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摘要

本研究描述了在定义的流动条件下，在剪切应力下在分化人类原发内皮细胞表面产生的对冯·威勒布兰德因子字符串的肺炎球菌依从的微观监测。通过应用微分免疫染色程序，此协议可扩展到特定细胞结构的详细可视化和细菌定量。

摘要

肺炎链球菌与内皮细胞表面的相互作用通过对美能敏感蛋白（如冯·威勒布兰德因子（VWF）在血液流动中介导。这种糖蛋白改变其分子构象，以响应剪切应力，从而暴露结合位点，用于广泛的宿主-配体相互作用。一般来说，在定义的剪切流下培养原发内皮细胞可以促进特定的细胞分化，并形成一个稳定且紧密相连的内皮层，类似于血管内壁的生理。.因此，对细菌病原体与涉及对肌敏感的蛋白质的宿主血管之间的相互作用的功能分析需要建立泵系统，以模拟已知影响表面的生理流动力。血管细胞。

本研究中使用的微流体装置使具有定义流速的流体能够连续和无脉冲再循环。计算机控制的气压泵系统通过生成连续、单向和控制的介质流，在内皮细胞表面应用定义的剪切应力。通过使用专为微观可视化而设计的特殊通道幻灯片，可以在流中微观监控和量化细胞和细菌附着物的形态变化。与静态细胞培养感染（一般要求在免疫标记和微观分析之前进行样品固定）不同，微流体滑道可实现基于荧光的蛋白质、细菌和细胞成分的检测样品固定后;系列免疫荧光染色;和直接荧光检测。结合荧光细菌和特定的荧光标记抗体，这种感染程序为与血管过程相关的大量科学应用提供了一个高效的多组分可视化系统。

引言

肺炎球菌感染的发病机制的特点是与细胞外基质化合物和人类血变成分的多样性相互作用，如质原和VWF1，2， 3，4，5，6，7，8 。多域糖蛋白VWF作为平衡血变的关键调节器，通过调解血栓细胞招募和纤维蛋白结合在血管血栓形成位9。功能，活跃的VWF对出血控制和伤口愈合的重要性证明了冯·威尔布兰德的疾病，一种常见的遗传性出血紊乱10。

球状VWF在人体血液系统中循环，浓度高达14.0微克/mL11，10。为了应对血管损伤，内皮韦贝尔帕拉德体（WBP）局部释放的VWF明显增加11，12。以前的研究表明，肺炎球菌粘附于人类内皮细胞及其产生的孔隙毒素肺炎溶血蛋白显著刺激发光VWF分泌13。血流的流体动力诱导机械反应VWF域的结构开放。在10dyn/cm2的流速下，VWF多变到长度高达几百微米的长蛋白串，仍然附着在子内皮10，12。

为了理解在剪切应力下产生的多面化VWF字符串在肺炎球菌与内皮表面相互作用中的功能，建立了基于微流体的细胞培养感染方法。使用一种微流体装置，采用软件控制的气压泵系统。这使得细胞培养基的连续、单向再循环具有定义的流速。因此，系统在内皮细胞表面应用了定义的剪切应力，内皮细胞仍附着在专用通道滑道内。这种方法能够模拟人类血管系统血流中的剪切力，在定义的恒定流动条件下，VWF字符串在分化的内皮细胞上生成。为此，内皮细胞在特定的通道幻灯片中培养（见材料表），这些细胞适用于流中的微小分析。微流体泵系统提供了在可融合的内皮细胞层上形成扩展 VWF 字符串所需的高度定义和控制的剪切应力情况。通过组胺补充刺激人类脐带静脉内皮细胞（HUVEC）的VWF分泌后，通过施加10 dyn/cm2的剪切应力（*）诱导弦形成。剪切应力定义为作用于细胞层的力。它是大约根据康尼什等人计算的。al.14与方程 1:
figure-introduction-1423

其中 = = 在 dyn/cm2中剪切应力 ，= 在 （dyn_s）/cm2中的粘度，h = 通道高度的一半，w = 通道宽度的一半，而 = = 流量（以 mL/min 表示）。

公式 1 的结果取决于所使用的不同幻灯片的不同高度和宽度（参见材料表）。在本研究中，使用了 0.4 μm 的 Luer 通道滑动，导致室滑动系数为 131.6（参见公式 2）。
figure-introduction-1786

37°C时介质的粘度为0.0072 dyn_s/cm2，剪切应力为10 dyn/cm2。这导致流量为 10.5 mL/min（参见公式 3）。
figure-introduction-1957

本文详细介绍了使用单向层流系统对宿主血管中细菌感染机制进行调查和可视化的微流体细胞培养过程的适应和进展。内皮层上的VWF字符串的生成也可以通过使用其他泵系统，能够应用连续和稳定的剪切应力15刺激。

在原发内皮细胞培养到流动汇合和刺激VWF弦形成后，在恒定的微观控制下，将表达红荧光蛋白（RFP）16的肺炎球菌添加到内皮细胞层中。使用VWF特异性荧光标记抗体，对内皮细胞表面的细菌附着在VWF串上进行微观可视化和实时监测长达三个小时。用这种方法，VWF作为促进细菌附着到血管内皮的粘附辅助因子的作用被确定8。

除了蛋白质分泌和构象变化的微观可视化外，该方法还可用于实时监测细菌感染过程的单步骤，并量化不同时间点的附着细菌数量。感染。特定的软件控制的泵系统还提供在定义的恒定流动条件下培养内皮细胞长达数天的可能性，并实现定义的脉冲介质流孵育。此外，该方法可以使用不同的单元格类型应用。调整染色方案还能够检测和可视化内化为真核细胞的细菌。

本手稿描述了这种高级实验协议，可用作一种定义、可靠和可重复的方法，用于对病理生理学过程进行高效和通用的表征。

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研究方案

微流体细胞培养用商业性原发性人类脐带静脉内皮细胞（HUVEC）进行。公司在未经捐赠者知情同意后对细胞进行隔离。这项研究得到了联邦巴登-符腾堡州医生委员会伦理委员会的批准，参考号为219-04。

注:有关协议供应，请参阅材料表。

1. 原内皮细胞的预培养

  1. 在37°C下从三个不同的捐赠者轻轻解冻含有1 x 105初级HUVEC的冷冻甘油小瓶，并在25cm2细胞瓶中将细胞播种在7 mL的预热内皮细胞生长培养基（ECGM，准备与补充剂一起使用）。
    注:主内皮细胞在超过5个增殖周期后失去分化能力。因此，如果需要高等级的细胞分化，只能使用通道少于5个通道的细胞。
  2. 在5%CO2大气中在37°C下培养细胞60分钟，使表面附着并交换ECGM细胞培养基，以去除冷冻保存的残留物。
  3. 在5%CO2大气中在37°C下继续培养细胞，直到它们形成亚康体细胞层。
    注:HUVEC 不能生长到汇层，因为紧密的细胞-细胞接触会阻止在流动后期形成稳定的细胞层。

2.肺炎链球菌的预培养

注意:肺炎链球菌是生物安全2级制剂，只允许在生物安全2级实验室进行培养。对于所有细菌处理，使用安全等级为 2 的清洁工作台，严格避免气溶胶形成，并使用带有气溶胶保护的离心机进行细菌沉淀。

  1. 接种哥伦比亚血琼脂蛋白板与肺炎链球菌临床分离ATCC11733衍生自甘油库存不断储存在-80°C，并培养琼月琼度在37°C和5%CO2。
  2. 准备40 mL的托德·休伊特液体汤，辅以1%酵母提取物（THY）和15 mL无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4，用于细菌培养和洗涤步骤。
  3. 使用无菌管进行细菌培养，用细菌质量接种液体培养汤。以非接种液体汤为参考，在 600 nm 处通过光度测量测量 1 mL 等分，控制接种量。将细菌质量填充液体汤中，直到达到 0.15 的 600 nm （OD600）的光学密度。
  4. 在37°C和5%CO2下孵育接种液汤，不摇晃，并使用塑料比胶测量1 mL等分，每30分钟测定OD600。
  5. 一旦细菌培养达到OD600 0.4，对应于指数生长阶段，在室温（RT）下在1000 x g下将细菌培养悬浮液离心10分钟。
    注:不要让肺炎球菌培养达到 OD600超过 1.0，因为高肺炎球菌培养密度已知会触发细菌自测，这可能会影响整体细菌健康。
  6. 用10 mL PBS 轻轻悬浮细菌沉积物，在 RT 处 1，000 x g处再次将沉淀物再悬浮 10 分钟。
  7. 将洗涤的细菌沉积物轻轻悬浮在 1 mL PBS 中，并使用 1 mL 的 PBS 作为参考，确定细菌悬浮液的 OD600 10 μL。
  8. 将 PBS 中的细菌量调整到 OD600的 2.0。根据先前确定的细菌计数，2.0 的 OD600对应于 2 x 109菌落形成单元 （CFU）。立即进行感染程序，以防止细菌自传染。

3. 微流体条件下HUVEC的内皮细胞培养

  1. 通过受控蛋白解分离，从细胞培养瓶中分离原内皮细胞。使用干净的工作台在无菌环境中执行以下步骤。为洗涤步骤准备 15 mL 无菌 PBS 的体积。
    1. 从亚康康生长的HUVEC层中取出ECGM，并使用血清学移液器用10mL PBS清洗细胞层，以去除细胞培养基。
    2. 在37°C下用3mL37°C预热细胞分离溶液孵育洗涤的HUVEC，用于细胞分离5分钟。通过每分钟的微观监测来观察蛋白解细胞分离。
    3. 将分离的细胞悬浮液移入含有7 mL的ECGM的管中，并辅以2%的胎儿小牛血清（FCS），用于阻止蛋白解解和在RT处220 x g下沉淀细胞3分钟。
    4. 去除上清液，并在250 μL的ECGM中重新悬浮HUVEC，辅以5%FCS和1 mM MgSO4。使用 Neubauer 细胞计数室使用 10 μL 的细胞悬浮液进行细胞计数，并将细胞计数调整为 4 x 106细胞/mL ECGM，辅以 5% FCS 和 1 mM MgSO4。
      注:对于每个流量实验 30 mL 的 ECGM 介质辅以 5% FCS 和 1 mM MgSO4将是必需的。从这里这个介质组成被称为ECGMS-媒体。培养基中的FCS浓度从2%增加到5%支持在通道幻灯片中播种的HUVEC细胞附着和细胞活力。介质补充FCS和MgSO4在剪切应激条件下可显著稳定HUVEC的细胞附件。
  2. 在通道幻灯片中播种和培养 HUVEC。使用干净的长凳在无菌环境中工作。细胞将在剪切压力下培养2天，然后感染细菌和显微监测再持续2小时。
    1. 将通道滑动、直径 1.6 mm 和长度为 50 厘米的灌注集、ECGMS 介质的等分和高度为 0.4 μm 的 Luer 通道滑动平衡，在 37°C 下具有 5% CO2大气的培养箱中 24 小时，以减少气泡的数量。
      注:建议采用此程序对塑料设备进行脱气，并预加热介质、灌注管和储液罐。如果材料或液体储存在RT或冰箱中，在实验期间在培养箱中加热时，溶解在塑料中的气体和液体将被释放。然后会出现气泡。在实验前对所有塑料部件进行脱气将消除这种影响。每次系统从培养箱中取出时，气体吸收过程又开始了。因此，在 RT 上快速工作，切勿将液体单元留在培养箱外更长时间。
    2. 使用移液器将 PBS 溶液中 2% 无菌过滤的猪明胶溶液注入温度平衡通道滑道的储液罐之一。在 37°C 下孵育明胶溶液 1 小时，在无菌条件下使用 1 mL Luer 注射器用 1 mL PBS 冲洗滑道。
    3. 将明胶涂层通道滑块放在薄聚苯乙烯或发泡胶板上，以防止滑动温度下降。将 4 x 106/mL HUVEC 悬架的 100 μL 加入幻灯片，并带有 1 mL Luer 注射器。
      注:将通道滑块放在清洁工作台的冷金属表面可能会降低滑底温度，从而对内皮细胞产生冷应力。在细胞移液过程中，将幻灯片保持一点向上，让气泡从滑道内部上升和消失。
    4. 在 37°C 和 5% CO2下用 HUVEC 孵育通道滑道 60 分钟，并填充通道滑道两端的介质储层，每个通道的 ECGMS 介质为 60 μL ECGMS 介质。在37°C和5%CO2下孵育1小时。
  3. 调整微流体泵和软件设置。
    1. 将平衡灌注组连接到泵单元，加注 13.6 mL 的 ECGMS 介质，然后启动泵控制软件。使用设置的流体单元菜单中的向下滚动窗口选择足够的灌注集和造型室幻灯片类型。在软件中选择 0.007 （dyn_s/cm2） 以进行中等粘度。（请参阅补充图 1中标有红色箭头的压力泵软件设置）。
    2. 在培养箱外，将装有干燥硅珠的玻璃瓶连接到气压管（参见图1，内注3）。压力泵的空气在灌注储液罐和泵之间循环，在重新进入泵装置之前必须干燥。在软件菜单中选择流量参数，将压力设置为 40 mbar，并通过启动连续介质流将泵管与液体介质冲洗。（这些设置也由补充图 1中的红色箭头指示。
    3. 规划所需的流量培养剪切应力循环。从 5 dyn/cm2开始，控制平衡储液罐泵，并确保泵系统中没有气泡循环。
      注:通道滑动中的壁剪切应力取决于灌注介质的流速和粘度。如果使用另一个泵系统，请参阅简介中描述的方程，以设置产生所需剪切应力级别的流速。所述设置对应于 5.42 mL/min 的流速（在补充图 2中显示压力泵软件中适当流量参数设置的模范屏幕截图）。
    4. 通过夹紧 Luer 连接附近的管，停止泵控制软件中的流量循环，并将中流保持在灌注管中。连接通道滑块，从而避免气泡，并将带连接通道滑动的流体单元置于 CO2培养箱中，温度为 37°C 和 CO25%。在 5 dyn/cm2处启动剪切应力 30 分钟，使细胞在加速剪切应力水平之前平稳地适应剪切应力产生的力（参见补充图 3）。
      注:小心，在连接到管系统后，管系统或滑轨中没有气泡，因为气流中的气泡运动可能导致细胞分离。
    5. 将剪切应力加速至 10 dyn/cm2（在此流量设置中对应于 10.86 mL/min），并在 37°C 和 5% CO 2 的小型 CO2培养箱中孵育通道滑动，在 37°C 和 5% CO2中孵育通道滑动 48 小时，以允许细胞分化 （在补充图 4中，相应的软件设置以红色箭头表示。
      注:如果流量培养直接开始于10 dyn/cm 2，HUVEC细胞往往会从通道表面分离。如果流量培养开始时使用 5 dyn/cm2进行至少 30 分钟的剪切应力，然后缓慢地将剪切应力增加到所需的 10 dyn/cm2，则细胞仍附着在腔室表面。10 dyn/cm2的剪切应力是 VWF 字符串形成所需的此灌注设置中的最低值。
    6. 微流体细胞培养24小时后，当两个介质储层达到平衡介质水平时，用泵控制软件停止中流。将液体单元放在干净的工作台上，并使用 10 mL 血清移液器去除灌注储液罐循环培养培养基的 10 mL。将10mL的ECGMS-培养基加入储液罐以更新介质，将流体单元放回37°C和5%CO2的CO2培养箱中，并使用泵控制软件重启流体培养。
      注:压力泵的功能可能突然被实验室机器（如大型离心机）破坏，从而产生强烈的磁场扰动。这种突然的中断可能导致细胞分离。在实验过程中，请注意此类机器在压力泵附近没有活动。
    7. 在显微可视化之前，开始将覆盖荧光显微镜阶段的温度孵化室预热至 37°C，以进行 24 小时的温度平衡。显微镜预热后，启动显微镜软件控制，通过选择适当的过滤器设置（540 nm/590 nm）来检测 RFP 表达细菌和荧光显微监测的主要设置。470 nm/515 nm，用于检测 FITC 结合的 VWF 特异性抗体的荧光素发射。预热一个额外的加热室，用于在37°C下孵育流体单元。
      注:在感染分析和微观监测过程中，通道滑动和循环介质的温度不应大幅下降，因为这会对细胞产生冷应力。一般来说，覆盖显微镜阶段的温度室的大小不足以覆盖整个流体单元。因此，建议使用预热至 37°C 的额外加热室。
    8. 对于微观可视化，将流体单元放入 37°C 预热加热室，并将通道滑动放在 37°C 预热显微镜的舞台上。
      注:对于微观可视化，由于灌注管长度有限，需要从 CO2培养箱中取出流体单元和通道滑块。如果在 5% CO2大气外需要超过 180 分钟的感染时间和显微监测，则应使用 pH 缓冲介质进行微流体培养。
    9. 在将组胺和细菌注入流循环的整个流动实验期间，以及使用显微镜的明亮场模式完成流动实验后，控制HUVEC层的细胞形态和完整性。

4. VWF释放的诱导和多面化VWF字符串的可视化

  1. 保持流量设置，因为需要 10 dyn/cm2的剪切应力来触发 VWF 到高达 200 MDa 的长串的多动化。将100 mM组胺溶液的136 μL注射到使用注射口在灌注管中循环的ECGMS-培养基中，诱导VWF从内皮WPB中释放。流动介质中组胺的最终浓度为1 mM。如果没有可用的注油口，可以通过移液到泵储液罐的介质中交替添加组胺。
  2. 对于多美化 VWF 字符串的免疫荧光检测，当储液罐中达到平衡的中位水平时停止流动，并将 20 μg 的 VWF 特异性 FITC 结合抗体注入 200 μL PBS （pH 7.4） 的循环 13.6 mL 中。使用喷射端口的 ECGMS 介质。如果没有可用的注射口，可以通过移液到泵储液罐的介质中交替添加抗体。这导致最终抗体浓度为1.3μg/mL。
  3. 对于在短时间内对多个视场进行微观扫描，请使用显微镜的荧光单元，使用具有 30% 功率的 Xenon 荧光装置和显微荧光相机。使用明亮场模式监视 HUVEC 图层的形状和形态，以选择适合 VWF 字符串可视化的代表性单元格。
  4. 要可视化绿色荧光 VWF 字符串，请在显微镜软件 （LasX） 的荧光单元菜单中选择 63x/1.40 油目标和 470 nm 检测过滤器。创建至少 50 个代表性字段视图的 Z 堆栈快照，每个视图包含大约 10 个形态完整的 HUVEC。为了在不同时间点定量绿色荧光VWF字符串，扫描多个视场。

5. 实时流中VWF字符串细菌附着的微观评价

  1. 通过免疫荧光检测，量化对HUVEC细胞表面产生的VWF字符串的肺炎球菌附件。
    1. 保持流量，并使用注射口将1.35 x 108 CFU/mL RFP表达肺炎球菌的最大体积为1 mL注入ECGMS介质。或者，将细菌移入泵储液罐中的介质中。以 10 dyn/cm2的速度重新启动剪切应力，让细菌在泵系统内循环。
    2. 选择 63x 油浸物，用于显微镜放大，并将显微镜软件中的荧光滤光片设置调整到 RFP 通道（540 nm 检测过滤器），以检测 RFP 表达性肺炎球菌。
    3. 为了量化对 VWF 字符串的细菌附件，停止流并创建至少 30 个代表性场视图的 Z 堆栈快照，每个视图包含大约 10 个形态完整的 HUVEC，并计算肺球菌的数量。
    4. 使用 ANOVA 单因子统计算法来评估数据，然后进行后两尾未配对的样本测试，以便进行详细的统计比较。<0.05 的 P 值被认为具有统计显著性。

6. 样品固定后对VWF字符串的细菌附着的微观评估

  1. 在免疫荧光染色前取样固定。
    1. 停止流量，从泵储液罐中取出 10 mL 的 ECGMS 介质，并添加 10 mL 的 PBS，并辅以 5% 的甲醛 （PFA）。让PFA溶液在10 dyn/cm2的剪切应力下循环10分钟。
    2. 断开通道滑块与泵单元的连接。
  2. 阻断细胞表面的未特异性结合位点，对VWF字符串和附着细菌进行免疫检测。
    1. 准备 4 mL 的洗涤溶液，含有 100 mM Na2CO3 （pH 9.2），并辅以 4% 蔗糖，用于所有洗涤步骤。制备含有100mM Na2CO3（pH 9.2）的阻断溶液1 mL，辅以4%蔗糖和2%牛血清白蛋白（BSA），用于阻断非特异性结合位点。
    2. 使用 1 mL Luer 注射器清洗 PFA 孵育通道滑道滑道 3x，注射 200 μL 的洗涤溶液，并在 RT 下用 200 μL 阻滞溶液孵育滑道 120 分钟。
    3. 准备4 mL的另一个阻断溶液含有100 mM Na2CO3，（pH 9.2）补充4%蔗糖和0.5%BSA，用于稀释抗体。使用这种阻断溶液的200μL稀释肺炎球菌特异性兔子抗血清1:100。使用这种阻断溶液的200μL稀释VWF特异性小鼠抗体1:50，使VWF特异性抗体浓度为4μg/mL。从2mg/mL库存溶液中稀释AlexaFluor488-偶联二级抗体，在200 μL的PBS（pH 7.4）中1:100，最终产生20微克/mL的最终浓度。
      注:在所述的免疫荧光设置中，当抗体在上述碱性碳酸盐缓冲液中稀释时，抗体检测可产生最佳结果。根据先前的结果，推荐的阻断溶液和抗体量适用于许多应用。然而，不同的实验可能需要单独优化抗体组合、抗体浓度、孵育时间和阻断缓冲液的组成。作为替代方案，具有中性pH范围的磷酸盐缓冲系统可能适合甚至优先作为孵化缓冲液。在荧光信号较弱的情况下，应增加二级抗体的浓度。如果检测到过多的非特异性荧光背景噪声，应增加阻滞物质的量。
    4. 对于 VWF 免疫荧光染色，使用 1 mL Luer 注射器注射 200 μL 的洗涤溶液 3x，用 1:50 稀释的 VWF 特异性抗体孵育滑道 30 分钟。洗涤溶液的μL，用1:100稀释的AlexaFluor488-结合小鼠特异性抗体在RT孵育幻灯片30分钟。最后，用200 μL的洗涤溶液再次清洗通道滑块3倍。
      注:AlexaFluor-荧光团对漂白很敏感。因此，在与荧光结合抗体的孵育步骤中，应将其保持在暗室中，从而保护幻灯片。
    5. 为了免疫检测肺炎球菌，在RT用1:100稀释肺炎球菌特异性兔子抗体孵育幻灯片30分钟。 之后，用200μL的洗涤溶液清洗通道幻灯片3x，用1:100稀释的幻灯片孵育幻灯片AlexaFluor568-结合兔特异性抗体在RT.用200 μL的洗涤溶液再次清洗通道滑动3倍。
    6. 要用荧光噬菌体染色细胞细胞骨架，在RT处用120μL的Triton X-100孵育5分钟，用120μL稀释1:1，000的滑道清洗通道幻灯片3x，孵育120μL的1:1，000张。亚历克萨弗洛350-结合的噬菌体。这个孵育步骤将可视化聚合行为素细胞骨架，并允许监测细胞形状和可能的应力引起的形态变化。
    7. 用 200 μL 的洗涤溶液清洗通道滑块 3x。最后，用200μL ddH2O清洗幻灯片4x，并使用荧光显微镜上适当的滤光片设置，可视化绿色荧光VWF字符串、红色荧光细菌和蓝色荧光行为素细胞骨架。

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结果

在恒定的单向流动中培养初级HUVEC，形成一个融合和紧密包装的细胞层，促进细胞WPB的生成，填充了对美氯介素VWF13，14。该协议描述了使用基于气压泵的无脉冲再循环系统的感染分析，需要模拟人类血流中的剪切应力情况。

该系统支持定义的软件控制流量条件设置。图1中的流方案说明了主要工作流程，从主?...

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讨论

模拟细菌与对美能敏感宿主蛋白（如 VWF）的相互作用，需要一个可渗透的细胞培养系统，该系统能够生成定义、单向和连续流动的液体，从而产生可靠的剪切应力.已经描述了几个微流体泵系统。Bergmann等人的综合综述总结了不同二维和三维细胞培养模型的关键方面17。

微流体技术是一种非常年轻的技术，始于20世纪90年代初，在微米甚至纳米尺?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

该项目由DFG（BE 4570/4-1）向S.B.提供资金。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-syringeFisher Scientific10303002with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringeSarstedt9077136For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
AccutaseeBioscience now thermo fisher00-4555-56protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated PhalloidinAbcamab176751no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibodyThermo Fisher SientificA11001stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibodyThermo Fisher ScientificA-11011stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-BrothBecton Dickinson GmbHBD 249210complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-25Gsolubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filterTPP90026subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12RBeckman Coulter Life Sciences392304spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30Beckman Coulter Life SciencesB06314spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MKHermle305.00 V05 - Z 216 Mspinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
ChloramphenicolCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3886.2used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubingibidi10821for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-IncubatorFisher ScientificMIDI 40incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-IncubatorSanyoMCO-18 AICfor incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar platesBecton Dickinson GmbHPA-254005.06agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
ComputerDellLatitude 3440Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)LeicaDMi8An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3904.1used for PBS buffer
Drying materialMerck101969orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement MixPromocellC-39215supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMSPromocellC-22010ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)PromocellC-22010culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)biochrome now MerckS 0415supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibodyAbcamab8822stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unitibidi10903fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG-1890-100gfor precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochlorideSigma AldrichH-7250-10MGfor induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)PromocellC-12203 Lot-Nr. 396Z042primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)Santa Cruzsc73268stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Portibidi10820for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscopeZeissAxiovert 35Minverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)ibidi80176physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)Sigma AldrichM7506-500GFor preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pumpibidi10905air pressure pump
Neubauer cell counting chamberKarl Hecht GmbH&Co KG40442002microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)Electron Microscopy Sciences15710-Sfor cross linking of samples
Perfusion Setibidi10964Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettesSarstedt67,741(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserumPinedaraised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam platethis is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe6781.1used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)ibidiv1.5.4Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mLSarstedt72.706/ 72.695.500required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volumeSarstedt6,25,48,004
RFP-expressing pneumococciNational Collection of Type Cultures, Public Health England10,319Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mLSarstedt86.1253.025/ 86.1254.025for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)Sigma Aldrich451614-25Gfor preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, KarlsruheP030.2used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22Biochrom80-2115-20measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
SucroseSigma AldrichS0389-500Gfor preparation of blocking buffer
Triton X-100Sigma AldrichT9284-500MLUsed in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extractoxoidLP0021bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY

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