זיהום פנאומטי של תאים אנושיים ראשוניים של האדם בזרימה קבועה

Summary

מחקר זה מתאר את הניטור המיקרוסקופית של הדבקות הפנקוקוס על מחרוזות וויללרנד של פון וילבלאנד המיוצר על פני השטח של תאים אנושיים מובחנים ראשוניים תחת לחץ הטיה בתנאי זרימה מוגדרים. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב להדמיה מפורטת של מבני תאים ספציפיים וכימות חיידקים על ידי החלת הליכי חיסוני דיפרנציאלי.

Abstract

אינטראקציה של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס עם פני השטח של תאים אנדותל מתווך בזרימת הדם באמצעות חלבונים מכניביים מרכיב כגון מקדם וויללמותג פון (vwf). גליקופרוטאין זה משנה את המבנה המולקולרי שלה בתגובה למתח ההטיה, ובכך חושף אתרי כריכה לקשת רחבה של מארחים ואינטראקציות. באופן כללי, הקפדה על תאי האנדותל הראשוניים תחת זרימת הטיה מוגדרת לקדם את הבידול התאי המסוים ואת היווצרות של שכבת אנדותל יציבה ומקושרת היטב הדומה לפיזיולוגיה של הציפוי הפנימי של כלי הדם . לפיכך, ניתוח פונקציונלי של אינטראקציות בין פתוגנים חיידקיים לבין הפונדקאי המארח מעורבים חלבונים מכנימים רגישים דורש הקמת מערכות משאבה שיכולות לדמות את כוחות הזרימה הפיסיולוגיים הידועים להשפיע על פני השטח של תאי כלי הדם.

המכשיר המיקרו-פלואידיג המשמש במחקר זה מאפשר הפעלה מתמשכת ורציפה של נוזלים עם קצב זרימה מוגדר. מערכת משאבת לחץ האוויר מבוקרת המחשב מחיל לחץ הטיה מוגדר על משטחי תא אנדותל על ידי יצירת זרימה רציפה, חד כיווני, בינונית ומבוקרת. שינויים מורפולוגיים של התאים והקבצים המצורפים החיידקיים יכולים להיות מנוטרים באופן מיקרוסקופי ולכמת בזרימה באמצעות שקופיות ערוץ מיוחדות המיועדות להדמיה מיקרוסקופית. בניגוד לזיהום התרבות התא סטטי, אשר באופן כללי דורש קיבעון לדוגמה לפני תיוג החיסונית ניתוחים מיקרוסקופיים, שקופיות microflu, מאפשר הן איתור מבוססי-פלואורסצנטית של חלבונים, חיידקים, ורכיבים סלולריים לאחר קיבעון דגימה; כתמים מוחיסורתיים; וגילוי מבוסס-פלואורסצנטית ישיר בזמן אמת. בשילוב עם חיידקים פלורסנט ונוגדנים ספציפיים המסומנים בקרינה פלואורסצנטית, זה הליך זיהום מספק מערכת יעילה מרובת רכיבים מרובים עבור ספקטרום עצום של יישומים מדעיים הקשורים תהליכים כלי דם.

Introduction

הפתוגנזה של זיהומים פנאומטי מאופיין באינטראקציה רבת-פנים עם מגוון של תרכובות מטריצות ורכיבים של המטאוסטזיס האנושי, כגון פלמיננוגן ו vwf^{1,2, . שלוש,ארבע,חמש,שש,שבע, שמונה} רב התחומים גליקופרוטאין VWF משמש כרגולטור מפתח של הומוסטאזיס מאוזנת על ידי גיוס thrombocyte מדיה ו התאגדות פיאין באתר של היווצרות כלי דם הטרובוס⁹. החשיבות של הפונקציונלי, VWF פעיל עבור שליטה דימום וריפוי הפצע הוא הפגינו על ידי המחלה של פון Willebrand, הפרעת דימום משותף הפרעה¹⁰.

כדורי vwf מסחררת במערכת הדם האנושי בריכוז של עד 14.0 μg/mL^11,10. בתגובה לפציעה וסקולרית, שחרורו המקומי של vwf על ידי הגופים האלה של weibel palade (wbp) גדל במידה ניכרת^11,12. מחקרים קודמים מראים כי הדבקות האנטי-קוקוס לתאי האנדותל של האדם והייצור של הנקבוביות היוצרות משאבה משמעותית מעוררת באופן משמעותי את הפרשת הלומיאל (VWF)¹³. הכוחות ההידרודינמיים של זרימת הדם גורמים לפתיחת מבנה של תחומים VWF מכנימים. בקצב זרימה של 10 דינמיקה/ס"מ² vwf multimerizes למחרוזות חלבון ארוך של עד כמה מיקרומטר באורך הנותרים מחוברים subאנדותל^10,12.

כדי להבין את הפונקציה של מחרוזות VWF מולטימzed שנוצר תחת לחץ הטיה באינטראקציה של אבקת הקוקוס עם משטח אנדותל, מבוססי microfluidic מבוסס תרבות התא הגישה זיהום הוקמה. התקן מיקרופלואידיג עם מערכת משאבת הלחץ על התוכנה בקרת האוויר שימש. פעולה זו איפשרה הפעלת מבנה חד-כיווני ורציף של מדיום תרבות התא עם קצב זרימה מוגדר. ובכך, המערכת החלה להדגיש הטיה מוגדרת על פני השטח של תאים אנדותל, אשר נשאר מחובר בתוך שקופיות הערוץ המקצועית. גישה זו אפשרה את הסימולציה של כוח ההטיה בתוך זרם הדם של מערכת כלי הדם של האדם, שבו מחרוזות VWF מופקים על תאים אנדותל מובחנים בתנאי זרימה קבועים מוגדרים. לצורך זה, תאי האנדותל מעובדים בשקופיות מסוימות של ערוצים (ראו טבלת חומרים), שהותאמה לניתוחים מיקרוסקופיים במהלך הזרימה. מערכת המשאבה microflu, מספק את המצב מאוד מוגדר ומבוקר לחץ להטות הנדרש עבור היווצרות של מחרוזות VWF המורחבת על שכבת התאים שוטפת של הרשת. לאחר הגירוי של VWF-הפרשה של האדם בוגר הטבור וריד בתאי הטבורי (HUVEC) על ידי תוספי היסטמין, היווצרות מחרוזת המושרה על ידי החלת מתח הטיה (ԏ) של 10 דינמיקה/cm². לחץ ההטיה מוגדר ככוח הפועל על שכבת התא. הוא מחושב בקירוב על פי הקורנית. אל¹⁴ עם משוואה 1:

כאשר ԏ = להטות את המתח בדינמיקה/cm², η = צמיגות ב (דינמיקה ∙ s)/cm², h = מחצית גובה הערוץ, w = חצי רוחב הערוץ, ו Φ = שיעור flowrate-mL/min.

התוצאה של משוואה 1 תלויה בגבהים וברוחב השונים של השקופיות השונות המשמשות (ראה טבלת חומרים). במחקר זה שקופית ערוץ luer של 0.4 יקרומטר והתוצאה היא גורם שקופית קאמרית של 131.6 שימש (ראה נוסחה 2).

צמיגות של המדיום ב 37 ° c הוא 0.0072 דינמיקה ∙ s/cm ² ו להטות את הלחץ של 10 דינמיקה/cm ² שימש. זה הביא לקצב הזרימה של 10.5 mL/min (ראה פורמולה 3).

כאן, הסתגלות וקידום של הליך מיקרופלואידיג תא culturing באמצעות מערכת זרימה חד-כיוונית למינארי עבור החקירה ויזואליזציה של מנגנוני זיהום חיידקי בתוך המארח המארחים מתואר בפירוט. הדור של מחרוזות VWF על שכבות אנדותל יכול להיות גם מגורה באמצעות מערכות משאבה אחרות, כי הם מסוגלים להחיל לחץ מתמשך ויציב להטות¹⁵.

לאחר הטיפוח של תאי האנדותל הראשוניים למפגש בזרימה וגירוי של היווצרות מחרוזות VWF, הבעת הופעת חלבון פלואורסצנט אדום (RFP)¹⁶ נוספו לשכבת התא האנדותל תחת שליטה מיקרוסקופית מתמדת. ההחזקה של חיידקים כדי vwf מחרוזות על פני השטח של תאים אנדותל היה מאכל דמיין והפיקוח עד שלוש שעות בזמן אמת על ידי שימוש ב-vwf ספציפי נוגדנים מתויג-פלורסנט. עם גישה זו, התפקיד של VWF כמו קופקטור הדבקה לקידום ההחזקה החיידקית של כלי הדם אנדותל היה נחוש⁸.

בנוסף להדמיה המיקרוסקופית של הפרשת החלבון והשינויים השונים, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לפקח על צעדים בודדים של תהליכי זיהום חיידקי בזמן אמת, כדי לכמת את כמות החיידקים המצורפים בנקודות זמן שונות של זיהום. מערכת ספציפית מבוקרת תוכנה מספקת גם את האפשרות לתרבות התאים האנדותל בתנאי זרימה קבועה מוגדר למשך עד מספר ימים ומאפשר הדגירה פעמו זרימה בינונית. כמו-כן, ניתן להחיל שיטה זו באמצעות סוגי תאים שונים. התאמת פרוטוקול הצביעת גם מאפשרת איתור והדמיה של חיידקים הפנימו לתוך תאים איקריוטית.

כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול הניסיוני המתקדם שניתן להשתמש בו כגישה מוגדרת, אמינה וניתנת ליישום לאפיון יעיל ותכליתי של תהליכים פתופסלוגיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הטיפוח-תרגול של התאים המיקרופלואידיג התבצע עם תאי הטבור העיקריים של העורק האנושי הראשי (HUVEC). החברה מבודדת את התאים עם הסכמה מושכלת של התורם. מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של הלשכה הרופאים של המדינה הפדרלית באדן-Wuerttemberg עם מספר הסימוכין 219-04.

הערה: ראה טבלת חומרים לאספקת פרוטוקולים.

1. טיפוח-תרגול של תאי האנדותל הראשוניים

1. הפשרת בקבוקון גליצרול קפוא המכיל 1 x 10⁵ HUVEC הראשי מתוך שלושה תורמים שונים בעדינות ב 37 ° צ' ו הזרע את התאים 7 מ ל של הצמיחה של תא אנדותל בינונית (ecgm, מוכן לשימוש עם תוספי) ב 25 ס מ² תא בקבוקון.
   הערה: התאים האנדותל העיקריים מאבדים את יכולת הבידול לאחר יותר מ -5 מחזורי הפצה. לכן, רק תאים עם פחות מ 5 מעברים ניתן להשתמש אם ציונים גבוהים של בידול התא נדרשים.
2. לטפח את התאים ב 37 ° c ב 5% CO₂ אווירה עבור 60 דקות כדי לאפשר מצורף משטח ולהחליף את המדיום תרבות תא ecgm כדי להיפטר שאריות מהקפאה.
3. המשך לשלב את התאים בשעה 37 ° c_{באווירה של} 5% שכונתיות עד שהם יוצרים שכבת תא תת-שוטפת.
   הערה: ה-HUVEC אינו צריך לצמוח לשכבה שוטפת מאז שאנשי הקשר הצמודים לתאי התא מונעים היווצרות שכבת תא יציבה בהמשך הזרימה.

2. טיפוח-תרגול של סטרפטוקוקוס

אזהרה: דלקת ריאות סטרפטוקוקוס היא ברמת בטיחות 2 סוכן והוא מותר רק להיות תרבותי ב אבטחה טיחות רמת 2 מעבדות. השתמש ספסל נקי מסווג עבור רמת בטיחות 2 עבור כל הטיפולים חיידקי, להימנע בקפדנות היווצרות תרסיס, ולהשתמש צנטריפוגה עם הגנה תרסיס לשקעי חיידקים.

1. אינוחסן דם קולומביה צלחת אגר עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס בידוד ATCC11733 נגזר מתוך מניות גליצרול מאוחסן כל הזמן ב-80 ° c ולטפח את הצלחת אגר לילה ב 37 ° צ' ו 5% CO₂.
2. הכינו 40 מ ל של מרק נוזלי של טוד יואיט בתוספת תמצית שמרים 1% (שלך) ו 15 מ ל של מלוחים סטרילי באגירה פוספט (PBS) pH 7.4, לטיפוח בקטריאלי ושטיפת שלבים.
3. השתמשו בצינור סטרילי לטיפוח חיידקי ומשתמשים בציר התרבות הנוזלי עם מסה חיידקית. שלוט על כמות החיסונים במדידה של 1 מ ל ב600 ננומטר נגד מרק נוזלי שאינו מחוסן כהפניה. מילוי מסה חיידקית לתוך המרק הנוזלי עד שהוא מגיע לדחיסות אופטית ב 600 ננומטר (OD₆₀₀) של 0.15.
4. משחיז את המרק הנוזלי מחוסן מבלי לרעוד ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ ולקבוע את OD₆₀₀ כל 30 דקות על ידי מדידת 1 mL הalits באמצעות כימיקלים פלסטיק.
5. ברגע התרבות החיידקית הגיע OD₆₀₀ של 0.4, אשר מתאים לשלב הגידול האקספוננציאלי, צנטריפוגה את השעיית התרבות החיידקית עבור 10 דקות ב 1,000 x g בטמפרטורת החדר (RT).
   הערה: אל תאפשר התרבות הפנאומטי כדי להגיע OD₆₀₀ של יותר מ 1.0, כי צפיפות התרבות הגבוהה והפנאומטי הגבוה ידוע להפעיל את הקישור החיידקי בקטריאלי, אשר עשוי להשפיע על הכושר הכולל חיידקי.
6. להשעות משקע חיידקי בעדינות עם 10 מ"ל PBS ו משקע שוב עבור 10 דקות ב 1,000 x g ב RT.
7. מחדש את המשקעים בקטריאלי שטף בעדינות ב 1 מ ל PBS ולקבוע את OD₆₀₀ של 10 μl של ההשעיה חיידקי באמצעות 1 ML של PBS כהפניה.
8. להתאים את כמות החיידקים ב-PBS ל-OD₆₀₀ של 2.0. לדברי לשעבר ספירת חיידקים נקבע, OD₆₀₀ של 2.0 מתאים 2 x 10⁹ המושבה היוצרים יחידות (cfu). מיד להמשיך עם ההליך זיהום כדי למנוע אוטומטית בקטריאלי.

3. טיפוח תאי האנדותל של HUVEC בתנאים מיקרו-פלואידידים

1. נתק את תאי האנדותל העיקריים מהבקבוקון של תרבות התא על ידי פרוטפוליזיס נשלט. בצע את השלבים הבאים בסביבה סטרילית באמצעות ספסל נקי. הכינו נפח של 15 מ ל של PBS סטרילי עבור שלבי הכביסה.
   1. הסר את ה-ECGM משכבת-HUVEC הגדלה באופן שוטף ושטוף את שכבת התאים עם 10 מ ל PBS באמצעות פיפטה סרוולוגית כדי להיפטר ממדיום תרבות התא.
   2. המלון משלב את שטיפת HUVEC עם 3 מ ל של 37 מעלות צלזיוס של פתרון הדיסוציאציה לניתוק תאים עבור 5 דקות ב 37 ° c. שימו לב לניתוק התא של הפרוטחרדה על ידי ניטור מיקרוסקופי בכל דקה.
   3. פיפטה תא מנותק הבולם לתוך צינור המכיל 7 מ ל של ECGM בתוספת 2% סרום עגל עוברי (FCS) עבור עצירת הפרוטפוליזיס משקע את התאים עבור 3 דקות ב 220 x g ב RT.
   4. הסר את supernatant ולהשעות מחדש את HUVEC ב 250 μL של ECGM שיושלם עם 5% FCS ו 1 מ"מ MgSO₄. השתמש 10 μL של השעיית התא עבור ספירת תאים באמצעות תא Neubauer אואר לספור ולהתאים את ספירת התא כדי 4 x 10⁶ תאים/ML ecgm בתוספת 5% fcs ו 1 מ"מ MgSO₄.
      הערה: עבור כל ניסוי זרימה 30 מ ל של ECGM בינונית שיושלם עם 5% FCS עם 1 mM MgSO₄ יידרש. מכאן על הרכב בינוני זה נקרא ECGMS-בינונית. הגידול של ריכוז FCS במדיום התרבות מ 2% כדי 5% תומך תא מצורף והכדאיות התא של HUVEC שופרה בשקופית הערוץ. תוספי מדיום FCS ו MgSO₄ לייצב באופן משמעותי את התא המצורף של HUVEC תחת תנאי לחץ הטיה.
2. הזרע ולטפח את HUVEC בשקופית הערוץ. לעבוד בסביבה סטרילית באמצעות ספסל נקי. התאים יהיו מעובדים תחת לחץ הטיה עבור 2 ימים ואחריו זיהום עם חיידקים ניטור מיקרוסקופיים עבור אחר 2 h.
   1. שקופית ערוץ, מערכת זלוף 1.6 מ"מ קוטר ו 50 ס"מ אורך, סדרת מחלקים של ecgms-medium, ו luer ערוץ שקופית 0.4 יקרומטר בגובה, עבור 24 h בחממה עם 5% CO₂ אווירה ב 37 ° צ' כדי להקטין את מספר בועות האוויר.
      הערה: הליך זה מומלץ לדגה את הציוד הפלסטי ולחמם את המדיום, את צינורות ההיתוך ואת המאגרים. אם החומרים או הנוזלים אוחסנו ב-RT או במקרר, הגזים המומסים בפלסטיק ובנוזלים ישוחררו כאשר הם ייתחממו בחממה במהלך הניסוי. בועות הגז יופיעו לאחר מכן. מנטרל את כל רכיבי הפלסטיק לפני הניסוי יבטל את האפקט הזה. בכל פעם שהמערכת נלקחת מהאינקובטור, תהליך קליטת הגז מתחיל שוב. לכן, לעבוד במהירות ב-RT ולעולם לא להשאיר את יחידת פלואידים מחוץ לחממה לפרקי זמן ארוכים יותר.
   2. השתמש בפיפטה כדי להזריק 100 μL של 2% בתמיסה סטרילית מסוננת של הג בפתרון PBS לתוך אחד המאגרים של שקופית ערוץ טמפרטורה. מודיית את הג-פתרון עבור 1 h ב 37 ° צ' ולשטוף את הערוץ של השקופית עם 1 mL PBS בתנאים סטרילי באמצעות 1 mL מזרק Luer.
   3. הצב את שקופית הערוץ המצופה בג בקלקר דק או בצלחת קלקר כדי למנוע ירידה בטמפרטורת השקופית. הוסף 100 μL של 4 x 10^6/Mlההשעיה HUVEC עם מזרק 1 ML luer לתוך השקופית.
      הערה: הצבת שקופית הערוץ על משטח המתכת הקר של הספסל הנקי עלולה להקטין את הטמפרטורה של תחתית השקופית, ובכך ליצור לחץ קר לתאי האנדותל. במהלך ליטוף התא ללטף את השקופית קצת למעלה כדי לתת בועות אוויר לעלות ולהיעלם מתוך השקופית.
   4. דגירה שקופית הערוץ עם HUVEC עבור 60 דקות ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ ולמלא את המאגרים בינוניים בשני הקצוות של שקופית הערוץ עם 60 ΜL ecgms-בינוני כל. מודטה עבור 1 h ב 37 ° צ' ו 5% CO₂.
3. כוונן את המשאבה המיקרופלואידיג ואת הגדרות התוכנה.
   1. חבר את הפרפיוז הבינוני שנקבע ליחידת המשאבה, מילוי עם 13.6 mL של ECGMS-medium, והפעל את תוכנת בקרת המשאבה. בחר את ערכת המיזוג הנאותה ואת סוג השקופית הקאמרית באמצעות הגלילה למטה החלונות בתפריט של יחידת פלואידים להגדיר. בחר 0.007 (דינמיקה ∙ s/cm²) בתוכנה עבור צמיגות בינונית. (עיין בהגדרות התוכנה של משאבת הלחץ המסומנות בחיצים אדומים באיור המשלים 1).
   2. מחוץ לחממה, לחבר בקבוק זכוכית מלא עם מחרוזת סיליקה לייבש צינורות לחץ אוויר (להתייחס לאיור 1, שיבוץ 3). האוויר של משאבת הלחץ מסתובב בין המאגרים זלוף ואת המשאבה צריך להיות יבש לפני הכניסה מחדש למכשיר המשאבה. בחר פרמטרי זרימה בתפריט תוכנה, להגדיר את הלחץ 40 mbar, ולשטוף את צינורות המשאבה עם המדיום הנוזלי על ידי הפעלת זרימה בינונית רציפה. (הגדרות אלה מסומנות גם על ידי חיצים אדומים באיור המשלים 1).
   3. התוכנית הרצויה להטות את הלחץ מחזורים של טיפוח הזרימה. התחל עם 5 דינמיקה/cm², בקרת מאגר מאוזנת דלעת ולהבטיח כי אין בועות אוויר במחזור במערכת המשאבה.
      הערה: הקיר להטות את המתח בשקופית הערוץ תלוי בקצב הזרימה ואת צמיגות של המדיום זלוף. אם השימוש במערכת משאבה אחרת, עיין במשוואות המתוארות במבוא לקביעת קצב זרימה היוצר את רמת הסטרס הרצויה של ההטיה. ההגדרות המתוארות מתאימות לקצב הזרימה של 5.42 mL/min. (צילום מסך למופת המציג את הגדרות הפרמטרים של הזרימה הנאותה בתוכנת משאבת הלחץ מופיעה באיור המשלים 2).
   4. להפסיק את זרימת הזרימה בתוכנת בקרת המשאבה ולהחזיק את הזרימה הבינונית בצינורות זלוף על ידי לולאה את הצינורות ליד חיבורי luer. חבר את שקופית הערוץ, ובכך למנוע בועות אוויר, ולמקם את יחידת flu, עם שקופית הערוץ המחובר ב-CO₂ חממה ב 37 ° c ו 5% CO₂. הפעל את לחץ ההטיה ב-5 דינמיקה/cm² עבור 30 דקות כדי להתאים בצורה חלקה את התאים לכוחות שנוצרו על-ידי לחץ ההטיה לפני האצת רמת הלחץ ההטיה (ראה איור 3).
      הערה: לדאוג כי לא יישארו בועות אוויר במערכת הצינורית או בשקופית לאחר התחברות למערכת הצינורית, מכיוון שהתנועה של בועות אוויר בזרם עלולה להוביל לניתוק תאים.
   5. להאיץ את המתח להטות ל 10 דינמיקה/cm² (אשר מתאים 10.86 mL/min בהגדרה זו של זרימה) ו מודקת שקופית הערוץ במתח הטיה רציפה עבור 48 h ב חממה קטנה CO₂ ב 37 ° צ' ו 5% co₂ כדי לאפשר בידול התא ( settinngs תוכנה בהתאמה מצוינים עם חיצים אדומים באיור המשלים 4).
      הערה: תאים HUVEC נוטים להתנתק ממשטח הערוץ אם טיפוח הזרימה החלה ישירות ב 10 דינמיקה/cm². התאים נשארים מחוברים למשטח החדר אם טיפוח הזרימה מתחיל עם פחות מתח הטיה באמצעות 5 דינמיקה/cm² עבור מינימום של 30 דקות ואחריו על ידי הגדלת הלחץ הטיה לאט עד הרצוי 10 דינמיקה/cm². מתח הטיה של 10 דינמיקה/cm² הוא הערך המינימלי בהגדרת הפרזיה הנדרשת עבור היווצרות מחרוזת vwf.
   6. לאחר 24 שעות של טיפוח תא microflu, לעצור את הזרימה בינונית עם תוכנת בקרת המשאבה בדיוק כאשר רמת בינונית מאוזנת מתמלאת בשני מאגרים בינוניים. הניחו את יחידת הפלואידיג בספסל נקי והסירו 10 מ ל של מדיום הטיפוח-תרגול של מאגרי הפרזיה בעזרת מצפטה בגודל 10 מ ל. הוסף 10 מ ל של ECGMS-בינוני לתוך המאגרים כדי לחדש את המדיום, למקם את יחידת פלואידיג חזרה לתוך החממה CO₂ ב 37 ° צ' ו 5% CO₂, והפעל מחדש את הטיפוח flu, באמצעות תוכנת בקרת המשאבה.
      הערה: הפונקציה של משאבת הלחץ יכול לפתע להיות מופרת על ידי מכונות מעבדה כגון צנטריפוגות גדולות, אשר עשוי ליצור הפרעה שדה חזק מגנטי. ההפרעה הפתאומית הזאת. עלולה להוביל לניתוק תאים לדאוג כי מכונות כאלה אינם פעילים ליד משאבת הלחץ במהלך הניסוי.
   7. התחילו את ההתחממות המוקדמת של תא הדגירה של הטמפרטורה המכסה את השלב של המיקרוסקופ הפלואורסצנטית ל 37 ° c עבור טמפרטורה לרמה 24 שעות לפני ההדמיה המיקרוסקופית. לאחר המיקרוסקופ הוא מראש, להתחיל את השליטה בתוכנה מיקרוסקופ ולהתאים את ההגדרות העיקריות עבור ניטור מיקרוסקופיים פלואורסצנטית על ידי בחירת הגדרות מסנן המתאים (540 nm/590 nm לאיתור של חיידקים RFP הביע 470 nm/515 ננומטר לאיתור פליטת fluorescein של נוגדנים בעלי FITC-מצופיסגור-ספציפי. לחמם תא חימום נוסף לדגירה של יחידת הפלואידיג ב 37 ° c.
      הערה: במהלך ניתוחי זיהום וניטור מיקרוסקופיים את הטמפרטורה של שקופית הערוץ ואת המדיום במחזור לא צריך להקטין באופן משמעותי, כי זה יהיה לייצר לחץ קר על התאים. באופן כללי, הגודל של תאי הטמפרטורה המכסה את המיקרוסקופ אינו מספיק כדי לכסות את כל יחידת הפלואידיג. לכן, מומלץ להשתמש בחדר חימום נוסף שחומם ל37 מעלות צלזיוס.
   8. להדמיה מיקרוסקופית, הציבו את יחידת הפלוטואידים בחדר החימום הקדם-ממדי של 37 ° c והציבו את שקופית הערוץ בשלב של 37 ° c מיקרוסקופ מראש.
      הערה: להדמיה מיקרוסקופית, יחידת הפלואידיג ושקופית הערוץ הדרושים להסרה מאינקובטור של CO₂ בשל האורך המוגבל של אבובים הפרזיה. אם זמני זיהום וניטור מיקרוסקופיים יותר מ 180 דקות נדרשים מחוץ 5% CO₂ האטמוספירה עבור pH אגירה, מדיום באגירה ph צריך לשמש לטיפוח מיקרופלואידיג.
   9. לשלוט על מורפולוגיה התא ואת היושרה של שכבת HUVEC לפני הזרקה של היסטמין וחיידקים למחזור זרימת לאורך זמן ניסוי הזרימה ולאחר סיום ניסוי הזרימה באמצעות מצב שדה בהיר של המיקרוסקופ.

4. אינדוקציה של VWF-שחרור והדמיה של מיתרים VWF מולטימאד

1. לשמור על הגדרת הזרימה, כי לחץ ההטיה של 10 דינמיקה/cm² נדרש כדי להפעיל את המולטימטיזציה של vwf למחרוזות ארוכות של עד 200 מד א. לזרז את שחרורו של vwf מ-wpb אנדותל על ידי הזרקת 136 μl של 100 mM היסטמין פתרון מניות לתוך מחזורי ecgms-בינוני בצינורות זלוף באמצעות יציאת הזרקה. הריכוז הסופי של היסטמין. במדיום הזורם יהיה 1 מ"מ אם אין יציאת הזרקה זמין, היסטמין ניתן להוסיף לחילופין על ידי ליטוף לתוך המדיום של מאגרי המשאבה.
2. עבור האבחון של מחרוזות VWF החיסונית של multimerized, לעצור את הזרימה כאשר רמת בינונית מאוזנת במאגרים הוא הגיע, ולהזריק 20 μg של נוגדן מצומת VWF ספציפי בנפח של 200 μL PBS (pH 7.4) לתוך במחזור 13.6 mL של ECGMS-בינוני באמצעות יציאת הזרקה. אם אין יציאת זריקה זמינה, את הנוגדן ניתן להוסיף לחילופין על ידי ליטוף לתוך המדיום של מאגרי המשאבה. התוצאה היא ריכוז נוגדן הסופי של 1.3 μg/mL.
3. עבור סריקה מיקרוסקופית של מספר שדות של תצוגה בתוך זמן קצר, השתמש ביחידת הזריחה של המיקרוסקופ עם מכשיר פלואורסצנטית קסנון ב 30% כוח מצלמה אפיפלואורסצנטית. נטר את הצורה ואת המבנה של שכבת HUVEC עם מצב שדה בהיר כדי לבחור תאים מייצגים מתאים הדמיה VWF-מיתרים.
4. עבור ויזואליזציה של מחרוזות VWF פלורסנט ירוק, בחר מטרת שמן 63 x/1.40 ומסנן זיהוי nm 470 ננומטר בתפריט היחידה הפלואורסצנטית של תוכנת המיקרוסקופ (LasX). צור תמונות של Z-ערימות של לפחות 50 התצוגות של שדה הנציג, כל אחד המכיל כ 10 HUVEC ללא שינוי מורפולוגית. לקוונפיקציה של מחרוזות VWF פלורסנט ירוק בנקודות זמן שונות, לסרוק כמה שדות של תצוגה.

5. מיקרוסקופיים הערכה של מצורף חיידקי VWF-מיתרים זורם בזמן אמת

1. לכמת את האביזר הפנאומטי ל-VWF-מיתרים שנוצרו על משטחי תא HUVEC באמצעות זיהוי immunofluorescence.
   1. להחזיק את הזרם ולהזריק 1.35 x 10⁸ cfu/ML rfp-הביע פנאומטי בנפח מרבי של 1 mL לתוך ECGMS-בינונית באמצעות יציאת ההזרקה. לחילופין, פיפטה את החיידקים לתוך המדיום במאגר המשאבה. הפעל מחדש את הלחץ הטיה ב 10 דינמיקה/cm² כדי לאפשר לחיידקים לזרום בתוך מערכת המשאבה.
   2. בחר 63 x מטרת הטבילה שמן להגדלה מיקרוסקופ ולהתאים את הגדרות מסנן הזריחה בתוכנת המיקרוסקופ ל-RFP-ערוץ (540 לזיהוי ננומטר מסנן) לאיתור של RFP-הביע פנאומטי.
   3. עבור כימות של החזקה בקטריאלי למחרוזות VWF, לעצור את הזרימה וליצור תמונות של Z-ערימות של לפחות 30 השדה הנציג תצוגות, כל אחד המכיל כ 10 מורפולוגית ללא פגע HUVEC, ולספור את כמות הפנאומטי.
   4. השתמש באלגוריתם הסטטיסטיקה של העצרת הראשונה של ANOVA כדי להעריך את הנתונים, ולאחר מכן בדיקת דגימה דו-זנבית בעלת שני הזנב לאחר השוואה סטטיסטית מפורטת. ערכי P של < 0.05 נחשבו משמעותיים מבחינה סטטיסטית.

6. הערכה מיקרוסקופית של בקטריאלי מצורף ל VWF-מיתרים לאחר קיבעון לדוגמה

1. לדגום את הקיבעון לפני. הצביעת האימונולוורנציה
   1. לעצור את הזרימה, להסיר 10 מ ל של ECGMS-בינוני מתוך מאגרי המשאבה, ולהוסיף 10 מ ל של PBS שיושלם עם 5% פאראפורמלדהיד (בתחתית). תן את הפתרון הדינמיקה לזרום 10 דקות במתח הטיה של 10/cm².
   2. נתק את שקופית הערוץ מיחידת המשאבה.
2. חסום אתרי קשירה לא ספציפיים על משטח התא ובצע זיהוי חיסוני של מחרוזות VWF וחיידקים מצורפים.
   1. הכינו 4 מ ל של פתרון כביסה המכיל 100 mM Na₂CO₃ (pH 9.2) שיושלם עם 4% סוכרוז עבור כל שלבי הכביסה. הכינו 1 מ ל של פתרון חסימה המכיל 100 mM Na₂CO₃ (pH 9.2) שיושלם עם 4% סוכרוז ו 2% בסרום בקון אלבומין (bsa) עבור חסימת אתרי איגוד לא ספציפי.
   2. לשטוף את השקופית התחתית הערוץ 3x שקופית באמצעות 1 mL מזרק Luer להזריק 200 μL של פתרון כביסה ומארג השקופית עבור 120 דקות בשעה RT עם 200 μL חסימת פתרון.
   3. הכן 4 מ מ של פתרון חוסם אחר המכיל 100 mM Na₂CO₃, (pH 9.2) שיושלם עם 4% סוכרוז ו 0.5% bsa עבור דילול של נוגדנים. השתמש 200 μL של פתרון חוסם זה כדי לדלל את הנסיוב האנטי-קוקוס הספציפי לארנב 1:100. השתמש ב-200 μL של פתרון חוסם זה כדי לדלל את הנוגדן VWF-ספציפי העכבר 1:50 כדי להפוך את ריכוז הנוגדן הספציפי VWF של 4 μg/mL. לדלל את הנוגדן משני AlexaFluor488 מצותת מ 2 מ"ג/mL פתרון מניות 1:100 ב 200 μL של PBS (pH 7.4) כדי ליצור ריכוז סופי של 20 μg/mL.
      הערה: ב הגדרות החיסונית המתוארת, זיהוי נוגדנים נמסר תוצאות אופטימליות כאשר הנוגדנים היו מדולל במאגר פחמתי אלקליין הנ ל. בהתבסס על תוצאות קודמות, הפתרונות החוסמים המומלצים וכמות הנוגדנים מתאימים ליישומים רבים. עם זאת, ניסויים שונים עשויים לדרוש אופטימיזציה אינדיבידואלית של שילוב הנוגדן, הנוגדן ריכוז, זמן דגירה, והחוקה של המאגר חוסם. כחלופה, מערכת פוספט באגירה עם טווח pH נייטרלי יכול להיות מתאים או אפילו מועדף כמו מאגר דגירה. במקרה של אותות זריחה חלשה, הריכוז של נוגדנים משני צריך להיות מוגבר. אם מזוהה יותר מדי רעש של רקע בלתי מוגדר, כמות חומרי החסימה צריכה להיות מוגברת.
   4. עבור VWF-אימונוofor, כתמים לשטוף את שקופית הערוץ באמצעות 1 מ"ל Luer מזרק על ידי הזרקת 200 μL של פתרון כביסה 3x ו-מודלת את השקופית 1:50 באמצעות נוגדן VWF מדולל ספציפי עבור 30 דקות ב-RT. לאחר מכן, לשטוף את שקופית הערוץ שוב 3x עם 200 μL של הפתרון כביסה ו-מעכלת את השקופית עם 1:100 מדולל AlexaFluor488-מעלה נוגדן העכבר עבור 30 דקות ב RT. לבסוף, לשטוף את שקופית הערוץ שוב 3x עם 200 μL של פתרון כביסה.
      הערה: האלכאפילואור-פלואורואופהורס רגישים ללבנה. לכן, השקופית צריכה להיות מוגנת על ידי שמירה על הבית בחדר חשוך במהלך שלבי הדגירה עם הנוגדנים מצופפור.
   5. עבור זיהוי חיסוני של הינע הפנאומטי, מודלת את השקופית עם נוגדן הארנב הספציפי 1:100 מדולל-קוקוס עבור 30 דקות ב-RT. לאחר מכן, לשטוף את שקופית ערוץ 3x עם 200 μL של פתרון כביסה ו מודלת את השקופית עם 1:100 מדולל AlexaFluor568-מעלה נוגדן ספציפי לארנב עבור 30 דקות at RT. לשטוף את שקופית הערוץ שוב 3x עם 200 μL של פתרון כביסה.
   6. כדי להכתים את שלד אקטין הסלולר עם phalloidin, החדיר של huvec על ידי דגירה עם 120 μl של 0.1% טריטון X-100 עבור 5 דקות ב RT. לשטוף את שקופית ערוץ 3x עם 200 μl של פתרון כביסה ומודלת את השקופית עם 120 μl של 1:1000 מדולל . AlexaFluor350. שלב הדגירה הזאת יהיה להמחיש את שלד ציטוטין הפילמור ולאפשר ניטור של הצורה ואת הלחץ אפשרי המושרה שינויים מורפולוגיים.
   7. לשטוף את שקופית ערוץ 3x עם 200 μL של פתרון כביסה. לבסוף, לשטוף את השקופית 4x עם 200 μl ddh₂O ו לדמיין את מחרוזות vwf ירוק פלורסנט, החיידק פלורסנט אדום, ואת השלד הכחול פלורסנט אקטין באמצעות הגדרות המסנן המתאים על המיקרוסקופ ניאון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

Culturing הראשי huvec בזרימה חד כיווני מתמדת היווצרות שכבת התאים הקשורים וגדוש בחוזקה המקדם את הדור של wpbs הסלולר ממולא vwf המכונה הרגיש^13,14. פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת המבוססת על לחץ אוויר מבוסס על משאבה, לניתוח זיהום המחייב לחקות את המצב לחץ ההטיה בזרימת הדם ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הדמיה של אינטראקציה חיידקית עם חלבונים מארחים רגישים מכונאי כגון VWF דורש מערכת התרבות התא המכונה המאפשרת את הדור של זרימה מוגדרת, חד כיווני, רציפה של נוזלים, ובכך לייצר מאמץ הטיה אמין . כמה מערכות משאבות מיקרופלואידיסי כבר תוארו. סקירה מקיפה של ברגמן ואח ' מסכמת את ההיבטים המרכזיים של מודלי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-syringe	Fisher Scientific	10303002	with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe	Sarstedt	9077136	For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase	eBioscience now thermo fisher	00-4555-56	protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin	Abcam	ab176751	no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody	Thermo Fisher Sientific	A11001	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11011	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-25G	solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter	TPP	90026	subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R	Beckman Coulter Life Sciences	392304	spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK	Hermle	305.00 V05 - Z 216 M	spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing	ibidi	10821	for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator	Fisher Scientific	MIDI 40	incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-Incubator	Sanyo	MCO-18 AIC	for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar plates	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer	Dell	Latitude 3440	Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)	Leica	DMi8	An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3904.1	used for PBS buffer
Drying material	Merck	101969	orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix	Promocell	C-39215	supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMS	Promocell	C-22010	ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)	Promocell	C-22010	culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)	biochrome now Merck	S 0415	supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody	Abcam	ab8822	stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit	ibidi	10903	fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)	Sigma Aldrich	G-1890-100g	for precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochloride	Sigma Aldrich	H-7250-10MG	for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)	Promocell	C-12203 Lot-Nr. 396Z042	primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)	Santa Cruz	sc73268	stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port	ibidi	10820	for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope	Zeiss	Axiovert 35M	inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)	ibidi	80176	physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)	Sigma Aldrich	M7506-500G	For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump	ibidi	10905	air pressure pump
Neubauer cell counting chamber	Karl Hecht GmbH&Co KG	40442002	microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710-S	for cross linking of samples
Perfusion Set	ibidi	10964	Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)			the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes	Sarstedt	67,741	(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum	Pineda		raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate			this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	6781.1	used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)	ibidi	v1.5.4	Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mL	Sarstedt	72.706/ 72.695.500	required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volume	Sarstedt	6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci	National Collection of Type Cultures, Public Health England	10,319	Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mL	Sarstedt	86.1253.025/ 86.1254.025	for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)	Sigma Aldrich	451614-25G	for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	P030.2	used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22	Biochrom	80-2115-20	measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G	for preparation of blocking buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-500ML	Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract	oxoid	LP0021	bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY