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Resumen

Este estudio describe el monitoreo microscópico de la adherencia del neumococo a las cadenas del factor von Willebrand producidas en la superficie de células endoteliales primarias humanas diferenciadas bajo tensión de cizallamiento en condiciones de flujo definidas. Este protocolo se puede extender a la visualización detallada de estructuras celulares específicas y cuantificación de bacterias mediante la aplicación de procedimientos de inmunoinso diferencial.

Resumen

La interacción de Streptococcus pneumoniae con la superficie de las células endoteliales se media en el flujo sanguíneo a través de proteínas sensibles al mecanosensible como el Factor Von Willebrand (VWF). Esta glicoproteína cambia su conformación molecular en respuesta al estrés de cizallamiento, exponiendo así sitios de unión para un amplio espectro de interacciones huésped-ligand. En general, el cultivo de células endoteliales primarias bajo un flujo de cizallamiento definido es conocido por promover la diferenciación celular específica y la formación de una capa endotelial estable y estrechamente vinculada que se asemeja a la fisiología del revestimiento interno de un vaso sanguíneo . Por lo tanto, el análisis funcional de las interacciones entre patógenos bacterianos y la vasculatura huésped que involucra proteínas mecanósensitiveas requiere el establecimiento de sistemas de bombeo que puedan simular las fuerzas de flujo fisiológico que se sabe que afectan a la superficie de células vasculares.

El dispositivo microfluídico utilizado en este estudio permite una recirculación continua y sin pulsos de fluidos con un caudal definido. El sistema de bomba de presión de aire controlado por ordenador aplica una tensión de cizallamiento definida en las superficies de células endoteliales mediante la generación de un flujo medio continuo, unidireccional y controlado. Los cambios morfológicos de las células y la unión bacteriana se pueden monitorear y cuantificar microscópicamente en el flujo mediante el uso de diapositivas de canal especiales que están diseñadas para la visualización microscópica. A diferencia de la infección por cultivo celular estático, que en general requiere una fijación de muestraantes antes del etiquetado inmune y los análisis microscópicos, las diapositivas microfluídicas permiten tanto la detección basada en fluorescencia de proteínas, bacterias y componentes celulares después de la fijación de la muestra; inmunofluorescencia en serie; y detección directa basada en fluorescencia en tiempo real. En combinación con bacterias fluorescentes y anticuerpos específicos etiquetados con fluorescencia, este procedimiento de infección proporciona un sistema de visualización de múltiples componentes eficiente para un gran espectro de aplicaciones científicas relacionadas con los procesos vasculares.

Introducción

La patogénesis de las infecciones por neumococo se caracteriza por una interacción multifacética con una diversidad de compuestos de matriz extracelular y componentes de la hemostasia humana, como el plasminógeno y el VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. El VWF multidominio de glicoproteína sirve como regulador clave de una hemostasis equilibrada mediante la mediación del reclutamiento de trombocitos y la incorporación de fibrina en el sitio de formación de trombos vasculares9. La importancia del VWF funcional y activo para el control del sangrado y la cicatrización de heridas se demuestra en la enfermedad de von Willebrand, un trastorno hemorrágico hereditario común10.

Globular VWF circula en el sistema sanguíneo humano a una concentración de hasta 14,0 g/ml11,10. En respuesta a la lesión vascular, la liberación local de FVW por parte de los cuerpos endoteliales de palademán de Weibel (WBP) se incrementa notablemente11,12. Estudios anteriores muestran que la adherencia del neumococo a las células endoteliales humanas y su producción de la toxina formacional de poros neumolisina estimula significativamente la secreción luminal de VWF13. Las fuerzas hidrodinámicas del flujo sanguíneo inducen una apertura estructural de los dominios de VWF mecanoresponsive. A caudales de 10 dyn/cm2 el VWF multimerizes a cadenas de proteínas largas de hasta varios cientos de micrómetros de longitud que permanecen unidos al subendotelio10,12.

Para comprender la función de las cadenas multimerizadas de VWF generadas bajo tensión cortante en la interacción del neumococo con la superficie endotelial, se estableció un enfoque de infección del cultivo celular basado en microfluidos. Se utilizó un dispositivo microfluídico con un sistema de bomba de presión de aire controlado por software. Esto permitió una recirculación continua y unidireccional del medio de cultivo celular con un caudal definido. De este tipo, el sistema aplicó una tensión cortante definida en la superficie de las células endoteliales, que permanecía unida dentro de diapositivas de canal especializadas. Este enfoque permitió la simulación de la fuerza cortante dentro del torrente sanguíneo del sistema vascular humano, en el que las cadenas VWF se generan en células endoteliales diferenciadas en condiciones de flujo constante definidas. Para ello, las células endoteliales se cultivaron en diapositivas de canal específicas (ver Tabla de Materiales),que fueron adaptadas para análisis microscópicos durante el flujo. El sistema de bomba microfluídica proporcionó la situación de tensión de cizallamiento altamente definida y controlada necesaria para la formación de cadenas VWF extendidas en la capa de células endoteliales confluentes. Después de la estimulación de la secreción de VWF de las células endoteliales de venas umbilicales humanas cultivadas confluentes (HUVEC) por la suplementación con histamina, la formación de cuerdas fue inducida mediante la aplicación de una tensión de cizallamiento (o) de 10 dyn/cm2. La tensión de cizallamiento se define como la fuerza que actúa sobre la capa de celda. Se calcula aproximadamente de acuerdo con Cornish et. al.14 con la ecuación 1:
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En el caso de la tensión de cizallamiento en dyn/cm2, á viscosidad en (dyn)/cm2, h a la mitad de la altura del canal, a la mitad de la anchura del canal y a la velocidad de flujo en ml/min.

El resultado de la ecuación 1 depende de las diferentes alturas y anchuras de las diferentes diapositivas utilizadas (ver Tabla de Materiales). En este estudio se utilizó una diapositiva de canal Luer de 0,4 m que dio como resultado un factor de deslizamiento de cámara de 131,6 (ver fórmula 2).
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La viscosidad del medio a 37oC es de 0,0072 dyns/cm2 y se utilizó una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm2. Esto dio lugar a un caudal de 10,5 ml/min (véase la fórmula 3).
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Aquí, la adaptación y el avance de un procedimiento de cultivo celular microfluídico utilizando un sistema de flujo laminar unidireccional para la investigación y visualización de los mecanismos de infección bacteriana en la vasculatura del huésped se describe en detalle. La generación de cadenas VWF en capas endoteliales también se puede estimular mediante el uso de otros sistemas de bomba que son capaces de aplicar una tensión de cizallamiento continua y constante15.

Después del cultivo de células endoteliales primarias para confluencia en el flujo y la estimulación de la formación de cuerdas DeVWF, se añadieron neumococos que expresan proteína de fluorescencia roja (RFP)16 a la capa de células endoteliales bajo control microscópico constante. La unión de bacterias a las cuerdas del VWF en la superficie de las células endoteliales se visualizó y monitorizó microscópicamente durante hasta tres horas en tiempo real mediante el uso de anticuerpos con etiquetas fluorescentes específicas de VWF. Con este enfoque, se determinó el papel del VWF como cofactor de adhesión que promueve el apego bacteriano al endotelio vascular8.

Además de la visualización microscópica de la secreción de proteínas y los cambios de conformación, este método podría utilizarse para monitorear pasos individuales de los procesos de infección bacteriana en tiempo real y para cuantificar la cantidad de bacterias adheridas en diferentes puntos de tiempo de Infección. El sistema específico de bomba controlada por software también ofrece la posibilidad de cultivar las células endoteliales en condiciones de flujo constante definidas durante un máximo de varios días y permite una incubación de flujo medio pulsada definida. Además, este método se puede aplicar utilizando diferentes tipos de celda. La adaptación del protocolo de tinción también permite la detección y visualización de bacterias internalizadas en células eucariotas.

Este manuscrito describe este protocolo experimental avanzado que se puede utilizar como un enfoque definido, confiable y reproducible para una caracterización eficiente y versátil de los procesos fisiopatológicos.

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Protocolo

El cultivo de células microfluidas se realizó con células endoteliales comerciales de venosas umbilicales humanas primarias (HUVEC). La compañía aisló las células con el consentimiento informado del donante. Este estudio fue aprobado por el Comité de ética de la Cámara de Médicos del Estado Federal de Baden-Wuerttemberg con el número de referencia 219-04.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener suministros de protocolo.

1. Precultivo de Células Endoteliales Primarias

  1. Descongelar un vial de glicerol congelado que contiene 1 x 105 HUVEC primario de tres donantes diferentes suavemente a 37 oC y sembrar las células en 7 ml de medio de crecimiento de células endoteliales precalentados (ECGM, listo para usar con suplementos) en un matraz de25 cm 2 células.
    NOTA: Las células endoteliales primarias pierden capacidad de diferenciación después de más de 5 ciclos de proliferación. Por lo tanto, sólo se pueden utilizar celdas con menos de 5 pasajes si se requieren altos grados de diferenciación celular.
  2. Cultivar las células a 37 oC en una atmósfera de CO2 al 5% durante 60 minutos para permitir la fijación de la superficie e intercambiar el medio de cultivo celular ECGM para deshacerse de los residuos de la crioconservación.
  3. Continúe el cultivo de las células a 37 oC en una atmósfera de CO2 del 5% hasta que formen una capa celular de subconfluente.
    NOTA: El HUVEC no debe crecer a una capa de confluente ya que los contactos estrechos de las celdas celulares impiden la formación de una capa celular estable más adelante en el flujo.

2. Precultivo de Streptococcus pneumoniae

ADVERTENCIA: Streptococcus pneumoniae es un agente de nivel 2 de bioseguridad y solo se permite el cultivo en laboratorios de nivel 2 de bioseguridad. Utilice un banco limpio clasificado para el nivel de seguridad 2 para todos los tratamientos bacterianos, evite estrictamente la formación de aerosoles y utilice una centrífuga con protección contra aerosoles para la sedimentación de bacterias.

  1. Inocular una placa de agar en sangre de Columbia con aislado clínico de Streptococcus pneumoniae ATCC11733 derivado de un stock de glicerol almacenado constantemente a -80 oC y cultivar la placa de agar durante la noche a 37 oC y 5% de CO2.
  2. Preparar 40 ml de caldo líquido Todd Hewitt complementado con 1% de extracto de levadura (THY) y 15 ml de solución salina estéril con fosfato (PBS) pH 7.4, para pasos de cultivo y lavado bacterianos.
  3. Utilice un tubo estéril para el cultivo bacteriano e inocular el caldo de cultivo líquido con masa bacteriana. Controlar la cantidad de inoculación mediante medición fotométrica de alícuotas de 1 ml a 600 nm contra caldo líquido no inoculado como referencia. Rellene la masa bacteriana en el caldo líquido hasta que alcance una densidad óptica a 600 nm (OD600)de 0,15.
  4. Incubar el caldo líquido inoculado sin agitar a 37 oC y 5% de CO2 y determinar laDoS 600 cada 30 min midiendo alícuotas de 1 ml utilizando cubetas de plástico.
  5. Tan pronto como el cultivo bacteriano ha alcanzado una DoP600 de 0.4, que corresponde a la fase de crecimiento exponencial, centrifugar la suspensión del cultivo bacteriano durante 10 min a 1.000 x g a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: No permita que un cultivo de neumococo alcance una OD600 de más de 1,0, porque se sabe que una alta densidad de cultivo de neumococo desencadena la autolisis bacteriana, que podría afectar la aptitud bacteriana general.
  6. Resuspenda el sedimento bacteriano suavemente con 10 ml de PBS y vuelva a sedimentar durante 10 min a 1.000 x g a RT.
  7. Resuspenda el sedimento bacteriano lavado suavemente en 1 ml de PBS y determine el OD600 de 10 l de la suspensión bacteriana utilizando 1 ml de PBS como referencia.
  8. Ajuste la cantidad de bacterias en PBS a una DoP600 de 2.0. Según el conteo bacteriano previamente determinado, una OD600 de 2.0 corresponde a 2 x 109 unidades formadoras de colonias (CFU). Proceder inmediatamente con el procedimiento de infección para prevenir la autolisis bacteriana.

3. Cultivo celular endotelial de HUVEC bajo condiciones microfluídicas

  1. Separe las células endoteliales primarias del matraz del cultivo celular por proteólisis controlada. Realice los siguientes pasos en un entorno estéril utilizando un banco limpio. Preparar un volumen de 15 ml de PBS estéril para los pasos de lavado.
    1. Retire el ECGM de una capa HUVEC de subconfluente y lave la capa celular con PBS de 10 ml utilizando una pipeta serológica para deshacerse del medio de cultivo celular.
    2. Incubar el HUVEC lavado con 3 ml de solución de disociación celular precalentada de 37oC para desprendimiento celular durante 5 min a 37oC. Observe el desprendimiento de células proteolíticas mediante la monitorización microscópica cada minuto.
    3. Pipetear la suspensión de celda separada en un tubo que contenga 7 ml de ECGM complementado con 2% de suero de ternero fetal (FCS) para detener la proteólisis y sedimentar las células durante 3 min a 220 x g en RT.
    4. Retire el sobrenadante y resuspenda el HUVEC en 250 l de ECGM complementado con 5% de FCS y 1 mM MgSO4. Utilice 10 l de la suspensión celular para el recuento celular utilizando una cámara de recuento de células Neubauer y ajuste el recuento de células a 4 x 106 células/ml ECGM complementado con 5% de FCS y 1 mM MgSO4.
      NOTA: Para cada experimento de flujo se requerirán 30 mL de medio ECGM complementado con 5% FCS y con 1 mM MgSO4. A partir de aquí, esta composición media se denomina ECGMS-medium. El aumento de la concentración de FCS en el medio de cultivo de 2% a 5% apoya la fijación celular y la viabilidad celular de HUVEC sembrada en la diapositiva del canal. El medio complementa FCS y MgSO4 estabiliza sustancialmente la unión celular de HUVEC en condiciones de tensión cortante.
  2. Semilla y cultiva el HUVEC en una diapositiva de canal. Trabaje en un ambiente estéril utilizando un banco limpio. Las células se cultivarán bajo estrés de cizallamiento durante 2 días seguido de infección con bacterias y monitoreo microscópico para otras 2 h.
    1. Equilibrar una diapositiva de canal, un conjunto de perfusión de 1,6 mm de diámetro y 50 cm de longitud, una alícuota del medio ECGMS y una diapositiva de canal Luer de 0,4 m de altura, durante 24 horas en una incubadora con una atmósfera deCO2 del 5% a 37 oC para reducir el número de burbujas de aire.
      NOTA: Este procedimiento se recomienda para desgasificar el equipo plástico y precalentar el medio, los tubos de perfusión y los depósitos. Si se han almacenado materiales o líquidos en RT o en el refrigerador, los gases disueltos en el plástico y los líquidos se liberarán cuando se calientan en la incubadora durante el experimento. A continuación, aparecerán burbujas de gas. Desgasificar todos los componentes plásticos antes del experimento eliminará este efecto. Cada vez que el sistema es sacado de la incubadora, el proceso de absorción de gas comienza de nuevo. Por lo tanto, trabaje rápidamente en RT y nunca deje la unidad fluida fuera de la incubadora durante períodos de tiempo más largos.
    2. Utilice una pipeta para inyectar 100 ml de una solución de gelatina porcina filtrada estéril al 2% en una solución de PBS en uno de los depósitos de una diapositiva de canal equilibrado a temperatura. Incubar la gelatina-solución durante 1 h a 37 oC y enjuagar el canal de la corredera con 1 ml de PBS en condiciones estériles utilizando una jeringa Luer de 1 ml.
    3. Coloque el portaobjetos recubierto de gelatina sobre una fina placa de poliestireno o espuma de poliestireno para evitar una caída en la temperatura del deslizamiento. Añadir 100 l de la suspensión HUVEC de 4 x 106ml con una jeringa Luer de 1 ml en la corredera.
      NOTA: Colocar la corredera de canal en la superficie de metal frío del banco limpio podría disminuir la temperatura del fondo de la diapositiva, generando así tensión fría a las células endoteliales. Durante el pipeteo celular mantenga la diapositiva un poco hacia arriba para dejar que las burbujas de aire se eleven y desaparezcan del interior de la diapositiva.
    4. Incubar la diapositiva del canal con el HUVEC durante 60 min a 37 oC y 5% co2 y llenar los depósitos medios en ambos extremos de la diapositiva del canal con un medio ECGMS de 60 ol cada uno. Incubar durante 1 h a 37oC y 5% CO2.
  3. Ajuste la bomba microfluídica y los ajustes del software.
    1. Conecte el conjunto de perfusión equilibrada a la unidad de bomba, llene con 13,6 ml de ECGMS-medio e inicie el software de control de la bomba. Seleccione el conjunto de perfusión adecuado y el tipo de diapositiva de cámara utilizando las ventanas de desplazamiento hacia abajo en el menú de la unidad fluida configurada. Elija 0.007 (dyns/cm2) en el software para la viscosidad media. (Consulte los ajustes del software de la bomba de presión marcados con flechas rojas en la Figura suplementaria 1).
    2. Fuera de la incubadora, conecte una botella de vidrio llena de perlas de sílice de secado al tubo de presión de aire (consulte la Figura 1, Inset 3). El aire de la bomba de presión circula entre los depósitos de perfusión y la bomba y debe estar seco antes de volver a entrar en el dispositivo de la bomba. Seleccione Parámetros de flujo en el menú de software, ajuste la presión a 40 mbar y enjuague los tubos de la bomba con el medio líquido iniciando el flujo medio continuo. (Estos ajustes también se indican mediante flechas rojas en la Figura Suplementaria 1).
    3. Programe los ciclos de tensión de cizallamiento deseados del cultivo de flujo. Comience con 5 dyn/cm2, controle el bombeo de depósito equilibrado y asegúrese de que no haya burbujas de aire circulando en el sistema de la bomba.
      NOTA: La tensión de cizallamiento de pared en una diapositiva de canal depende del caudal y la viscosidad del medio de perfusión. Si utiliza otro sistema de bomba, consulte las ecuaciones descritas en la introducción para establecer un caudal que genere el nivel de tensión de cizallamiento deseado. Los ajustes descritos corresponden a un caudal de 5,42 ml/min. (Una captura de pantalla ejemplar que muestra los ajustes de parámetros de flujo adecuados en el software de la bomba de presión se muestra en la Figura suplementaria 2).
    4. Detenga la circulación del flujo en el software de control de la bomba y mantenga el flujo medio en el tubo de perfusión sujetando los tubos cerca de las conexiones Luer. Conecte la diapositiva del canal, evitando así las burbujas de aire, y coloque la unidad fluida con la diapositiva del canal conectado en una incubadora de CO2 a 37 oC y 5% de CO2. Inicie la tensión de cizallamiento a 5 dyn/cm2 durante 30 minutos para adaptar suavemente las células a las fuerzas generadas por la tensión de cizallamiento antes de acelerar el nivel de tensión de cizallamiento (consulte la Figura suplementaria 3).
      NOTA: Tenga cuidado de que no queden burbujas de aire en el sistema de tubos o en el portaobjetos después de conectarlo al sistema de tubos porque el movimiento de las burbujas de aire en el flujo podría conducir al desprendimiento de la célula.
    5. Acelere la tensión de cizallamiento a 10 dyn/cm2 (que corresponden a 10,86 ml/min en este ajuste de flujo) e incubar la corredera de canal en tensión de cizallamiento continua durante 48 h en una pequeña incubadora de CO2 a 37 oC y 5% de CO2 para permitir la diferenciación celular ( los settinngs de software respectivos se indican con flechas rojas en la Figura Suplementaria 4).
      NOTA: Las células HUVEC tienden a desprenderse de la superficie del canal si el cultivo del flujo se inicia directamente a 10 dyn/cm2. Las células permanecen unidas a la superficie de la cámara si el cultivo de flujo se inicia con menos tensión de cizallamiento utilizando 5 din/cm2 durante un mínimo de 30 minutos seguido de aumentar la tensión de cizallamiento lentamente hasta los 10 diques/cm2deseados. Una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm2 es el valor mínimo en este ajuste de perfusión requerido para la formación de cuerdas VWF.
    6. Después de 24 h de cultivo de células microfluídicas, detenga el flujo medio con el software de control de la bomba exactamente cuando se alcanza un nivel medio equilibrado en ambos depósitos medios. Colocar la unidad fluida en un banco limpio y retirar 10 ml del medio de cultivo circulado de los depósitos de perfusión utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Añadir 10 ml de ECGMS-medio a los depósitos para renovar el medio, volver a colocar la unidad fluida en la incubadora de CO2 a 37oC y 5% deCO2,y reiniciar el cultivo fluido utilizando el software de control de la bomba.
      NOTA: La función de la bomba de presión puede ser interrumpida repentinamente por máquinas de laboratorio como grandes centrífugas, lo que podría crear una fuerte perturbación del campo magnético. Esta interrupción repentina podría conducir al desprendimiento celular. Tenga cuidado de que estas máquinas no estén activas cerca de la bomba de presión durante el experimento.
    7. Iniciar el precalentamiento de la cámara de incubación de temperatura que cubre la etapa del microscopio de fluorescencia a 37 oC para el equilibrio de temperatura 24 h antes de la visualización microscópica. Después de precalentar el microscopio, inicie el control del software del microscopio y ajuste los ajustes principales para la monitorización microscópica de fluorescencia seleccionando los ajustes de filtro adecuados (540 nm/590 nm para la detección de las bacterias y bacterias que expresan RFP y 470 nm/515 nm para la detección de la emisión de fluoresceína de los anticuerpos específicos para FVW conjugados por el FITC). Precalentar una cámara de calentamiento adicional para la incubación de la unidad fluida a 37 oC.
      NOTA: Durante los análisis de infección y la monitorización microscópica la temperatura de la diapositiva del canal y el medio circulante no deben disminuir sustancialmente, ya que esto generaría estrés frío en las células. En general, el tamaño de las cámaras de temperatura que cubren la etapa del microscopio no es suficiente para cubrir toda la unidad fluida. Por lo tanto, se recomienda el uso de una cámara de calentamiento adicional precalentada a 37 oC.
    8. Para la visualización microscópica, coloque la unidad fluida en la cámara de calentamiento precalentada de 37 oC y coloque la diapositiva del canal en una etapa del microscopio precalentado de 37 oC.
      NOTA: Para la visualización microscópica, la unidad fluida y la corredera de canal debían retirarse de la incubadora de CO2 debido a la longitud limitada del tubo de perfusión. Si se requieren tiempos de infección y monitorización microscópica superior a 180 min fuera de la atmósfera del 5% deCO2 para el amortiguamiento del pH, se debe utilizar un medio con pH amortiguado para el cultivo microfluídico.
    9. Controlar la morfología celular y la integridad de la capa HUVEC antes de la inyección de histamina y bacterias a la circulación de flujo durante todo el momento del experimento de flujo y después de terminar el experimento de flujo utilizando el modo de campo brillante del microscopio.

4. Inducción de la liberación de VWF y visualización de cadenas DeV Multimerizadas

  1. Mantenga el ajuste de flujo, ya que se requiere una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm2 para desencadenar la multimerización de VWF a cadenas largas de hasta 200 MDa. Induzca la liberación de VWF de WPB endotelial inyectando 136 ml de una solución de hetamina de 100 mM en el medio ECGMS que circula en el tubo de perfusión utilizando un puerto de inyección. La concentración final de histamina en el medio de flujo será de 1 mM. Si no hay puerto de inyección disponible, la histamina se puede añadir alternativamente mediante pipeteo en el medio de los depósitos de la bomba.
  2. Para la detección de inmunofluorescencia de cuerdas VWF multimerizadas, detenga el flujo cuando se alcance un nivel medio equilibrado en los depósitos e inyecte 20 g de un anticuerpo conjugado FITC específico para VWF en un volumen de 200 ml de PBS (pH 7.4) en la circulación de 13,6 ml de ECGMS-medio utilizando un puerto de inyección. Si no hay puerto de inyección disponible, el anticuerpo se puede añadir alternativamente pipeteando en el medio de los depósitos de la bomba. Esto da como resultado una concentración final de anticuerpos de 1,3 g/ml.
  3. Para el escaneo microscópico de varios campos de visión en poco tiempo, utilice la unidad de fluorescencia del microscopio con un dispositivo de fluorescencia de xenón a una potencia del 30% y una cámara de epifluorescencia. Supervise la forma y la morfología de la capa HUVEC con el modo de campo brillante para seleccionar celdas representativas adecuadas para la visualización de cadenas VWF.
  4. Para la visualización de cadenas VWF fluorescentes verdes, seleccione un objetivo de aceite de 63x/1.40 y un filtro de detección de 470 nm en el menú de la unidad de fluorescencia del software del microscopio (LasX). Cree instantáneas de pilas Z de al menos 50 vistas de campo representativas, cada una de las cuales contiene aproximadamente 10 HUVEC morfológicamente intactos. Para la cuantificación de las cadenas VWF fluorescentes verdes en diferentes puntos de tiempo, escanee varios campos de visión.

5. Evaluación microscópica del apego bacteriano a las cuerdas VWF en el flujo en tiempo real

  1. Cuantifique la unión neumocócica a las cadenas VWF generadas en superficies celulares HUVEC mediante la detección de inmunofluorescencia.
    1. Sostenga el flujo e inyecte 1,35 x 108 CFU/mL RFP-expressing neumococci en un volumen máximo de 1 ml en el medio ECGMS utilizando el puerto de inyección. Alternativamente, pipetear las bacterias en el medio en el depósito de la bomba. Reinicie la tensión de cizallamiento a 10 dyn/cm2 para dejar que las bacterias circulen dentro del sistema de la bomba.
    2. Seleccione un objetivo de inmersión en aceite de 63x para el aumento del microscopio y ajuste los ajustes del filtro de fluorescencia en el software del microscopio al canal RFP (filtro de detección de 540 nm) para la detección de neumococos que expresan RFP.
    3. Para la cuantificación de la fijación bacteriana a las cadenas VWF, detenga el flujo y cree instantáneas de pilas Z de al menos 30 vistas de campo representativas, cada una con aproximadamente 10 HUVEC morfológicamente intactas, y cuente la cantidad de neumococos.
    4. Utilice el algoritmo de estadísticas unifactoriales de ANOVA para evaluar los datos, seguido de una prueba de muestra no emparejada de dos colas post hoc para una comparación estadística detallada. Los valores P de <0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

6. Evaluación microscópica del apego bacteriano a las cuerdas VWF después de la fijación de la muestra

  1. Muestree la fijación antes de la tinción de inmunofluorescencia.
    1. Detenga el flujo, retire 10 ml de ECGMS-medio de los depósitos de la bomba, y agregue 10 mL de PBS complementado con 5% de paraformaldehído (PFA). Deje que la solución pfA circule durante 10 minutos a una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm2.
    2. Desconecte la diapositiva del canal de la unidad de bomba.
  2. Bloquear sitios de unión inespecíficos en la superficie celular y realizar la inmunodetección de las cuerdas del VWF y las bacterias unidas.
    1. Preparar 4 ml de una solución de lavado que contenga 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) suplementada con 4% de sacarosa para todos los pasos de lavado. Preparar 1 ml de una solución de bloqueo que contenga 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) complementada con 4% de sacarosa y 2% de albúmina sérica bovina (BSA) para el bloqueo de sitios de unión inespecíficos.
    2. Lave la corredera de canal incubada por PFA 3x utilizando una jeringa Luer de 1 ml para inyectar 200 ml de la solución de lavado e incubar la corredera durante 120 minutos a RT con una solución de bloqueo de 200 ml.
    3. Preparar 4 ml de otra solución de bloqueo que contenga 100 mM Na2CO3, (pH 9.2) complementado con 4% de sacarosa y 0,5% de BSA para la dilución de los anticuerpos. Utilice 200 l de esta solución de bloqueo para diluir el antisuero de conejo específico del neumococo 1:100. Utilice 200 ml de esta solución de bloqueo para diluir el anticuerpo de ratón específico de VWF 1:50 para realizar una concentración de anticuerpos específica de VWF de 4 g/ml. Diluir el anticuerpo secundario conjugado AlexaFluor488 a partir de una solución de 2 mg/ml 1:100 en 200 ml de PBS (pH 7.4) para generar una concentración final de 20 g/ml.
      NOTA: En los ajustes de inmunofluorescencia descritos, la detección de anticuerpos proporcionó resultados óptimos cuando los anticuerpos se diluyeron en el tampón de carbonato alcalino antes mencionado. Según los resultados anteriores, las soluciones de bloqueo recomendadas y la cantidad de anticuerpos son adecuadas para muchas aplicaciones. Sin embargo, diferentes experimentos pueden requerir la optimización individual de la combinación de anticuerpos, la concentración de anticuerpos, el tiempo de incubación y la constitución del búfer de bloqueo. Como alternativa, un sistema con búfer de fosfato con un rango de pH neutro podría ser adecuado o incluso preferir como tampón de incubación. En caso de señales de fluorescencia débiles, se debe aumentar la concentración de anticuerpos secundarios. Si se detecta demasiado ruido de fondo de fluorescencia inespecífico, se debe aumentar la cantidad de sustancias de bloqueo.
    4. Para la tinción de VWF-inmunofluorescencia, lave el portaobjetos con una jeringa Luer de 1 ml inyectando 200 ml de la solución de lavado 3x e incubar el portaobjetos con el anticuerpo específico para VWF diluido de 1:50 durante 30 minutos a RT. L de la solución de lavado e incubar el portaobjetos con el anticuerpo específico del ratón conjugado AlexaFluor488 diluido de 1:100 durante 30 min a RT. Por último, lave la corredera de nuevo 3x con 200 sl de la solución de lavado.
      NOTA: Los fluoróforos AlexaFluor son sensibles al blanqueo. Por lo tanto, la diapositiva debe protegerse manteniéndola en una cámara oscura durante los pasos de incubación con los anticuerpos conjugados con fluoróforo.
    5. Para la inmunodetección de los neumococos, incubar el portaobjetos con un anticuerpo de conejo específico para neumococo diluido de 1:100 durante 30 min a RT. Después, lave el portaobjetos 3x con 200 ml de la solución de lavado e incubar el portaobjetos con 1:100 diluido AlexaFluor568 conjugado anticuerpo específico de conejo durante 30 minutos en RT. Lavar la diapositiva del canal de nuevo 3x con 200 l de la solución de lavado.
    6. Para manchar el citoesqueleto de actina celular con faloidina fluorescente, permeabilizar el HUVEC por incubación con 120 ol de 0,1% Triton X-100 durante 5 min en RT. Lavar la diapositiva del canal 3x con 200 ol de la solución de lavado e incubar el portaobjetos con 120 ol de 1:1.000 diluido AlexaFluor350-faloidin conjugado. Este paso de incubación visualizará el citoesqueleto de actina polimerizada y permitirá el monitoreo de la forma celular y posibles cambios morfológicos inducidos por el estrés.
    7. Lavar la corredera de canal 3x con 200 sL de la solución de lavado. Por último, lave la corredera 4x con 200 l ddH2O y visualice las cuerdas fluorescentes verdes VWF, las bacterias fluorescentes rojas y el citoesqueleto de actina fluorescente azul utilizando los ajustes de filtro adecuados en el microscopio de fluorescencia.

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Resultados

El cultivo de HUVEC primario en un flujo unidireccional constante da como resultado la formación de una capa celular confluente y estrechamente embalada que promueve la generación de WPB celulares llenos del VWF13mecanosensible,14. Este protocolo describe el uso de un sistema de recirculación sin pulso basado en bomba de presión de aire para el análisis de infecciones que requiere imitar la situación de tensión de cizallamiento en el flujo sanguíneo human...

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Discusión

La simulación de la interacción bacteriana con proteínas huésped sensibles al mecanosensible como el VWF requiere un sistema de cultivo celular perfundible que permita la generación de un flujo definido, unidireccional y continuo de líquidos, generando así un flujo confiable de tensión de cizallamiento . Ya se han descrito varios sistemas de bombas microfluídicas. Una revisión exhaustiva de Bergmann et al. resume los aspectos clave de los diferentes modelos de cultivo celular bidimensional y tridimensional

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El proyecto fue financiado por el DFG (BE 4570/4-1) a S.B.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-syringeFisher Scientific10303002with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringeSarstedt9077136For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
AccutaseeBioscience now thermo fisher00-4555-56protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated PhalloidinAbcamab176751no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibodyThermo Fisher SientificA11001stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibodyThermo Fisher ScientificA-11011stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-BrothBecton Dickinson GmbHBD 249210complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-25Gsolubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filterTPP90026subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12RBeckman Coulter Life Sciences392304spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30Beckman Coulter Life SciencesB06314spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MKHermle305.00 V05 - Z 216 Mspinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
ChloramphenicolCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3886.2used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubingibidi10821for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-IncubatorFisher ScientificMIDI 40incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-IncubatorSanyoMCO-18 AICfor incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar platesBecton Dickinson GmbHPA-254005.06agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
ComputerDellLatitude 3440Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)LeicaDMi8An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3904.1used for PBS buffer
Drying materialMerck101969orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement MixPromocellC-39215supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMSPromocellC-22010ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)PromocellC-22010culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)biochrome now MerckS 0415supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibodyAbcamab8822stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unitibidi10903fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG-1890-100gfor precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochlorideSigma AldrichH-7250-10MGfor induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)PromocellC-12203 Lot-Nr. 396Z042primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)Santa Cruzsc73268stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Portibidi10820for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscopeZeissAxiovert 35Minverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)ibidi80176physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)Sigma AldrichM7506-500GFor preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pumpibidi10905air pressure pump
Neubauer cell counting chamberKarl Hecht GmbH&Co KG40442002microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)Electron Microscopy Sciences15710-Sfor cross linking of samples
Perfusion Setibidi10964Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettesSarstedt67,741(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserumPinedaraised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam platethis is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe6781.1used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)ibidiv1.5.4Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mLSarstedt72.706/ 72.695.500required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volumeSarstedt6,25,48,004
RFP-expressing pneumococciNational Collection of Type Cultures, Public Health England10,319Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mLSarstedt86.1253.025/ 86.1254.025for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)Sigma Aldrich451614-25Gfor preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, KarlsruheP030.2used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22Biochrom80-2115-20measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
SucroseSigma AldrichS0389-500Gfor preparation of blocking buffer
Triton X-100Sigma AldrichT9284-500MLUsed in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extractoxoidLP0021bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY

Referencias

  1. Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
  2. Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
  3. Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
  4. Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
  5. Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
  6. Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
  7. Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
  8. Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511(2019).
  9. Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
  10. Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
  11. Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
  12. Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
  13. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
  14. Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
  15. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
  16. Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
  17. Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
  18. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  19. Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
  20. Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
  21. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
  22. Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
  23. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
  24. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
  25. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
  26. Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
  27. Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
  28. Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
  29. Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218(1996).
  30. Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
  31. Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
  32. Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
  33. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
  34. Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).

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