15の600 nm(OD600)で光学密度に達するまで、液体スープに細菌塊を充填します。
  4. 接種した液体スープを37°Cと5%CO2で振らずにインキュベートし、プラスチックキュベットを用いて1mLアリコートを測定して30分毎にOD600を測定します。
  5. 細菌培養が指数成長期に相当する0.4のOD600に達するとすぐに、細菌培養懸濁液を室温で1,000 x gで10分間遠心分離する(RT)。
    注:肺炎球菌培養が1.0を超えるOD600に達することは許さないでください。
  6. 細菌堆積物を10mL PBSで穏やかに再懸濁し、RTで1,000 x gで10分間再び堆積物を再び取り出します。
  7. 洗浄した細菌堆積物を1mL PBSに穏やかに再懸濁し、1mLのPBSを基準にして10μLの細菌懸濁液のOD600を決定する。
  8. PBSの細菌の量を2.0のOD600に調整します。以前に決定された細菌計数によれば、2.0のOD600は2x109コロニー形成単位(CFU)に相当する。細菌の自己分析を防ぐために、直ちに感染手順を進めます。

3. 微流流体条件下におけるHUVECの内皮細胞培養

  1. 制御されたタンパク質分解によって細胞培養フラスコから一次内皮細胞を剥離する。クリーンベンチを使用して、滅菌環境で以下の手順を実行します。洗浄工程用に滅菌PBSの15mLの容積を準備する。
    1. 亜流暢に成長したHUVEC層からECGMを取り出し、血清学的ピペットを使用して10 mL PBSで細胞層を洗浄し、細胞培養培地を取り除きます。
    2. 37°Cの前温細胞解離溶液を37°Cの3mLで洗浄したHUVECをインキュベートし、37°Cで5分間の細胞剥離を行います。毎分顕微鏡的モニタリングによりタンパク質分解細胞剥離を観察します。
    3. 離れた細胞懸濁液を、2%胎児子牛血清(FCS)を補充したECGMの7mLを含むチューブにピペットし、RTで220 x gで細胞を3分間停止させた。
    4. 上清を取り外し、5% FCS と 1 mM MgSO4を補充した ECGM の 250 μL で HUVEC を再中断します。ノイバウアー細胞計数チャンバーを使用して細胞カウントのための細胞懸濁液の10μLを使用し、5%FCSおよび1 mM MgSO4を補完する4 x 106細胞/mL ECGMに細胞数を調整する。
      注:各流れ実験のために5%FCSおよび1 mM MgSO4を添加したECGM培地の30 mLが必要となる。ここからこの培地組成物はECGMS-mediumと名付けられています。培養培地中のFCS濃度の2%から5%の増加は、チャネルスライドに播種されたHUVECの細胞結合および細胞生存率を支持する。培地は、FCSおよびMgSO4をサプリメントし、せん断応力条件下でHUVECの細胞結合を実質的に安定化させる。
  2. チャネルスライドでHUVECを種子し、栽培する。きれいなベンチを使用して無菌環境で働く。細胞はせん断ストレス下で2日間培養され、続いて細菌への感染と顕微鏡モニタリングがさらに2時間続く。
    1. チャンネルスライド、直径1.6mm、長さ50cmの灌流セット、ECGMS-培地のアリコート、高さ0.4μmのルアーチャンネルスライドを、37°Cで5%CO2雰囲気のインキュベーターで24時間、気泡の数を減らします。
      注:この手順は、プラスチック装置を脱気し、媒体、灌流管、および貯蔵所を前温することをお勧めします。材料や液体がRTまたは冷蔵庫に保存されている場合、実験中にインキュベーターで加熱すると、プラスチックや液体に溶解したガスが放出されます。その後、ガスバブルが表示されます。実験の前にすべてのプラスチック部品を脱気すると、この効果が排除されます。システムがインキュベーターから取り出されるたびに、ガス吸収のプロセスが再び開始されます。したがって、RTで迅速に動作し、より長い期間、インキュベーターの外に流体ユニットを残すことはありません。
    2. ピペットを使用して、2%滅菌濾過したブタゼラチン溶液の100°LをPBS溶液に、温度平衡化されたチャネルスライドの1つの貯蔵所に注入します。ゼラチン溶液を37°Cで1時間インキュベートし、1 mLルアーシリンジを用いて滅菌条件下でスライドのチャネルを1mL PBSでリンスする。
    3. ゼラチンコーティングされたチャネルスライドを薄いポリスチレンまたは発泡スチロールプレートの上に置き、スライド温度の低下を防ぎます。スライドに1 mLルアーシリンジを使用して、4 x 106/mL HUVECサスペンションの100°Lを追加します。
      注:クリーンベンチの冷たい金属表面にチャネルスライドを配置すると、スライド底部の温度が低下し、それによって内皮細胞に冷たい応力を発生させる可能性がある。セルピペット中は、気泡が上昇し、スライドの内側から消えるように、スライドを少し上に保持します。
    4. 37°Cと5%CO2で60分間HUVECでチャンネルスライドをインキュベートし、チャンネルスライドの両端にある培地貯留層をそれぞれ60μL ECGMS-mediumで埋めます。37°Cで1時間、CO2を5%でインキュベートします。
  3. マイクロ流体ポンプとソフトウェア設定を調整します。
    1. 平衡灌流セットをポンプユニットに接続し、13.6 mLのECGMS-mediumを充填し、ポンプ制御ソフトウェアを起動します。設定した流体ユニットのメニューのスクロールダウンウィンドウを使用して、適切な灌流セットとチャンバースライドのタイプを選択します。中粘度のソフトウェアで 0.007 (dyn∙s/cm2)を選択します。(補足図 1の赤い矢印が付いた圧力ポンプ ソフトウェアの設定を参照してください)。
    2. インキュベーターの外側で、乾燥シリカビーズで満たされたガラス瓶を空気圧チューブに接続します(図1、差し込み3を参照)。圧力ポンプの空気は灌流貯蔵所とポンプの間を循環し、ポンプ装置に再入る前に乾燥しなければならない。ソフトウェアメニューで「フローパラメータ」を選択し、圧力を40 mbarに設定し、連続中流を開始して液体媒体でポンプチューブをフラッシュします。(これらの設定は、補足図 1の赤い矢印で示されています)。
    3. 流れ栽培の所望のせん断応力サイクルをプログラムします。5 dyn/cm2で始まり、バランスのとれた貯水池ポンプを制御し、ポンプシステムで気泡が循環していないことを保証します。
      注:チャネル スライドの壁せん断応力は、灌流媒体の流量と粘度によって異なります。別のポンプシステムを使用する場合は、目的のせん断応力レベルを生成する流量を設定するために、序文で説明されている方程式を参照してください。説明した設定は、5.42 mL/minの流量に対応しています(圧力ポンプソフトウェアにおける適切なフローパラメータ設定を示す例示的なスクリーンショットを補足図2に示します)。
    4. ポンプ制御ソフトウェアの流れの循環を停止し、Luer 接続の近くにチューブをクランプして、灌流チューブ内の媒体流れを保持します。チャンネルスライドを接続し、気泡を回避し、37°Cおよび5%CO2のCO2インキュベーターに接続されたチャンネルスライドで流体ユニットを配置します。せん断応力を 5 dyn/cm2で 30 分間開始し、せん断応力レベルを加速する前に、せん断応力によって生成される力に細胞をスムーズに適応させます(補足図 3を参照)。
      注:流れの中の気泡の動きは細胞剥離につながる可能性があるため、チューブシステムまたはチューブシステムに接続した後、気泡がチューブシステムまたはスライドに残らないことを注意してください。
    5. せん断応力を10 dyn/cm2(この流れの設定では10.86 mL/minに対応)まで加速し、37°Cと5%CO2の小さなCO2インキュベーターで48時間連続せん断応力でチャンネルスライドをインキュベートし、細胞分化を可能にします(各ソフトウェア settinng は、補足図 4に赤い矢印で示されています。
      注:HUVEC細胞は、流れの培養が10 dyn/cm2で直接開始された場合、チャネル表面から剥離する傾向がある。5 dyn/cm2を最低 30 分間使用して少ないせん断応力で流れの培養を開始し、その後せん断応力を所望の 10 dyn/cm2までゆっくりと増加させた場合、細胞はチャンバー表面に付着したままになります。10 dyn/cm2のせん断応力は、VWF 弦形成に必要なこの灌流設定の最小値です。
    6. マイクロ流体細胞培養の24時間後、両方の中層でバランスの取れた中レベルに達したときにポンプ制御ソフトウェアで中流を停止します。流体ユニットをクリーンベンチに入れ、10 mLの血清学的ピペットを使用して、灌流貯留層の循環栽培媒体の10 mLを除去します。10 mL の ECGMS-培地を貯蔵所に追加して培地を更新し、流体ユニットを 37 °C および 5% CO2の CO2インキュベーターに戻し、ポンプ制御ソフトウェアを使用して流体栽培を再開します。
      注:圧力ポンプの機能は、大きな遠心分離機などの実験機によって突然破壊され、強い磁場障害を引き起こす可能性があります。この突然の中断は、セルの剥離につながる可能性があります。このような機械は、実験中に圧力ポンプの近くでアクティブでないことを注意してください。
    7. 蛍光顕微鏡の段階を覆う温度インキュベーションチャンバの前温を37°Cに開始し、顕微鏡可視化の前に温度平衡24時間を図示する。顕微鏡を前もって温めた後、顕微鏡ソフトウェア制御を開始し、適切なフィルタ設定(RFP発現細菌の検出用540 nm/590 nm)を選択することにより、蛍光顕微鏡モニタリングの主な設定を調整し、FITC共役VWF特異的抗体のフルオレセイン放出を検出するための470 nm/515 nm)。37°で流体ユニットのインキュベーションのための追加の加熱室を前温する。
      注:感染解析およびマイクロスコピックモニタリング中にチャネルスライドおよび循環媒体の温度は、細胞に冷たいストレスを発生させるので、実質的に減少してはならない。一般に、顕微鏡段階を覆う温度室の大きさは、流体ユニット全体をカバーするのに十分ではない。したがって、37°Cに前温された追加の加熱室の使用をお勧めします。
    8. 顕微鏡的可視化のために、流体ユニットを37°予備加熱室に入れ、37°予備顕微鏡のステージにチャネルスライドを配置します。
      注:顕微鏡的可視化のために、流体ユニットとチャネルスライドは、灌流チューブの長さが限られているため、CO2インキュベーターから除去する必要がありました。pH緩衝のために5%CO2雰囲気外で感染時間と顕微鏡モニタリングが必要な場合は、マイクロ流体培養にpH緩衝培地を使用する必要があります。
    9. ヒスタミンと細菌を流れの循環に注入する前、および顕微鏡の明視野モードを使用して流れ実験を終了した後、細胞形態およびHUVEC層の完全性を制御する。

4. VWF放出の誘導とマルチメル化VWF弦の可視化

  1. VWFのマルチマー化を最大200MDaの長い弦にトリガするには、10 dyn/cm2のせん断応力が必要なため、フロー設定を維持します。注射ポートを用いて灌流浴中の循環するECGMS培地に100mMヒスタミン原液の136μLを注入することにより、内皮WPBからのVWFの放出を誘導する。流れ媒体中のヒスタミンの最終濃度は1mMとなる。注入ポートが利用できない場合は、ポンプ貯蔵所の媒体にピペットを入れてヒスタミンを追加することができます。
  2. 多層VWF弦の免疫蛍光検出では、貯水池内のバランスの取れた媒体レベルに達したときに流れを止め、VWF特異的FITC共役抗体の20μgを200μL PBS(pH 7.4)の体積で循環13.6mLに注入する。注入ポートを使用したECGMS-培地。注入ポートが利用できない場合は、ポンプ貯蔵所の媒体にピペットをすることで抗体を追加することができます。これにより、最終的な抗体濃度は1.3μg/mLになります。
  3. 短時間で複数の視野の顕微鏡的走査を行う場合は、キセノン蛍光装置を30%パワーで顕微鏡の蛍光単位とエピ蛍光カメラで使用します。明視野モードでHUVEC層の形状と形態を監視し、VWFストリングの可視化に適した代表的な細胞を選択します。
  4. 緑色蛍光VWF弦の可視化には、顕微鏡ソフトウェア(LasX)の蛍光ユニットメニューで63x/1.40オイル目的と470nm検出フィルタを選択します。少なくとも 50 個の代表的なフィールド ビューの Z スタックのスナップショットを作成し、それぞれに約 10 個の形態学的に無傷の HUVEC を含みます。異なる時点で緑色蛍光 VWF 弦を定量化するには、複数の視野をスキャンします。

5. リアルタイムフローにおけるVWFストリングへの細菌結合の顕微鏡的評価

  1. 免疫蛍光検出を介してHUVEC細胞表面上で生成されるVWFストリングへの肺炎球菌結合を定量化する。
    1. フローを保持し、注入ポートを使用して、最大容積 1 mL の 1 mL で 1.35 x 108 CFU/mL RFP 発現肺炎球菌を注入します。あるいは、ポンプ貯蔵所内の培地に細菌をピペットする。10 dyn/cm2でせん断応力を再始動し、細菌がポンプシステム内を循環するようにします。
    2. 顕微鏡の倍率に関する63倍のオイル浸漬目標を選択し、RFP発現肺炎球菌を検出するために、顕微鏡ソフトウェアの蛍光フィルタ設定をRFPチャネル(540 nm検出フィルタ)に調整します。
    3. VWF文字列への細菌結合を定量化するには、フローを停止し、少なくとも30の代表的なフィールドビューのZスタックのスナップショットを作成し、それぞれに約10の形態学的に無傷のHUVECを含み、肺炎球菌の量をカウントします。
    4. ANOVA一階平均統計アルゴリズムを使用してデータを評価し、続いて詳細な統計比較のためにポストホックの両側の対になっていないサンプル検定を使用します。<0.05 の P 値は統計的に有意と見なされました。

6. サンプル固定後のVWFストリングへの細菌結合の顕微鏡的評価

  1. 免疫蛍光染色の前に固定をサンプルします。
    1. 流れを止め、ポンプ貯蔵所から10mLのECGMS培地を取り出し、5%パラホルムアルデヒド(PFA)を添加して10mLのPBSを加えます。PFA溶液を10 dyn/cm2のせん断応力で10分間循環させます。
    2. チャンネルスライドをポンプユニットから取り外します。
  2. 細胞表面上の非特異的結合部位をブロックし、VWF弦および付着細菌の免疫検出を行う。
    1. 100 mM Na2CO3(pH 9.2)を含む洗浄液を4mL調製し、すべての洗浄工程に4%スクロースを補充します。100 mM Na2CO3(pH 9.2)を含むブロッキング溶液を1mL調製し、非特異的結合部位のブロッキングのために4%スクロースと2%ウシ血清アルブミン(BSA)を補充した。
    2. 1 mLルアーシリンジを使用してPFAインキュベートチャンネルスライド3xを洗浄し、洗浄液の200°Lを注入し、200μLブロッキング溶液を用いてRTで120分間スライドをインキュベートします。
    3. 抗体の希釈のために4%スクロースと0.5%BSAを補充した100 mM Na2CO3を含む別のブロッキング溶液の4mLを調製する。このブロッキング溶液の200°Lを使用して、肺炎球菌特異的ウサギ抗血清1:100を希釈します。このブロッキング溶液の200 μLを使用して、VWF特異的マウス抗体を1:50希釈し、VWF特異的抗体濃度を4μg/mLにします。2mg/mLのストック溶液1:100から2mg/mLの二次抗体を200μL(pH 7.4)で希釈し、最終濃度20μg/mLを生成します。
      注:前述の免疫蛍光設定において、抗体を上記アルカリ炭酸塩緩衝液で希釈した場合に最適な結果を得た抗体検出が得られた。以前の結果に基づいて、推奨されるブロッキング溶液および抗体の量は多くの適用に適している。しかしながら、異なる実験は、抗体の組み合わせ、抗体濃度、インキュベーション時間、およびブロッキングバッファーの構成の個々の最適化を必要とし得る。代替として、中性pH範囲を有するリン酸緩衝系は、インキュベーション緩衝液として適しているか、あるいは好ましいかもしれない。蛍光シグナルが弱い場合は、二次抗体の濃度を高める必要があります。あまりにも多くの非特異的蛍光バックグラウンドノイズが検出された場合は、ブロッキング物質の量を増やす必要があります。
    4. VWF免疫蛍光染色の場合、洗浄液3xの200°Lを注入して1mLルアーシリンジを使用してチャネルスライドを洗浄し、RTで1:50希釈VWF特異的抗体を1:50でスライドにインキュベートし、その後、200で3倍に再びチャンネルスライドを洗浄します。洗浄液のμLを1:100希釈したAlexaFluor488-共役マウス特異的抗体をRTで30分間インキュベートした。最後に、200°Lの洗浄液でチャンネルスライドを3倍に再び洗浄します。
      注:アレクサフルオフルオロフォアは漂白に敏感です。したがって、スライドは、フルオロフォア共役抗体とのインキュベーションステップ中に暗いチャンバーに保持することによって保護されるべきである。
    5. 肺炎球菌の免疫検出のために、RTで1:100希釈した肺炎球菌特異的ウサギ抗体でスライドを30分間インキュベートし、その後、200°Lの洗浄液でチャネルスライド3xを洗浄し、1:100希釈してスライドをインキュベートするAlexaFluor568-共役ウサギ特異的抗体をRTで30分間洗浄し、200μLの洗浄液でチャンネルスライドを再度3倍洗浄します。
    6. 蛍光ファロイジンで細胞アクチン細胞骨格を染色するには、RTで120°LのトリトンX-100を5分間インキュベートしてHUVECを透過し、200μLの洗浄液でチャンネルスライド3xを洗浄し、120°Lでスライドをインキュベートします。アレクサフルオル350共役ファロイジン。このインキュベーションステップは、重合アクチン細胞骨格を可視化し、細胞形状およびストレス誘発形態変化のモニタリングを可能にする。
    7. 200°Lの洗浄液でチャンネルスライド3xを洗浄します。最後に、スライド4xを200μLddH2Oで洗浄し、蛍光顕微鏡上の適切なフィルター設定を用いて緑色蛍光VWF弦、赤色蛍光細菌、青色蛍光アクチン細胞骨格を可視化します。

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結果

一定の単方向流路で一次HUVECを培養すると、メカノ感受性VWF13、14で満たされた細胞WBの生成を促進するコンフルエントで密集した細胞層の形成をもたらす。このプロトコルは、人間の血流におけるせん断応力状況を模倣する必要がある感染解析のための空気圧ポンプベースのパルスレス再循環システムの使用を記述する。

この?...

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ディスカッション

VWFのようなメカノ感受性宿主タンパク質との細菌相互作用のシミュレーションは、定義された、単方向、および液体の連続的な流れの生成を可能にする含水性細胞培養システムを必要とし、それによって信頼できるせん断応力を発生させる.いくつかのマイクロ流体ポンプシステムがすでに説明されている。Bergmannらからの包括的なレビューは、異なる2次元および三次元細胞培養...

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開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

このプロジェクトはDFG(BE 4570/4-1)からS.Bに資金提供されました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-syringeFisher Scientific10303002with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringeSarstedt9077136For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
AccutaseeBioscience now thermo fisher00-4555-56protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated PhalloidinAbcamab176751no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibodyThermo Fisher SientificA11001stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibodyThermo Fisher ScientificA-11011stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-BrothBecton Dickinson GmbHBD 249210complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-25Gsolubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filterTPP90026subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12RBeckman Coulter Life Sciences392304spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30Beckman Coulter Life SciencesB06314spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MKHermle305.00 V05 - Z 216 Mspinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
ChloramphenicolCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3886.2used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubingibidi10821for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-IncubatorFisher ScientificMIDI 40incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-IncubatorSanyoMCO-18 AICfor incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar platesBecton Dickinson GmbHPA-254005.06agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
ComputerDellLatitude 3440Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)LeicaDMi8An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3904.1used for PBS buffer
Drying materialMerck101969orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement MixPromocellC-39215supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMSPromocellC-22010ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)PromocellC-22010culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)biochrome now MerckS 0415supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibodyAbcamab8822stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unitibidi10903fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG-1890-100gfor precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochlorideSigma AldrichH-7250-10MGfor induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)PromocellC-12203 Lot-Nr. 396Z042primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)Santa Cruzsc73268stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Portibidi10820for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscopeZeissAxiovert 35Minverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)ibidi80176physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)Sigma AldrichM7506-500GFor preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pumpibidi10905air pressure pump
Neubauer cell counting chamberKarl Hecht GmbH&Co KG40442002microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)Electron Microscopy Sciences15710-Sfor cross linking of samples
Perfusion Setibidi10964Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettesSarstedt67,741(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserumPinedaraised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam platethis is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe6781.1used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)ibidiv1.5.4Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mLSarstedt72.706/ 72.695.500required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volumeSarstedt6,25,48,004
RFP-expressing pneumococciNational Collection of Type Cultures, Public Health England10,319Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mLSarstedt86.1253.025/ 86.1254.025for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)Sigma Aldrich451614-25Gfor preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, KarlsruheP030.2used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22Biochrom80-2115-20measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
SucroseSigma AldrichS0389-500Gfor preparation of blocking buffer
Triton X-100Sigma AldrichT9284-500MLUsed in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extractoxoidLP0021bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY

参考文献

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