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Resumo

Este estudo descreve o monitoramento microscópico da adesão pneumococcus às cordas do fator von Willebrand produzidas na superfície de células endotélias primárias humanas diferenciadas estresse de cisalhamento em condições de fluxo definidas. Este protocolo pode ser estendido à visualização detalhada de estruturas celulares específicas e quantificação de bactérias aplicando procedimentos diferenciais de imunocoloração.

Resumo

A interação de Streptococcus pneumoniae com a superfície das células endotélias é mediada no fluxo sanguíneo através de proteínas mecanosensíveis, como o Fator Von Willebrand (VWF). Esta glicoproteína muda sua conformação molecular em resposta ao estresse de cisalhamento, expondo assim locais de ligação para um amplo espectro de interações hospedeiro-ligand. Em geral, o cultivo de células endotélias primárias um fluxo de cisalhamento definido é conhecido por promover a diferenciação celular específica e a formação de uma camada endotelial estável e rigidamente ligada que se assemelha à fisiologia do revestimento interno de um vaso sanguíneo . Assim, a análise funcional das interações entre patógenos bacterianos e a vasculatura hospedeira envolvendo proteínas mecanosensíveis requer o estabelecimento de sistemas de bomba que possam simular as forças fisiológicas de fluxo conhecidas por afetar a superfície de células vasculares.

O dispositivo microfluídico usado neste estudo permite uma recirculação contínua e sem pulso de fluidos com uma taxa de fluxo definida. O sistema controlado por computador bomba de pressão do ar aplica um estresse tesoura definida em superfícies de células endoteliis, gerando um fluxo contínuo, unidirecional e controlado médio. As mudanças morfológicas das células e o acessório bacteriano podem ser monitoradas microscópicas e quantificadas no fluxo usando slides especiais de canal projetados para visualização microscópica. Em contraste com a infecção da cultura celular estática, que em geral requer uma fixação da amostra antes da rotulagem imunológica e análises microscópicas, as lâminas microfluídicas permitem a detecção baseada em fluorescência de proteínas, bactérias e componentes celulares após a fixação da amostra; coloração de imunofluorescência em série; e detecção direta baseada em fluorescência em tempo real. Em combinação com bactérias fluorescentes e anticorpos específicos rotulados por fluorescência, este procedimento de infecção fornece um sistema de visualização de componentes múltiplos eficiente para um enorme espectro de aplicações científicas relacionadas a processos vasculares.

Introdução

A patogênese das infecções pneumocócicas é caracterizada por uma interação multifacetada com uma diversidade de compostos de matriz extracelular e componentes da hemostase humana, como plasminogênio e VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. O multidomínio glicoproteína VWF serve como regulador-chave de uma hemostasis equilibrada, mediando recrutamento trombocito e incorporação de fibrina no local da formação de trombosvascular9. A importância do VWF funcional e ativo para o controle hemorrágico e cicatrização de feridas é demonstrada pela doença de von Willebrand, um distúrbio hemorrágico herdado comum10.

Globular VWF circula no sistema sanguíneo humano a uma concentração de até 14,0 μg/mL11,10. Em resposta a lesão vascular, a liberação local do VWF por endotelial Weibel Palade Bodies (WBP) é marcadamente aumentada11,12. Estudos anteriores mostram que a adesão pneumoccus às células endotélias humanas e sua produção da pneumolysin a toxina formadora porosa estimula significativamente a secreção luminal da VWF13. As forças hidrodinâmicas do fluxo sanguíneo induzem uma abertura estrutural dos domínios mechanoresponsive vwf. A taxas de fluxo de 10 dyn/cm2, o VWF multimeriza para longas cadeias proteicas de até várias centenas de micrômetros de comprimento que permanecem ligados ao subendotelio10,12.

Para compreender a função das cordas multimerizadas de VWF geradas o esforço da tesoura na interação do pneumococcus com a superfície endotelial, uma aproximação microfluidic-baseada da infecção da cultura da pilha foi estabelecida. Um dispositivo microfluídico com um sistema de bomba de pressão de ar controlado por software foi usado. Isto permitiu uma recirculação contínua, unidirecional do meio da cultura da pilha com uma taxa de fluxo definida. Assim, o sistema aplicou um esforço definido da tesoura na superfície das pilhas endothelial, que remanesceram unidas dentro das corrediças especializadas da canaleta. Essa abordagem possibilitou a simulação da força de cisalhamento dentro da corrente sanguínea do sistema vascular humano, na qual as cordas da VWF são geradas em células endotélias diferenciadas condições de fluxo constantedefinidas. Para isso, as células endotélias foram cultivadas em toboáguas específicos (ver Tabela de Materiais),que foram adaptados para análises microscópicas durante o fluxo. O sistema microfluídico da bomba forneceu a situação altamente definida e controlada do esforço da tesoura exigida para a formação de cordas prolongadas de VWF na camada endotelial confluent da pilha. Após a estimulação da secreção VWF-seção de células endotélias da veia umbilical humana cultivada sifluente (HUVEC) por suplementação de histamina, a formação de cordas foi induzida pela aplicação de um estresse de cisalhamento () de 10 dyn/cm2. O estresse da cisalhamento é definido como a força agindo na camada celular. É calculado aproximadamente de acordo com Cornish et. al.14 com equação 1:
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Onde = estresse de cisalhamento em dyn/cm2, η = viscosidade em (dyn' s)/cm2, h =metade da altura do canal, w = metade da largura do canal, e Φ = flowrate em mL/min.

O resultado da equação 1 depende das diferentes alturas e larguras dos diferentes slides usados (ver Tabela de Materiais). Neste estudo foi utilizado um slide de canal Luer de 0,4 μm, resultando em um fator de deslizamento de câmara de 131,6 (ver fórmula 2).
figure-introduction-4192

Viscosidade do meio em 37 °C é 0.0072 dyn' s/cm² e um esforço da tesoura de 10 dyn/cm² foi usado. Isso resultou em uma taxa de fluxo de 10,5 mL/min (ver fórmula 3).
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Aqui, a adaptação e o avanço de um procedimento microfluídico do culturing da pilha usando um sistema de fluxo laminar unidirecional para a investigação e a visualização de mecanismos bacterianos da infecção na vasculatura do anfitrião são descritos em detalhe. A geração de cordas VWF em camadas endotelias também pode ser estimulada usando outros sistemas de bomba que são capazes de aplicar um estresse de cisalhamento contínuo e constante15.

Após o cultivo de células endotélias primárias à confluência no fluxo e estimulação da formação de cordas VWF, pneumococci expressando proteína fluorescência vermelha (RFP)16 foram adicionados à camada de células endotelial controle microscópico constante. O apego de bactérias às cordas VWF na superfície das células endotélias foi microscópico visualizado e monitorado por até três horas em tempo real usando anticorpos específicos da VWF com rótulo fluorescente. Com essa abordagem, o papel da VWF como cofator de adesão promovendo o apego bacteriano ao endotelio vascular foi determinado8.

Além da visualização microscópica da secreção de proteínas e alterações conformais, este método poderia ser usado para monitorar etapas únicas dos processos de infecção bacteriana em tempo real e quantificar a quantidade de bactérias associadas em diferentes pontos de Infecção. O sistema de bomba controlado por software específico também fornece a possibilidade de cultura das células endotélias em condições de fluxo constante definido por até vários dias e permite uma incubação de fluxo médio pulsado definido. Além disso, este método pode ser aplicado usando diferentes tipos de células. A adaptação do protocolo de coloração também permite a detecção e visualização de bactérias internalizadas em células eucarióticas.

Este manuscrito descreve este protocolo experimental avançado que pode ser usado como uma abordagem definida, confiável e reproduzível para uma caracterização eficiente e versátil de processos fisiopatológicos.

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Protocolo

O cultivo microfluídico de células foi realizado com células endotélias humanas primárias comerciais (HUVEC). A empresa isolou as células com o consentimento informado do doador. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Câmara de Médicos do Estado Federal Baden-Wuerttemberg com o número de referência 219-04.

Nota: Veja a Tabela de Materiais para suprimentos de protocolo.

1. Pré-cultivo de células endotélias primárias

  1. Descongele um frasco congelado de glicerol contendo 1 x 105 HUVEC primário de três doadores diferentes suavemente a 37 °C e semeie as células em 7 mL de meio de crescimento de células endoteliis pré-aquecido (ECGM, pronto para uso com suplementos) em um frasco de25 cm 2 células.
    Nota: As células endotélias primárias perdem capacidade de diferenciação após mais de 5 ciclos de proliferação. Portanto, apenas células com menos de 5 passagens podem ser usadas se altos teores de diferenciação celular forem necessários.
  2. Cultivar as células a 37 °C em 5% de CO2 atmosfera por 60 min para permitir a fixação da superfície e trocar o meio de cultura celular ECGM para se livrar dos resíduos de crioconservação.
  3. Continue a cultivar as células a 37 °C em 5% de CO2 até formarem uma camada de células subconfluentestidas.
    Nota: O HUVEC não deve crescer a uma camada do confluent desde que os contatos apertados da pilha-pilha impedem a formação de uma camada de pilha estável mais tarde no fluxo.

2. Pré-cultivo de Streptococcus pneumoniae

CUIDADO: Streptococcus pneumoniae é um agente de nível 2 de biossegurança e só é permitido ser cultivado em laboratórios de biossegurança nível 2. Use um banco limpo classificado para o nível de segurança 2 para todos os tratamentos bacterianos, evite estritamente a formação do aerossol, e use uma centrífuga com proteção do aerossol para sedimentação das bactérias.

  1. Inocular uma placa de ágar de sangue Columbia com Streptococcus pneumoniae clínica isolar ATCC11733 derivado de um estoque de glicerol constantemente armazenados a -80 °C e cultivar a placa de ágar durante a noite em 37 °C e 5% CO2.
  2. Prepare 40 mL de caldo líquido Todd Hewitt complementado com extrato de levedura de 1% (THY) e 15 mL de soline estéril tampão de fosfato (PBS) pH 7.4, para o cultivo bacteriano e passos de lavagem.
  3. Use um tubo estéril para o cultivo bacteriano e inocular o caldo de cultura líquida com massa bacteriana. Controle a quantidade de inoculação por medição fotométrica de 1 mL alíquotas a 600 nm contra caldo líquido não inoculado como referência. Preencha a massa bacteriana no caldo líquido até atingir uma densidade óptica de 600 nm (OD600)de 0,15.
  4. Incubar o caldo líquido inoculado sem tremer a 37 °C e 5% CO2 e determinar o OD600 a cada 30 min medindo 1 mL aliquots usando cuvettes de plástico.
  5. Assim que a cultura bacteriana atingiu um OD600 de 0,4, o que corresponde à fase de crescimento exponencial, centrífuga a suspensão da cultura bacteriana por 10 min a 1.000 x g à temperatura ambiente (RT).
    Nota: Não permita que uma cultura pneumococo atinja um OD600 de mais de 1,0, porque uma alta densidade de cultura pneumocórcana é conhecida por desencadear a auto-falese bacteriana, o que pode afetar a aptidão bacteriana geral.
  6. Resuspende o sedimento bacteriano suavemente com 10 mL PBS e sedimentos novamente por 10 min a 1.000 x g em RT.
  7. Resuspende o sedimento bacteriano lavado delicadamente em 1 mL PBS e determine o OD600 de 10 μL da suspensão bacteriana usando 1 mL de PBS como uma referência.
  8. Ajuste a quantidade de bactérias em PBS a um OD600 de 2.0. De acordo com a contagem bacteriana anteriormente determinada, um OD600 de 2.0 corresponde a 2 x 109 unidades de formação da colônia (CFU). Proceder imediatamente com o procedimento de infecção para evitar a auto-hídsite bacteriana.

3. Cultivo de células endotéliticas de HUVEC condições microfluídicas

  1. Desaque as células endotélias primárias do frasco de cultura celular por proteólise controlada. Executar os seguintes passos em um ambiente estéril usando um banco limpo. Prepare um volume de 15 mL de PBS estéril para as etapas de lavagem.
    1. Retire o ECGM de uma camada HUVEC cultivada em subconfluently e lave a camada celular com 10 mL PBS usando uma pipeta sorológica para se livrar do meio de cultura celular.
    2. Incubar o HUVEC lavado com 3 mL de 37 °C solução de dissociação de células pré-aquecidas para desprendimento celular para 5 min a 37 °C. Observe o desprendimento das células proteolíticas por monitoramento microscópico a cada minuto.
    3. Pipeta a suspensão celular destacada em um tubo contendo 7 mL de ECGM complementado com 2% de soro de bezerro fetal (FCS) para parar a proteólea e sedimentar as células por 3 min a 220 x g em RT.
    4. Retire o supernatant e resuspender o HUVEC em 250 μL de ECGM complementado com 5% FCS e 1 mM MgSO4. Use 10 μL da suspensão celular para contagem celular usando uma câmara de contagem de células Neubauer e ajuste a contagem celular para 4 x 106 células/mL ECGM complementada com 5% FCS e 1 mM MgSO4.
      Nota: Para cada experimento de fluxo 30 mL de ecgm médio complementado com 5% FCS e com 1 mM MgSO4 será necessário. A partir daqui, esta composição média é chamada ECGMS-medium. O aumento da concentração de Fcs no meio da cultura de 2% para 5% suporta o acessório celular e a viabilidade celular do HUVEC semeado no slide do canal. O meio suplementos FCS e MgSO4 estabilizar substancialmente o acessório celular do HUVEC condições de estresse de cisalhamento.
  2. Semente e cultive o HUVEC em um slide de canal. Trabalhe em um ambiente estéril usando um banco limpo. As células serão cultivadas estresse de cisalhamento por 2 dias seguidos de infecção por bactérias e monitoramento microscópico por mais 2 h.
    1. Equilibre um slide de canal, um conjunto de perfusão de 1,6 mm de diâmetro e 50 cm de comprimento, um adianto do ECGMS-médio e um canal Luer deslizam 0,4 μm de altura, por 24 h em uma incubadora com 5% de CO2 atmosfera a 37 °C para reduzir o número de bolhas de ar.
      Nota: Este procedimento é recomendado para degas o equipamento plástico e para preaquecer o meio, os tubos de perfusão, e os reservatórios. Se materiais ou líquidos tiverem sido armazenados na RT ou na geladeira, gases dissolvidos no plástico e líquidos serão liberados quando aquecidos na incubadora durante o experimento. Bolhas de gás aparecerão. Degassing todos os componentes plásticos antes do experimento irá eliminar este efeito. Cada vez que o sistema é retirado da incubadora, o processo de absorção de gás começa novamente. Portanto, trabalhar rapidamente na RT e nunca deixar a unidade fluida fora da incubadora por períodos de tempo mais longos.
    2. Use uma pipeta para injetar 100 μL de uma solução de gelatina suína filtrada porerena de 2% estéril na solução PBS em um dos reservatórios de um slide de canal com equilíbrio de temperatura. Incubar a solução de gelatina para 1 h a 37 °C e enxaguar o canal do slide com 1 mL PBS em condições estéreis usando uma seringa 1 mL Luer.
    3. Coloque o canal revestido de gelatina deslizar sobre uma fina placa de poliestireno ou isopor para evitar uma queda na temperatura do slide. Adicione 100 μL da suspensão 4 x 106/mL HUVEC com uma seringa Luer de 1 mL no slide.
      Nota: Colocar o slide do canal na superfície do metal frio do banco limpo pode diminuir a temperatura do fundo da lâmina, gerando assim o estresse frio para as células endotélias. Durante a tubulação celular segurar o slide um pouco para cima para deixar as bolhas de ar subir e desaparecer de dentro do slide.
    4. Incubar o slide do canal com o HUVEC por 60 min a 37 °C e 5% CO2 e encher os reservatórios médios em ambas as extremidades do slide do canal com 60 μL ECGMS-médio cada. Incubar por 1 h a 37 °C e 5% CO2.
  3. Ajuste a bomba microfluídica e as configurações do software.
    1. Conecte o conjunto de perfusão equilibrado à unidade de bomba, preencha com 13,6 mL de ECGMS-médio e inicie o software de controle da bomba. Selecione o conjunto de perfusão adequado e o tipo de deslizamento de câmara usando o rolagem para baixo das janelas no menu da unidade fluida configurada. Escolha 0.007 (dyn- s/cm2)no software para a viscosidade média. (Consulte as configurações de software da bomba de pressão marcadas com setas vermelhas na Figura Suplementar 1).
    2. Fora da incubadora, conecte uma garrafa de vidro cheia de contas de sílica de secagem à tubulação de pressão do ar (consulte a Figura 1, Inset 3). O ar da bomba de pressão circula entre os reservatórios de perfusão e a bomba e deve estar seco antes de reentrar no dispositivo da bomba. Selecione parâmetros de fluxo no menu de software, definir a pressão para 40 mbar, e lavar os tubos de bomba com o meio líquido, iniciando o fluxo médio contínuo. (Essas configurações também são indicadas por setas vermelhas na Figura Suplementar 1).
    3. Programe os ciclos desejados do esforço da tesoura do cultivo do fluxo. Comece com 5 dyn/cm2,controle o pumpinng equilibrado do reservatório e assegure-se de que nenhuma bolha de ar está circulando no sistema da bomba.
      Nota: O estresse da cisalhamento da parede em um slide de canal depende da taxa de fluxo e da viscosidade do meio de perfusão. Se usar outro sistema de bomba, consulte as equações descritas na introdução para definir uma taxa de fluxo que gera o nível de estresse desejado cisalhamento. As configurações descritas correspondem a uma taxa de fluxo de 5,42 mL/min. (Uma captura de tela exemplar mostrando as configurações adequadas do parâmetro de fluxo no software da bomba de pressão é mostrada na Figura Suplementar 2).
    4. Pare a circulação de fluxo no software de controle da bomba e mantenha o fluxo médio na tubulação de perfusão apertando os tubos perto das conexões Luer. Conecte o slide do canal, evitando assim bolhas de ar, e coloque a unidade fluida com o slide do canal conectado em uma incubadora de CO2 a 37 °C e 5% DECO 2. Comece o estresse de cisalhamento em 5 dyn/cm2 por 30 min para adaptar suavemente as células às forças geradas pelo estresse da cisalhamento antes de acelerar o nível de estresse da cisalhamento (ver Figura Suplementar 3).
      Nota: Tome cuidado para que nenhuma bolha de ar permaneça no sistema de tubo ou no slide após a conexão com o sistema de tubo, porque o movimento das bolhas de ar no fluxo pode levar ao desprendimento celular.
    5. Acelere o estresse da cisalhamento para 10 dyn/cm2 (que correspondem a 10,86 mL/min nessa configuração de fluxo) e incubar o slide do canal em estresse contínuo de cisalhamento por 48 h em uma pequena incubadora de CO2 a 37 °C e 5% de CO2 para permitir a diferenciação celular ( os respectivos settinngs software são indicados com setas vermelhas na Figura Suplementar 4).
      Nota: As células HUVEC tendem a se separar da superfície do canal se o cultivo de fluxo for iniciado diretamente em 10 dyn/cm2. As células permanecem ligadas à superfície da câmara se o cultivo de fluxo for iniciado com menos estresse cisalhamento usando 5 dyn/cm2 por um mínimo de 30 min seguido supérfluo lentamente até o desejado 10 dyn/cm2. Um estresse de cisalhamento de 10 dyn/cm2 é o valor mínimo nesta configuração de perfusão necessária para a formação de cordas VWF.
    6. Após 24 h de cultivo de células microfluídicas, pare o fluxo médio com o software de controle da bomba exatamente quando um nível médio equilibrado é alcançado em ambos os reservatórios médios. Coloque a unidade fluida em um banco limpo e retire 10 mL do meio de cultivo circulado dos reservatórios de perfusão usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Adicione 10 mL de ECGMS-médio para os reservatórios para renovar o meio, coloque a unidade fluida de volta para a incubadora de CO2 em 37 °C e 5% CO2, e reiniciar o cultivo fluido usando o software de controle da bomba.
      Nota: A função da bomba de pressão pode de repente ser interrompida por máquinas de laboratório, como grandes centrífugas, o que pode criar uma forte perturbação do campo magnético. Esta súbita perturbação pode levar ao desprendimento celular. Tome cuidado para que essas máquinas não estão ativos perto da bomba de pressão durante o experimento.
    7. Comece o pré-aquecimento da câmara de incubação de temperatura que cobre o estágio do microscópio de fluorescência a 37 °C para o equilíbrio de temperatura 24 h antes da visualização microscópica. Depois que o microscópio é pré-aquecido, iniciar o controle de software microscópio e ajustar as configurações principais para o monitoramento microscópico fluorescência, selecionando as configurações de filtro apropriado (540 nm/590 nm para detecção das bactérias que expressam RFP e 470 nm/515 nm para detecção de emissão de fluoresceina dos anticorpos específicos da VWF conjugados fitc). Prewarm uma câmara de aquecimento adicional para a incubação da unidade fluidic em 37 °C.
      Nota: Durante as análises de infecção e monitoramento microscópico a temperatura do slide do canal e do meio circulante não deve diminuir substancialmente, porque isso geraria estresse frio nas células. Em geral, o tamanho das câmaras de temperatura que cobrem o estágio do microscópio não é suficiente para cobrir toda a unidade fluida. Portanto, recomenda-se o uso de uma câmara de aquecimento adicional pré-aquecida a 37 °C.
    8. Para visualização microscópica, coloque a unidade fluida na câmara de aquecimento pré-aquecida de 37 °C e coloque o slide do canal em um palco do microscópio pré-aquecido de 37 °C.
      Nota: Para visualização microscópica, a unidade fluida e o slide do canal precisavam ser removidos da incubadora de CO2 devido ao comprimento limitado da tubulação de perfusão. Se os tempos de infecção e o monitoramento microscópico de mais de 180 min forem necessários fora da atmosfera de 5% de CO2 para tampão de pH, um meio amortecimento de pH deve ser usado para cultivo microfluídico.
    9. Controle a morfologia celular e a integridade da camada HUVEC antes da injeção de histamina e bactérias para a circulação de fluxo ao longo do tempo do experimento de fluxo e depois de terminar o experimento de fluxo usando o modo de campo brilhante do microscópio.

4. Indução de lançamento e visualização de VWF de cordas vwf multimerizadas

  1. Manter a configuração de fluxo, porque um estresse de cisalhamento de 10 dyn/cm2 é necessário para desencadear a multimerização do VWF para longas cadeias de até 200 MDa. Induza a liberação de VWF do WPB endotelial injetando 136 μL de uma solução do estoque da histamina de 100 mM no ECGMS-médio que circula na tubulação da perfusão usando uma porta da injeção. A concentração final de histamina no meio de fluxo será de 1 mM. Se nenhuma porta de injeção estiver disponível, a histamina pode ser adicionada alternativamente por tubulação no meio dos reservatórios da bomba.
  2. Para a detecção de imunofluorescência de cadeias vwf multimerizadas, parar o fluxo quando um nível médio equilibrado nos reservatórios é atingido, e injetar 20 μg de um vwf específico fitc-conjugado anticorpo em um volume de 200 μL PBS (pH 7,4) para a circulação de 13,6 mL de ECGMS-médio usando uma porta de injeção. Se nenhuma porta de injeção estiver disponível, o anticorpo pode ser adicionado alternativamente por tubulação no meio dos reservatórios da bomba. Isso resulta em uma concentração final de anticorpos de 1,3 μg/mL.
  3. Para a varredura microscópica de diversos campos de vista em um curto espaço de tempo, use a unidade da fluorescência do microscópio com um dispositivo da fluorescência de Xenon no poder de 30% e em uma câmera da epifluorescência. Monitore a forma e a morfologia da camada HUVEC com o modo de campo brilhante para selecionar células representativas adequadas para a visualização de cordas VWF.
  4. Para visualização de cordas VWF fluorescentes verdes, selecione um objetivo de óleo 63x/1.40 e um filtro de detecção de 470 nm no menu da unidade de fluorescência do software de microscópio (LasX). Crie instantâneos de z-pilhas de pelo menos 50 vistas representativas do campo, cada uma contendo aproximadamente 10 HUVEC morfologicamente intactos. Para quantificação das cordas verdes fluorescentes vwf em diferentes pontos de tempo, digitalizar vários campos de visão.

5. Avaliação microscópica do acessório bacteriano às VWF-cordas no fluxo no tempo real

  1. Quantificar o acessório pneumocócico às vwf-cordas geradas em superfícies celulares HUVEC através da detecção de imunofluorescência.
    1. Segure o fluxo e injete 1,35 x 108 CFU/mL RFP-expressando pneumocci em um volume máximo de 1 mL no ECGMS-médio usando a porta de injeção. Alternativamente, pipeta as bactérias no meio no reservatório da bomba. Reiniciar o estresse cisalhamento em 10 dyn /cm2 para deixar as bactérias circulam dentro do sistema de bomba.
    2. Selecione um objetivo de imersão de óleo de 63x para ampliação do microscópio e ajuste as configurações de filtro de fluorescência no software de microscópio para o canal RFP (filtro de detecção de 540 nm) para detecção de pneumococci expressorde RFP.
    3. Para quantificação de apego bacteriano às cordas VWF, pare o fluxo e crie instantâneos de z-pilhas de pelo menos 30 vistas representativas do campo, cada uma contendo aproximadamente 10 HUVEC morfologicamente intacto, e conte a quantidade de pneumococci.
    4. Use o algoritmo de estatísticas de um fatorial ANOVA para avaliar os dados, seguido por um teste de amostra não emparelhado pós-hoc de duas caudas para comparação estatística detalhada. Os valores p de <0.05 foram considerados estatisticamente significativos.

6. Avaliação microscópica do acessório bacteriano às VWF-cordas após a fixação da amostra

  1. Experimente a fixação antes da coloração de imunofluorescência.
    1. Pare o fluxo, retire 10 mL de ECGMS-médio dos reservatórios da bomba, e adicione 10 mL de PBS complementado com 5% de paraformaldeído (PFA). Deixe a solução PFA circular por 10 min em um estresse de cisalhamento de 10 dyn/cm2.
    2. Desligue o slide do canal da unidade da bomba.
  2. Bloqueie locais de ligação inespecíficos na superfície celular e realize imunodetecção de cordas VWF e bactérias anexadas.
    1. Prepare 4 mL de uma solução de lavagem contendo 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) complementada com 4% de sacarose para todas as etapas de lavagem. Prepare 1 mL de uma solução de bloqueio contendo 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) complementada com sacarose de 4% e 2% de albumina de soro bovina (BSA) para bloqueio de sites de ligação inespecíficos.
    2. Lave o canal pfa-incubado slide 3x usando uma seringa 1 mL Luer para injetar 200 μL da solução de lavagem e incubar o slide para 120 min em RT com 200 μL solução de bloqueio.
    3. Prepare 4 mL de outra solução de bloqueio contendo 100 mM Na2CO3, (pH 9,2) complementada com sacarose de 4% e 0,5% BSA para a diluição dos anticorpos. Use 200 μL desta solução de bloqueio para diluir o anti-sero de coelho específico do pneumoctilo 1:100. Use 200 μL desta solução de bloqueio para diluir o anticorpo de camundongo específico da VWF 1:50 para fazer uma concentração de anticorpos específica da VWF de 4 μg/mL. Diluir o anticorpo secundário alexafluor488-conjugado a partir de uma solução de estoque de 2 mg/mL 1:100 em 200 μL de PBS (pH 7.4) para gerar uma concentração final de 20 μg/mL.
      Nota: Nas configurações de imunofluorescência descritas, a detecção de anticorpos apresentou resultados ideais quando os anticorpos foram diluídos no tampão de carbonato alcalino acima mencionado. Com base em resultados anteriores, as soluções de bloqueio recomendadas e a quantidade de anticorpos são adequadas para muitas aplicações. No entanto, diferentes experimentos podem exigir otimização individual da combinação de anticorpos, concentração de anticorpos, tempo de incubação e constituição do buffer de bloqueio. Como alternativa, um sistema tampão de fosfato com uma faixa neutra de pH pode ser adequado ou até mesmo preferido como um amortecedor de incubação. Em caso de sinais fracos de fluorescência, a concentração de anticorpos secundários deve ser aumentada. Se for detectado demasiado ruído de fundo de fluorescência inespecífico, a quantidade de substâncias de bloqueio deve ser aumentada.
    4. Para a coloração vwf-imunofluorescência, lave o slide do canal usando uma seringa 1 mL Luer injetando 200 μL da solução de lavagem 3x e incubar o slide com o 1:50 diluído VWF-anticorpo específico para 30 min em RT. Depois, lavar o slide do canal novamente 3x com 200 μL da solução de lavagem e incubar o slide com o 1:100 diluído AlexaFluor488-conjugado mouse-specific anticorpo para 30 min em RT. Finalmente, lave o slide do canal novamente 3x com 200 μL da solução de lavagem.
      Nota: Os húrforos AlexaFluor são sensíveis ao branqueamento. Portanto, o slide deve ser protegido, mantendo-o em uma câmara escura durante os passos de incubação com os anticorpos conjugados de fluorofoforre.
    5. Para a imunodetecção do pneumococci, incubar o slide com um 1:100 diluído pneumococo específico anticorpo coelho para 30 min em RT. Depois, lave o slide do canal 3x com 200 μL da solução de lavagem e incubar o slide com 1:100 diluído AlexaFluor568-conjugado coelho específico anticorpo para 30 min em RT. Lave o slide do canal novamente 3x com 200 μL da solução de lavagem.
    6. Para manchar o citoesqueleto de actina celular com faloide fluorescente, permeabilize o HUVEC por incubação com 120 μL de 0,1% Triton X-100 por 5 min na RT. Lave o canal slide 3x com 200 μL da solução de lavagem e incubar o slide com 120 μL de 1:1.000 diluído AlexaFluor350-conjugado faloide. Esta etapa de incubação visualizará o citoesqueleto polimerado de actina e permitirá o monitoramento da forma celular e possíveis alterações morfológicas induzidas pelo estresse.
    7. Lave o canal slide 3x com 200 μL da solução de lavagem. Finalmente, lave o slide 4x com 200 μL ddH2O e visualize as cordas verdes fluorescentes vwf, as bactérias fluorescentes vermelhas e o citoesqueleto fluorescente azul de actina usando as configurações de filtro apropriadas no microscópio de fluorescência.

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Resultados

Culturing HUVEC primário em um fluxo unidirecional constante resulta na formação de um confluente e camada de células bem embaladoque promove a geração de WPBs celulares preenchidos com o mecanosensível VWF13,14. Este protocolo descreve o uso de uma bomba de pressão de ar baseada, sistema de recirculação sem pulso para análise de infecção que requer imitar a situação de estresse cisalhamento no fluxo sanguíneo humano.

E...

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Discussão

A simulação da interação bacteriana com proteínas hospedeiras mecanosensíveis, como a VWF, requer um sistema de cultura celular perfusível que permita a geração de um fluxo definido, unidirecional e contínuo de líquidos, gerando assim um estresse de cisalhamento confiável . Vários sistemas de bombas microfluídicas já foram descritos. Uma revisão abrangente de Bergmann et al. resume os aspectos-chave dos diferentes modelos de cultura celular bie tridimensional17.

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O projeto foi financiado pelo DFG (BE 4570/4-1) para a SB.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-syringeFisher Scientific10303002with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringeSarstedt9077136For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
AccutaseeBioscience now thermo fisher00-4555-56protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated PhalloidinAbcamab176751no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibodyThermo Fisher SientificA11001stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibodyThermo Fisher ScientificA-11011stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-BrothBecton Dickinson GmbHBD 249210complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-25Gsolubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filterTPP90026subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12RBeckman Coulter Life Sciences392304spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30Beckman Coulter Life SciencesB06314spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MKHermle305.00 V05 - Z 216 Mspinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
ChloramphenicolCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3886.2used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubingibidi10821for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-IncubatorFisher ScientificMIDI 40incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-IncubatorSanyoMCO-18 AICfor incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar platesBecton Dickinson GmbHPA-254005.06agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
ComputerDellLatitude 3440Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)LeicaDMi8An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3904.1used for PBS buffer
Drying materialMerck101969orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement MixPromocellC-39215supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMSPromocellC-22010ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)PromocellC-22010culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)biochrome now MerckS 0415supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibodyAbcamab8822stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unitibidi10903fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG-1890-100gfor precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochlorideSigma AldrichH-7250-10MGfor induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)PromocellC-12203 Lot-Nr. 396Z042primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)Santa Cruzsc73268stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Portibidi10820for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscopeZeissAxiovert 35Minverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)ibidi80176physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)Sigma AldrichM7506-500GFor preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pumpibidi10905air pressure pump
Neubauer cell counting chamberKarl Hecht GmbH&Co KG40442002microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)Electron Microscopy Sciences15710-Sfor cross linking of samples
Perfusion Setibidi10964Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettesSarstedt67,741(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserumPinedaraised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam platethis is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe6781.1used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)ibidiv1.5.4Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mLSarstedt72.706/ 72.695.500required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volumeSarstedt6,25,48,004
RFP-expressing pneumococciNational Collection of Type Cultures, Public Health England10,319Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mLSarstedt86.1253.025/ 86.1254.025for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)Sigma Aldrich451614-25Gfor preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, KarlsruheP030.2used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22Biochrom80-2115-20measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
SucroseSigma AldrichS0389-500Gfor preparation of blocking buffer
Triton X-100Sigma AldrichT9284-500MLUsed in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extractoxoidLP0021bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY

Referências

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