일정한 흐름에 있는 1 차적인 인간 내피 세포의 폐렴구균 감염

요약

본 연구는 정의된 흐름 조건에서 전단 응력 하에서 분화된 인간 1차 내피 세포의 표면에서 생성된 폰 윌레브란트 인자 문자열에 대한 폐렴구균 준수의 현미경 모니터링을 설명합니다. 이 프로토콜은 차동 면역 염색 절차를 적용하여 특정 세포 구조의 상세한 시각화 및 박테리아의 정량화로 확장 될 수있다.

초록

내피 세포의 표면과 연쇄상 구균 폐렴의 상호 작용은 폰 윌레브란트 인자 (VWF)와 같은 메카노 민성 단백질을 통해 혈류에서 매개됩니다. 이 당단백질은 전단 응력에 반응하여 분자 변형을 변화시켜 광범위한 숙주-리간드 상호작용에 대한 결합 부위를 노출시킵니다. 일반적으로, 정의된 전단 흐름 하에서 1 차 내피 세포의 배양은 혈관의 내벽의 생리학을 닮은 안정적이고 단단히 연결된 내피 층의 특정 세포 분화 및 형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. . 따라서, 세균성 병원체와 메카노민성 단백질을 포함하는 숙주 혈관구조 간의 상호작용의 기능적 분석은 표면에 영향을 미치는 것으로 알려진 생리적 유동력을 시뮬레이션할 수 있는 펌프 시스템의 확립을 요구한다. 혈관 세포.

이 연구에 사용된 미세 유체 장치는 정의된 유량으로 유체의 연속적이고 펄스없는 재순환을 가능하게 합니다. 컴퓨터 제어 식 공기 압 펌프 시스템은 연속, 단방향 및 제어 된 매체 흐름을 생성하여 내피 세포 표면에 정의 된 전단 응력적용합니다. 세포와 세균 부착의 형태학적 변화는 현미경 시각화를 위해 설계된 특수 채널 슬라이드를 사용하여 흐름에서 현미경으로 모니터링하고 정량화할 수 있습니다. 일반적으로 면역 표지 및 현미경 분석 전에 샘플 고정을 필요로하는 정적 세포 배양 감염과는 달리 미세 유체 슬라이드는 단백질, 박테리아 및 세포 성분의 형광 기반 검출을 모두 가능하게합니다. 샘플 고정 후; 직렬 면역 형광 염색; 실시간으로 직접 형광 기반 검출. 형광 박테리아 및 특정 형광 표지 항체와 함께,이 감염 절차는 혈관 과정과 관련된 과학적 응용 프로그램의 거대한 스펙트럼을위한 효율적인 다중 구성 요소 시각화 시스템을 제공합니다.

서문

폐렴구균 감염의 병인은 플라스미노겐 및 VWF ^{1,2와 같은 인간 지혈의 세포 외 매트릭스 화합물 및 구성 요소의 다양성과 다각적인 상호 작용을 특징으로합니다. 3,4},^5,6,7,8. 다중 도메인 당단백질 VWF는 혈관 혈전 형성 부위에서 혈전세포 모집 및 피브린 혼입을 중재함으로써 균형 잡힌 지혈의 주요 조절자 역할을 한다^9. 출혈 조절 및 상처 치유를 위한 기능적이고 활동적인 VWF의 중요성은 일반적인 상속된 출혈 장애 인 폰 윌레브란트 병^10에의해 입증됩니다.

구형 VWF는 최대 14.0 μg/mL^11,10의농도로 인간의 혈액 시스템에서 순환합니다. 혈관 손상에 대한 응답으로, 내피 바이벨 팔라드 바디 (WBP)에 의한 VWF의 국소 방출은^{현저하게 11,12}증가된다. 이전 연구는 인간 내피 세포에 대한 폐렴구균 준수 및 공극 형성 독소 폐렴의 생산이 크게 루미날 VWF 분비를 자극한다는 것을 보여준다^13. 혈류의 유체역학적 힘은 메카노반응성 VWF 도메인의 구조적 개방을 유도한다. 10^dyn/cm2의 유량에서 VWF는 최대 수백 마이크로미터길이의 긴 단백질 문자열로 multimerizes^10,12.

내피 표면과 폐렴구균의 상호 작용에서 전단 응력 하에서 생성된 다중화된 VWF 현의 기능을 이해하기 위해 미세 유체 기반 세포 배양 접근법이 확립되었습니다. 소프트웨어 제어 식 공기 압력 펌프 시스템을 갖춘 미세 유체 장치가 사용되었습니다. 이를 통해 정의된 유량으로 세포 배양 배지의 연속적이고 단방향 재순환이 가능했습니다. 따라서 시스템은 내피 세포의 표면에 정의된 전단 응력을 적용하여 특수 채널 슬라이드 내부에 부착된 상태로 유지했습니다. 이 접근법은 정의된 일정한 흐름 조건 하에서 VWF 현이 분화된 내피 세포에서 생성되는 인간 혈관 시스템의 혈류 내 전단력을 시뮬레이션할 수 있게 했습니다. 이를 위해, 내피 세포는 특정 채널 슬라이드(재료 표참조)에서 경작되었고, 이는 유동 동안 현미경 분석을 위해 조정되었다. 미세 유체 펌프 시스템은 동포 내피 세포 층에 확장 된 VWF 문자열의 형성에 필요한 고도로 정의되고 제어 된 전단 응력 상황을 제공했습니다. VWF-분비후 히스타민 보충제에 의해 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)를 동류성장한 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)의 자극 후, 현 형성은 10^dyn/cm2의전단 응력(들)을 적용하여 유도되었다. 전단 응력은 세포 층에 작용하는 힘으로 정의됩니다. 그것은 코니쉬 등에 따라 대략 계산됩니다. al.¹⁴ 와 방정식 1:

여기서 = dyn/cm^2의전단 응력, θ =점도(dyn∙s)/cm2, h =채널 높이의 절반, 채널 너비의 절반, Φ=mL/min의 유량.

방정식 1의 결과는 사용되는 다른 슬라이드의 높이와 너비에 따라 달라집니다(재질 표참조). 본 연구에서 0.4 μm의 루어 채널 슬라이드를 사용하여 챔버 슬라이드 계수 131.6을 사용하였다(공식 2 참조).

37°C에서 배지의 점도는 0.0072 dyn∙s/cm²이고 10 dyn/cm²의 전단 응력도 사용하였다. 그 결과 10.5 mL/min의 유량이 발생했습니다(수식 3 참조).

여기서, 숙주 혈관구조에서 세균 감염 메커니즘의 조사 및 시각화를 위한 단방향 층류 시스템을 이용한 미세유체 세포 배양 절차의 적응 및 발전이 상세히 기술된다. 내피 층에 VWF 스트링의 생성은 또한 연속적이고 꾸준한 전단^{응력(15)을}적용할 수 있는 다른 펌프 시스템을 사용하여 자극될 수 있다.

VWF 현 형성의 흐름 및 자극에 합류하는 1차 내피 세포를 배작한 후, 적색 형광 단백질(RFP)을 발현하는 폐렴구균을 일정한 현미경 조절하에 내피 세포 층에 첨가하였다. 내피 세포의 표면에 VWF 문자열에 박테리아를 부착하는 것은 VWF 특이적 형광 표지 항체를 사용하여 실시간으로 최대 3 시간 동안 현미경으로 시각화및 모니터링되었습니다. 이러한 접근법으로, 혈관 내피에 세균 부착을 촉진하는 유착 보조인자로서 VWF의 역할을 결정하였고^8.

단백질 분비 및 형태 변화의 현미경 시각화 이외에,이 방법은 실시간으로 세균 감염 과정의 단일 단계를 모니터링하고 서로 다른 시점에서 부착 된 박테리아의 양을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 감염. 특정 소프트웨어 제어 펌프 시스템은 또한 최대 며칠 동안 정의된 일정한 유동 조건에서 내피 세포를 배양할 수 있는 가능성을 제공하고 정의된 펄스 매질 유동 배양을 가능하게 합니다. 또한,이 방법은 다른 세포 유형을 사용하여 적용 할 수 있습니다. 염색 프로토콜을 적응하면 진핵 세포로 내중화된 박테리아를 감지하고 시각화할 수 있습니다.

이 원고는 병리학 적 과정의 효율적이고 다양한 특성화를 위해 정의되고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 접근 법으로 사용할 수있는이 고급 실험 프로토콜을 설명합니다.

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프로토콜

미세유체 세포 배양은 상업적인 일차인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)로 수행하였다. 회사는 기증자의 통보된 동의를 가진 세포를 고립시되었습니다. 이 연구는 참조 번호 와 연방 주 바덴 - 뷔르템베르크의 의사 상공 회의소의 윤리위원회에 의해 승인되었다 219-04.

참고: 프로토콜 소모품에 대한 재료 표를 참조하십시오.

1. 1 차 내피 세포의 사전 육성

1. 37°C에서 3개의 다른 공여자로부터 1 x 10^515차 HUVEC를 함유하는 냉동 글리세롤 바이알을 해동시키고, 25 cm² 세포 플라스크에서 7 mL의 내피 세포 성장 배지(ECGM, 보충제와 함께 사용할 준비)로 세포를 종자하였다.
   참고: 1 차적인 내피 세포는 5 개 이상의 증식 주기 후에 분화 능력을 분실합니다. 따라서 5개 미만의 대지나 높은 등급의 세포 분화가 필요한 경우에만 사용할 수 있습니다.
2. 37°C에서 세포를 5%_CO2 대기에서 60분 동안 배양하여 표면 부착을 허용하고 ECGM 세포 배양 배지를 교환하여 극저온 보존으로부터 잔류물을 제거합니다.
3. 5%_CO2 대기에서 37°C에서 세포를 계속 배양하여 하위 구성 세포층을 형성한다.
   참고: HUVEC는 단단한 세포 세포 접촉이 나중에 흐름에서 안정된 세포 층의 형성을 방지하기 때문에 동류 층으로 성장해서는 안됩니다.

2. 연쇄상 구균 폐렴의 사전 육성

주의: 연쇄상 구균 폐렴은 생물 안전 성 수준 2 에이전트이며 생물 안전 수준 2 실험실에서 만 배양 할 수 있습니다. 모든 세균 치료에 대해 안전 수준 2로 분류 된 깨끗한 벤치를 사용하고 에어로졸 형성을 엄격히 피하고 박테리아 침전을위해 에어로졸 보호 기능이있는 원심 분리기를 사용하십시오.

1. -80°C에서 지속적으로 보관되는 글리세롤 스톡으로부터 유래된 연쇄상 구균 폐렴구균 임상 분리물 ATCC11733으로 컬럼비아 혈액 한천 플레이트를 접종하고 37°C 및 5%_CO2에서하룻밤 동안 한천 플레이트를 배양하였다.
2. 세균 재배 및 세척 단계를 위해 1% 효모 추출물(THY)과 멸균 인산완충식염수(PBS) pH 7.4 15mL로 보충된 토드 휴이트 액체 국물 40 mL를 준비합니다.
3. 세균 재배를 위해 멸균 튜브를 사용하고 액체 배양 액을 세균 덩어리로 접종하십시오. 600 nm에서 1 mL aliquots의 광측정에 의한 접종량을 비접종액 액액에 대해 참고자료로 제어합니다. 0.15의 600 nm (OD_600)에서광학 밀도에 도달 할 때까지 액체 국물에 세균 덩어리를 채웁니다.
4. 37°C 및 5%_CO2에서 흔들리지 않고 접종된 액체 국물을 배양하고 플라스틱 큐벳을 사용하여 1 mL aliquots를 측정하여 30분마다 OD_600을 결정합니다.
5. 세균 배양이 지수 성장 기에 해당하는 0.4의 OD_600에 도달하자마자, 실온(RT)에서 1,000 x g에서 10분 동안 세균 배양 현탁액을 원심분리한다.
   참고: 폐렴구균 배양액이 1.0 이상인 OD_600에 도달하는 것을 허용하지 않는데, 이는 높은 폐렴구균 배양 밀도가 세균성 자가매를 유발하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이는 전반적인 세균 적정성에도 영향을 미칠 수 있다.
6. 10 mL PBS로 세균 퇴적물을 부드럽게 다시 중단하고 RT에서 1,000 x g에서 10 분 동안 다시 퇴적물을 다시 하십시오.
7. 세척된 세균 퇴적물을 1 mL PBS에서 부드럽게 중단하고 1mL의 PBS를 이용하여 세균 현탁액의 10 μL의 OD_600을 기준으로 결정한다.
8. PBS내의 박테리아 양을 2.0의 OD_600으로 조정합니다. 이전에 결정된 세균 계수에 따르면, 2.0의 OD_600은 2 x 10⁹ 콜로니 형성 단위(CFU)에 해당한다. 즉시 세균 성 자동 해를 방지하기 위해 감염 절차를 진행합니다.

3. 미세 유체 조건하에서 HUVEC의 내피 세포 재배

1. 제어 된 proteolysis에 의해 세포 배양 플라스크에서 기본 내피 세포를 분리. 깨끗한 벤치를 사용하여 멸균 환경에서 다음 단계를 수행합니다. 세척 단계를 위해 멸균 PBS 15 mL의 부피를 준비합니다.
   1. 지하 성장HUVEC 층으로부터 ECGM을 제거하고 혈청학적 피펫을 사용하여 10 mL PBS로 세포층을 세척하여 세포 배양 배지를 제거한다.
   2. 세척된 HUVEC를 37°C의 3 mL로 배양하여 37°C에서 5분 동안 세포 분리를 위한 미리 warmed된 세포 해리액을 배양하였다. 매 분마다 현미경 모니터링을 통해 프로테오리틱 셀 분리를 관찰합니다.
   3. 분리된 세포 현탁액을 ECGM 7 mL을 함유하는 튜브내로 피펫하여 2% 태아 송아지 혈청(FCS)을 보충하여 프로테오라시스를 멈추고 세포를 RT에서 220 x g에서 3분 동안 퇴적시하였다.
   4. 상급체를 제거하고 5% FCS 및 1 mM MgSO_4로보충된 ECGM의 250 μL에서 HUVEC를 다시 중단한다. Neubauer 세포 계수 챔버를 사용하여 세포 계수용 셀 현탁액의 10 μL을 사용하고 5% FCS 및 1 mM MgSO_4로보충된 세포 수를 4 x 10⁶ 셀/mL ECGM으로 조정합니다.
      참고: 각 유동 실험에 대해 5% FCS로 보충된 ECGM 배지의 30 mL및 1 mM MgSO_4가 필요합니다. 여기에서 이 매체 조성물은 ECGMS-매체로 명명된다. 배양 배지에서 FCS 농도의 증가는 채널 슬라이드에서 HUVEC 시드의 세포 부착 및 세포 생존성을 2%에서 5%로 뒷받침한다. 배지 보충제 FCS 및 MgSO_4는 전단 응력 조건 하에서 HUVEC의 세포 부착을 실질적으로 안정화시다.
2. 채널 슬라이드에서 HUVEC를 시드하고 배양합니다. 깨끗한 벤치를 사용하여 멸균 환경에서 작업하십시오. 세포는 다른 2 시간 동안 박테리아와 현미경 모니터링감염에 이어 2 일 동안 전단 스트레스하에서 경배될 것이다.
   1. 채널 슬라이드, 관류 세트 직경 1.6 mm 및 길이 50cm, ECGMS-매체의 aliquot, 및 루어 채널 슬라이드 0.4 μm 높이, 37°C에서 5%_CO2 대기를 가진 인큐베이터에서 24시간 동안 기포 수를 감소시킴.
      참고: 이 절차는 플라스틱 장비를 탈기하고 매체, 관류 튜브 및 저수지를 미리 데우는 것이 좋습니다. 재료 나 액체가 RT 또는 냉장고에 저장된 경우, 플라스틱및 액체에 용해 된 기체는 실험 중에 인큐베이터에서 가열 될 때 방출됩니다. 그러면 기포가 나타납니다. 실험 전에 모든 플라스틱 부품을 탈기하면 이 효과가 제거됩니다. 시스템이 인큐베이터에서 꺼날 때마다 가스 흡수 과정이 다시 시작됩니다. 따라서 RT에서 신속하게 작업하고 더 긴 기간 동안 인큐베이터 외부에 유체 단위를 두지 마십시오.
   2. 피펫을 사용하여 2% 멸균 여과된 돼지 젤라틴 용액100 μL을 PBS 용액에 온도 평형 채널 슬라이드의 저장소 중 하나에 주입합니다. 젤라틴 용액을 37°C에서 1시간 동안 배양하고 1 mL 루어 주사기를 사용하여 멸균 조건하에서 1 mL PBS로 슬라이드의 채널을 헹구십시오.
   3. 얇은 폴리스티렌 또는 스티로폼 플레이트에 젤라틴 코팅 채널 슬라이드를 놓아 슬라이드 온도가 떨어지는 것을 방지합니다. 1mL 루어 주사기를 슬라이드에넣고 4 x 10 6/mL HUVEC 서스펜션 100 μL을 추가합니다.
      참고: 깨끗한 벤치의 차가운 금속 표면에 채널 슬라이드를 배치하면 슬라이드 바닥의 온도를 감소시켜 내피 세포에 차가운 스트레스를 발생시킬 수 있습니다. 셀 파이펫팅 중에 슬라이드를 약간 위쪽으로 잡고 기포가 상승하고 슬라이드 내부에서 사라지게합니다.
   4. 37°C 및 5%_CO2에서 HUVEC로 60분 동안 채널 슬라이드를 인큐베이션하고 채널 슬라이드의 양 단부에서 배지 저장소를 각각 60 μL ECGMS-medium로 채웁니다. 37 °C및 5%_CO2에서1시간 동안 배양합니다.
3. 미세 유체 펌프와 소프트웨어 설정을 조정합니다.
   1. 평형 관류 세트를 펌프 장치에 연결하고 ECGMS-medium 의 13.6 mL로 채우고 펌프 제어 소프트웨어를 시작합니다. 유체 단위 설정 메뉴에서 창을 아래로 스크롤하여 적절한 관류 세트와 챔버 슬라이드 유형을 선택합니다. 중간 점도에 대한 소프트웨어에서 0.007 (dyn∙s/cm2)을 선택합니다. (보조 그림 1에서빨간색 화살표로 표시된 압력 펌프 소프트웨어 설정을 참조하십시오.)
   2. 인큐베이터 외부에서 건조 실리카 비드로 채워진 유리 병을 공기 압관에 연결합니다(그림 1, 인세트 3참조). 압력 펌프의 공기는 관류 저장소와 펌프 사이에서 순환하며 펌프 장치에 다시 들어가기 전에 건조되어야 합니다. 소프트웨어 메뉴에서 흐름 매개변수를 선택하고 압력을 40mbar로 설정하고 연속 중간 흐름을 시작하여 액체 매체로 펌프 튜브를 플러시합니다. (이러한 설정은 추가 그림 1의빨간색 화살표로도 표시됩니다.)
   3. 흐름 재배의 원하는 전단 응력 주기를 프로그래밍합니다. 5 dyn/cm^2로시작하여 균형 잡힌 저수지 pumpinng을 제어하고 펌프 시스템에서 기포가 순환하지 않도록하십시오.
      참고: 채널 슬라이드의 벽 전단 응력은 관류 매체의 유량 및 점도에 따라 달라집니다. 다른 펌프 시스템을 사용하는 경우, 원하는 전단 응력 레벨을 생성하는 유량을 설정하기 위해 소개에 설명된 방정식을 참조하십시오. 설명된 설정은 5.42 mL/min.의 유량에 해당합니다(압력 펌프 소프트웨어에서 적절한 유동 파라미터 설정을 보여주는 예시적인 스크린 샷은 보충 도 2에나와 있습니다).
   4. 펌프 제어 소프트웨어의 흐름 순환을 중지하고 Luer 연결 부근의 튜브를 클램핑하여 관류 튜브의 중간 흐름을 유지합니다. 채널 슬라이드를 연결하여 기포를 피하고, 연결된 채널 슬라이드를 37°C 및 5%_CO2에서CO2 인큐베이터에 놓습니다. 전단 응력 레벨을 가속화하기 전에 전단 응력에 의해 생성된 힘에 세포를 원활하게 적응시키기 위해 30분 동안 5^{dyn/cm2에서} 전단 응력을 시작합니다(보충 그림 3참조).
      참고: 흐름에 기포의 움직임이 세포 분리로 이어질 수 있기 때문에 튜브 시스템 또는 튜브 시스템에 연결 한 후 슬라이드에 기포가 남아 있지 않습니다주의하십시오.
   5. 전단 응력10 dyn/cm2(이 흐름 설정에서 10.86 mL/min에 해당)로 가속하고 37°C에서 작은_CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 연속 전단 응력으로 채널 슬라이드를 배양하여 세포 분화를 허용합니다( 각 소프트웨어 세팅은 보조 그림 4)에서빨간색 화살표로 표시됩니다.
      참고: HUVEC 세포는 흐름 재배가 직접 10 dyn/cm^2에서시작되는 경우 채널 표면에서 분리되는 경향이 있습니다. 유동 재배가 최소 30분 동안 5dyn/cm2를 사용하여 적은 전단 응력으로 시작되고 원하는 10 dyn/cm2까지 천천히 전단응력증가를 증가시키면 세포는 챔버 표면에 부착된 상태로 유지된다. VWF 스트링 형성에 필요한 이 관류 설정에서 10dyn/cm^2의 전단 응력은 최소 값입니다.
   6. 24시간 동안 미세유체 세포 재배를 한 후, 두 중간 저수지에서 균형 잡힌 중간 수준에 도달하면 펌프 제어 소프트웨어로 중간 흐름을 중지하십시오. 유체 단위를 깨끗한 벤치에 놓고 10 mL의 혈청학적 파이펫을 사용하여 관류 저장소의 순환 재배 매체의 10 mL를 제거합니다. 10 mL의 ECGMS-medium을 저장소에 추가하여 매질을 갱신하고, 유체 단위를 37°C 및 5%_CO2에서CO2 인큐베이터에 다시 넣고, 펌프 제어 소프트웨어를 사용하여 유체 재배를 다시 시작합니다.
      참고: 압력 펌프의 기능은 큰 원심분리기와 같은 실험실 기계에 의해 갑자기 중단될 수 있으며, 이로 인해 강한 자기장 교란이 발생할 수 있습니다. 이 급격한 중단은 세포 분리로 이끌어 낼 수 있습니다. 실험 중에 압력 펌프 근처에서 이러한 기계가 활성화되지 않도록 주의하십시오.
   7. 현미경 시각화 전에 온도 평형을 위해 37°C로 형광 현미경의 단계를 덮는 온도 인큐베이션 챔버의 사전 온난화를 시작한다. 현미경이 미리 웜화된 후, 현미경 소프트웨어 제어를 시작하고 적절한 필터 설정(RFP 발현 박테리아의 검출을 위한 540 nm/590 nm)을 선택하여 형광 현미경 모니터링을 위한 주요 설정을 조정하고 FITC 컨쥬게이트 VWF 특이적 항체의 플루오레세인 방출 검출을 위한 470 nm/515 nm). 37°C에서 유체 단위의 인큐베이션을 위해 추가가열 챔버를 미리 따뜻하게 한다.
      참고: 감염 분석 및 현미경 모니터링 동안 채널 슬라이드와 순환 매체의 온도는 실질적으로 감소하지 않아야, 이 세포에 차가운 스트레스를 생성하기 때문에. 일반적으로, 현미경 스테이지를 덮는 온도 챔버의 크기는 전체 유체 단위를 커버하기에 충분하지 않다. 따라서 37°C로 미리 가열된 추가 가열 챔버를 사용하는 것이 좋습니다.
   8. 현미경 시각화를 위해 유체 단위를 37°C 미리 가열 된 가열 챔버에 놓고 채널 슬라이드를 37 °C 미리 온난화 된 현미경의 단계에 놓습니다.
      참고: 현미경 시각화를 위해, 유체 단위 및 채널 슬라이드는 관류 튜브의 제한된 길이로 인해_CO2 인큐베이터에서 제거될 필요가 있었다. pH 완충을 위해 5%_CO2 대기 밖에서 감염 시간 및 180분 이상의 현미경 모니터링이 필요한 경우, pH 버퍼링 배지를 미세 유체 재배에 사용해야 합니다.
   9. 히스타민과 박테리아를 주입하기 전에 HUVEC 층의 세포 형태및 무결성을 현미경의 밝은 필드 모드를 사용하여 유동 실험을 마친 후 유동 순환을 제어한다.

4. VWF 릴리스 유도 및 멀티머드 VWF 현의 시각화

1. VWF의 다중화를 최대 200MDa의 긴 스트링으로 트리거하려면 10dyn/cm^2의 전단 응력이 필요하기 때문에 흐름 설정을 유지합니다. 내피 WPB로부터 VWF의 방출을 유도하여 100 mM 히스타민 스톡 용액의 136 μL을 주입 포트를 사용하여 관류 튜브에서 순환하는 ECGMS-배지에 주입한다. 유량 배지에서 히스타민의 최종 농도는 1 mM이 될 것이다. 사출 포트를 사용할 수 없는 경우, 히스타민은 펌프 저장소의 매질로 파이펫팅하여 대체로 첨가될 수 있습니다.
2. 다중 증폭 VWF 현의 면역형 광 검출을 위해, 저수지의 균형 잡힌 중간 수준에 도달하면 흐름을 중지하고, 200 μL PBS (pH 7.4)의 부피에서 VWF 특이적 FITC 컨쥬게이트 항체의 20 μg을 순환 13.6 mL에 주입하십시오. 주입 포트를 사용하는 ECGMS-매체. 사출 포트를 사용할 수 없는 경우, 항체는 펌프 저장소의 매질로 파이펫팅하여 대안적으로 첨가될 수 있다. 이것은 1.3 μg/mL의 최종 항체 농도 귀착됩니다.
3. 짧은 시간에 여러 시야각을 현미경으로 스캔하는 경우 30%의 전력으로 제논 형광 장치와 에피플루시션 카메라를 사용하여 현미경의 형광 장치를 사용하십시오. 밝은 필드 모드로 HUVEC 레이어의 모양과 형태를 모니터링하여 VWF 문자열 시각화에 적합한 대표 셀을 선택합니다.
4. 녹색 형광 VWF 문자열의 시각화를 위해 현미경 소프트웨어(LasX)의 형광 단위 메뉴에서 63x/1.40 오일 대물렌즈와 470nm 검출 필터를 선택하십시오. 50개 이상의 대표 필드 뷰의 Z 스택스냅샷을 생성하며, 각 뷰에는 약 10개의 형태학적으로 손상되지 않은 HUVEC가 포함되어 있습니다. 서로 다른 시점에서 녹색 형광 VWF 문자열의 정량화를 위해 여러 시야를 스캔합니다.

5. 실시간으로 흐름에서 VWF 문자열에 세균 부착의 현미경 평가

1. 면역형광 검출을 통해 HUVEC 세포 표면에서 생성된 VWF 현에 대한 폐렴구균 부착을 정량화합니다.
   1. 유동을 잡고 사출 포트를 사용하여 ECGMS 매체에 최대 부피 1 mL의 1 mL에서 1.35 x 10⁸ CFU/mL RFP 발현 폐렴구균을 주입합니다. 대안적으로, 박테리아를 펌프 저장소 내의 배지 내로 피펫한다. 10 dyn/cm^2에서 전단 응력재를 다시 시작하여 박테리아가 펌프 시스템 내에서 순환하도록 합니다.
   2. 현미경 배율을 위한 63x 오일 침지 목표를 선택하고 RFP 발현 폐렴구균 검출을 위해 현미경 소프트웨어의 형광 필터 설정을 RFP 채널(540 nm 검출 필터)으로 조정합니다.
   3. VWF 문자열에 대한 세균 부착의 정량화를 위해 흐름을 중지하고 최소 30개의 대표 필드 뷰의 Z 스택스냅샷을 생성하며, 각각 약 10개의 형태학적으로 손상되지 않은 HUVEC를 포함하고 폐렴구균의 양을 계산합니다.
   4. ANOVA 1인자 통계 알고리즘을 사용하여 데이터를 평가한 다음 자세한 통계 비교를 위해 포스트 혹 두 꼬리 의 쌍을 이루지 않은 샘플 테스트를 수행합니다. <0.05의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

6. 샘플 고정 후 VWF 문자열에 대한 세균 부착의 현미경 평가

1. 면역형광 염색 전에 고정을 샘플링합니다.
   1. 흐름을 멈추고 펌프 저장소에서 ECGMS-매체 10 mL를 제거하고 5 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 보충 된 PBS 10 mL을 추가하십시오. PFA 용액이 10 dyn/cm^2의전단 응력에서 10 분 동안 순환시키십시오.
   2. 펌프 장치에서 채널 슬라이드를 분리합니다.
2. 세포 표면에 비특이적 결합 부위를 차단하고 VWF 문자열 및 부착 된 박테리아의 면역 검출을 수행합니다.
   1. 모든 세척 단계에 대해 4% 자당으로 보충된 100 mM Na₂CO_3(pH 9.2)를 함유하는 세척 용액 4 mL을 준비합니다. 100 mM_Na2CO3 (pH 9.2)를 함유하는 차단 용액의 1 mL을 4 % 자당및 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 보충하여 비특이적 결합 부위의 차단을 준비하십시오.
   2. 1 mL 루어 주사기를 사용하여 PFA 배양 채널 슬라이드를 3x 세척하여 세척 용액의 200 μL을 주입하고 200 μL 차단 용액으로 RT에서 120 분 동안 슬라이드를 인큐베이션합니다.
   3. 항체의 희석을 위해 4% 자당 및 0.5% BSA로 보충된 100 mM_Na2CO3,(pH 9.2)를 함유하는 또 다른 차단 용액의 4 mL를 준비한다. 이 차단 용액의 200 μL을 사용하여 폐렴구균 특이적 토끼 항혈전을 희석1:100. VWF 특이적 마우스 항체를 1:50 희석하여 VWF 특이적 항체 농도가 4 μg/mL로 만들기 위해 이 차단 용액의 200 μL을 사용하십시오. 2 mg/mL 스톡 용액에서 AlexaFluor488-컨쥬게이트 이차 항체를 200 μL(pH 7.4)에서 1:100으로 희석하여 최종 농도를 20 μg/mL로 생성합니다.
      참고: 기재된 면역형광 설정에서, 항체 검출은 전술한 알칼리성 탄산염 완충액에서 항체가 희석되었을 때 최적의 결과를 전달한다. 이전 결과에 기초하여, 권장 차단 용액 및 항체의 양은 많은 응용 분야에 적합합니다. 그러나, 상이한 실험은 차단 완충제의 항체 조합, 항체 농도, 배양 시간 및 체화의 개별적인 최적화를 요구할 수 있다. 대안으로서, 중성 pH 범위를 가진 인산염 버퍼링 시스템은 인큐베이션 버퍼로서 적합하거나 심지어 바람직할 수 있다. 형광 신호가 약한 경우 이차 항체의 농도를 증가시켜야합니다. 너무 많은 비특이적 형광 배경 잡음이 감지되면 차단 물질의 양을 늘려야합니다.
   4. VWF-면역형 광형 염색의 경우, 세탁용액의 200 μL을 3x 주입하여 1mL 루어 주사기를 사용하여 채널 슬라이드를 세척하고 RT에서 30분 동안 1:50 희석된 VWF 특이적 항체로 슬라이드를 인큐베이션한 후, 채널 슬라이드를 200으로 다시 3배 세척합니다. μL 세척액을 RT에서 30분 동안 1:100 희석된 AlexaFluor488-컨쥬게이션된 마우스 특이적 항체로 슬라이드를 인큐베이션한다. 마지막으로, 200 μL의 세척 용액으로 채널 슬라이드를 다시 3배 세척합니다.
      참고: 알렉사플루오르형광은 표백에 민감합니다. 따라서, 슬라이드는 형광 공형 항체와 인큐베이션 단계 동안 어두운 챔버에 유지하여 보호되어야한다.
   5. 폐렴구균의 면역 검출을 위해 RT에서 30 분 동안 1 :100 희석 된 폐렴 구균 특이적 토끼 항체로 슬라이드를 배양한 후, 채널 슬라이드를 3x로 세척 용액200 μL로 세척하고 1 :100 희석된 슬라이드를 배양하십시오. AlexaFluor568-컨쥬게이트 토끼 특이적 항체를 RT에서 30분 동안 세척용액의 200 μL로 다시 3x 세척한다.
   6. 형광 성 파할로이드로 세포 세포 골격을 염색하려면 RT에서 5 분 동안 0.1 % 트리톤 X-100의 120 μL로 배양하여 HUVEC를 투과시켜 세척 용액의 200 μL로 채널 슬라이드를 3x 씻고 120 μL의 120 μL로 슬라이드를 배양하십시오. 알렉사플루오르350-컨쥬게이드 팔로이드. 이 배양 단계는 중합된 세포골격을 시각화하고 세포 모양및 가능한 스트레스 유발 형태학적 변화의 모니터링을 허용한다.
   7. 세척 용액의 200 μL로 채널 슬라이드를 3x 세척하십시오. 마지막으로, 슬라이드를 200 μL ddH₂O로 4x 세척하고 형광 현미경에 적절한 필터 설정을 사용하여 녹색 형광 VWF 현, 적색 형광 박테리아 및 청색 형광 액틴 세포 골격을 시각화합니다.

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결과

일정한 단방향 흐름에서 1차 HUVEC를 배양하면, 메카노에민티드 VWF^13,14로채워진 셀룰러 WPB의 생성을 촉진하는 풍부하고 단단히 포장된 세포층의 형성을 초래한다. 이 프로토콜은 인간의 혈류에서 전단 응력 상황을 모방해야 하는 감염 분석을 위해 공기압 펌프 기반의 펄스리스 재순환 시스템의 사용을 설명합니다.

이 시스템은 소프?...

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토론

VWF와 같은 메카노에민성 숙주 단백질과의 세균 상호 작용 시뮬레이션은 정의된 단방향 및 연속적인 액체 흐름을 생성할 수 있는 이난 세포 배양 시스템을 필요로 하며, 이로 인해 신뢰할 수 있는 전단 응력 생성 . 여러 미세 유체 펌프 시스템이 이미 설명되어 있습니다. Bergmann 외에서 포괄적인 검토는 상이한 2차원 및 3차원 세포 배양^{모델(17)의}주요 측면을 요약한다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-syringe	Fisher Scientific	10303002	with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe	Sarstedt	9077136	For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase	eBioscience now thermo fisher	00-4555-56	protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin	Abcam	ab176751	no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody	Thermo Fisher Sientific	A11001	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11011	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-25G	solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter	TPP	90026	subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R	Beckman Coulter Life Sciences	392304	spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK	Hermle	305.00 V05 - Z 216 M	spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing	ibidi	10821	for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator	Fisher Scientific	MIDI 40	incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-Incubator	Sanyo	MCO-18 AIC	for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar plates	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer	Dell	Latitude 3440	Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)	Leica	DMi8	An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3904.1	used for PBS buffer
Drying material	Merck	101969	orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix	Promocell	C-39215	supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMS	Promocell	C-22010	ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)	Promocell	C-22010	culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)	biochrome now Merck	S 0415	supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody	Abcam	ab8822	stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit	ibidi	10903	fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)	Sigma Aldrich	G-1890-100g	for precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochloride	Sigma Aldrich	H-7250-10MG	for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)	Promocell	C-12203 Lot-Nr. 396Z042	primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)	Santa Cruz	sc73268	stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port	ibidi	10820	for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope	Zeiss	Axiovert 35M	inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)	ibidi	80176	physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)	Sigma Aldrich	M7506-500G	For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump	ibidi	10905	air pressure pump
Neubauer cell counting chamber	Karl Hecht GmbH&Co KG	40442002	microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710-S	for cross linking of samples
Perfusion Set	ibidi	10964	Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)			the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes	Sarstedt	67,741	(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum	Pineda		raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate			this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	6781.1	used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)	ibidi	v1.5.4	Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mL	Sarstedt	72.706/ 72.695.500	required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volume	Sarstedt	6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci	National Collection of Type Cultures, Public Health England	10,319	Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mL	Sarstedt	86.1253.025/ 86.1254.025	for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)	Sigma Aldrich	451614-25G	for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	P030.2	used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22	Biochrom	80-2115-20	measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G	for preparation of blocking buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-500ML	Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract	oxoid	LP0021	bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY