JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نقدم بروتوكولا لعزل الخلايا الصغيرة من المناطق تشريح مختلفه من نصف الكره الدماغ الفار الكبار ، تليها اعداد المكتبة شبه المؤتمتة لعمق خليه واحده الحمض الريبي النيبالي تسلسل كامل طول الكتابات النصية. ستساعد هذه الطريقة علي توضيح التغاير الوظيفي للدبقيه الصغيرة في الصحة والمرض.

Abstract

كما الضامة المقيمين في الجهاز العصبي المركزي ، الميكروبات الصغيرة بنشاط السيطرة علي نمو الدماغ والتوازن ، واختلالاتها قد تدفع الامراض البشرية. وقد أحرز تقدم كبير للكشف عن التواقيع الجزيئية من الخلايا الصغيرة الساكنة ، فضلا عن التغييرات في التعبير الجيني لديها استجابه للمؤثرات البيئية. مع ظهور ونضوج المنهجيات الجينية أحاديه الخلية ، فانه من المسلم به بشكل متزايد ان غير متجانس الصغيرة قد تكمن وراء الأدوار المتنوعة التي تلعبها في الظروف التنموية والمرضية المختلفة. ويمكن تحقيق مزيد من التشريح لهذا التغاير من خلال العزل الفعال للخلايا الصغيرة من منطقه معينه من الاهتمام ، يليه التنميط الحساس لكل خليه. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول مفصل للعزل السريع من الخلايا الصغيرة من مناطق الدماغ المختلفة في نصف الكره الدماغية الماوس الكبار واحد. ونحن أيضا شرح كيفيه استخدام هذه الخلايا الصغيرة فرزها لتسلسل المستندة إلى لوحه عميقة الحمض الريبي النيبالي. ونناقش قابليه هذه الطريقة للتكيف مع سيناريوهات أخرى ونقدم مبادئ توجيهيه لتحسين النظام لاستيعاب الدراسات الواسعة النطاق.

Introduction

الأجزاء الصغيرة التي تمثل 5% − 10% من جميع الخلايا العصبية هي الضامة المقيمة المنتشرة في جميع انحاء الجهاز العصبي المركزي (CNS)1. المحمية وراء حاجز الدم في الدماغ, الميكروبات النموذجية في الدماغ الكبار صحية تحتوي علي العديد من العمليات الدقيقة التي تمتد بسرعة والتراجع للتفاعل مع الخلايا العصبية وغيرها من الكريات الدبقيه في parenchyma. ويمكن أيضا ان تعتمد الخلايا الصغيرة المورفولوجية الشكل الأميبا المرتبطة بزيادة وظيفة البالعة خلال مراحل تنموية محدده أو عند التحديات المناعية في الإصابات والامراض1،2،3،4. كما يتم توضيح المزيد من وظائف الخلايا الصغيرة الصغرى ، ويغذي الاثاره أكثر من الدراسات علم الوراثة البشرية ، والتي أظهرت ان العديد من الجينات خطر الامراض العصبية ، مثل TREM2 ، هي في الغالب أو حصرا التي أعرب عنها ميكروليا5،6،7. نظرا لأهميتها في التنمية والأدوار المعقولة القيادة المرض, وقد تم مؤخرا بذل جهد هائل نحو فهمنا لتنظيم الجينات ميكروجليال ووظيفة في الأمل في العثور علي أهداف علاجيه جديده للامراض التنكسية العصبية1,8.

ويسمح تسلسل الحمض الريبي النيبالي (RNA-seq) بتوصيف غير متحيز للتعبير الجيني الخاص بنوع الخلية ، والذي بدوره يرشد العلماء إلى التحقيق في وظائف الجينات في الشبكات الخلوية الكثيفة7. وقد تم الحمض الريبي النيبالي-seq في الغالب علي عينات السائبة ، مما يؤدي إلى اكتشاف التوقيع الجينات ميكروجليال التماثل الذي يميزها عن الخلايا العصبية والمناعية الأخرى9. ومع ذلك ، يمكن ان يغفل هذا النهج الاختلافات الجزيئية والوظيفية بين الخلايا الصغيرة ، وخاصه تلك الموجودة بشكل عابر في التنمية ، أو المرتبطة بالشيخوخة والمرض. وفي الواقع ، فان الخلية الواحدة RNA-seq (scrna-seq) تقدم الحساسية والدقة التي أحدثت ثوره في المجال من خلال الكشف عن عدم التجانس في السابق من الميكروبات الصغيرة في مجموعه متنوعة من السياقات2،3،10. الاضافه إلى ذلك ، ونظرا لوجود خلايا مناعية مماثله أخرى في واجهه الجهاز العصبي الدوران ، يوفر scRNA-seq معلومات تساعد علي تصميم أدوات جديده لفصل وتشريح وظيفيا هذه الخلايا ذات الصلة مع القليل من المعرفة السابقة2،11.

وقد تم اختراع مجموعه متنوعة من المنصات التي تليها scRNA ، كل مناسبه لتطبيقات معينه12. وبصفه عامه ، فان الطرق القائمة علي القطرات ، مثل الجينوم الجيني 10x ، تكون اعلي في الانتاجيه مع (عشرات) آلاف الخلايا المتسلسلة في كل شوط ، وهي اقل انتقائية للمدخلات التي قد تحتوي علي مجموعات مختلطة من الخلايا التي تتطلب تصنيفا واسعا. توفر الطرق المستندة إلى اللوحة حساسية اعلي وقراءه العمق13،14، وعاده ما تستهدف الفئات السكانية المحددة من فرز الخلايا للكشف عن الاختلافات الدقيقة أو النصوص النادرة.

هنا ، ونحن نقدم تفاصيل حول كيفيه عزل الخلايا الصغيرة من مناطق مختلفه من الدماغ الماوس تشريح من نصف الكره الواحد ، والتي تستخدم لخليه واحده (أو السائبة) الحمض الريبي النيبالي-seq بعد اجراء شبه الألى لوحه القائمة علي التحضير للمكتبة. ويمكن بعد ذلك استخدام نصف الكره الآخر للتحقق من صحة الانسجه. تبسيط من الطريقة المنشورة سابقا9، ويهدف هذا البروتوكول العزلة لتعظيم العائد من كميه صغيره من مواد البداية ، وفي الوقت نفسه الحفاظ علي ملامح التعبير الجيني ميكروجليال الذاتية. نستخدم الفرز الخلوي المنشط (FACS) لإثراء الأجزاء الصغيرة (أو الخلايا المناعية الأخرى ذات الاهتمام) في لوحات 96 وتصغير احجام الكواشف لاعداد المكتبة من أجل زيادة الانتاجيه. ونحن نسلط الضوء علي هذه المنصة الحساسة ، علي الرغم من انه يمكن تطبيق استراتيجيات أخرى قائمه علي اللوحات. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهوله لعزل الخلايا الصغيرة من الانسجه الأخرى التي تم تشريحها ، مثل الاصابه أو بؤر المرض ، ويمكن ان يختلف عمر الماوس عبر اي مراحل ما بعد الولادة تقريبا. ومن شان العزل الفعال للخلايا الصغيرة الاقليميه للدراسات الناسخة أحاديه الخلية ان يسهل الفهم الأفضل لوظائفهم في مجال الصحة والمرض.

Protocol

وتتفق جميع الإجراءات المتعلقة بالقوارض مع المبادئ التوجيهية لجامعه ستانفورد ، التي تمتثل للقوانين والسياسات الوطنية والولائية. تمت الموافقة علي جميع الإجراءات الحيوانية من قبل الفريق الإداري لجامعه ستانفورد المعني برعاية الماشية في المختبرات.

ملاحظه: يتم توفير جميع التراكيب الحلوالعازلة في جدول المواد.

1. التحضير يوم عزل الخلايا

  1. اعداد الكواشف التالية والبرد لهم علي الجليد: المتوسطة A (50 mL) ، المغناطيسي تنشيط الخلية الفرز (الاشراف) المخزن المؤقت (الاشراف) (30 مل) ، العازلة FACS (25 مل) ، الفوسفات-مخزنه المالحة (التلفزيونية المؤقتة ؛ 30 مل) ، DNase Ase
    ملاحظه: وحدات التخزين المقدمة هنا كافيه لعزل الخلايا الصغيرة من 4 مناطق الدماغ (علي سبيل المثال ، القشرة ، المخيخ ، الحصين والمخطط) من نصف الكره الدماغية ماوس واحد. التوسع في حاله استخدام المزيد من الانسجه.
  2. وضع أربعه نظيفه 2 مل Dounce الخالطون علي الجليد وأضافه 2 مل من متوسطه A مع 80 μL من DNase (12,500 وحده/مل) و 5 μL من مثبطات RNase في كل الخالطون Dounce. البرد المكابس في أنابيب 15 مل.
  3. تسميه أربعه 6 سم بيتري الاطباق مع مناطق الدماغ لجمع الانسجه وأضافه 200 μL من المتوسطة الباردة A في كل طبق علي الجليد. أضافه حوالي 5 مل من المتوسطة A في صحن بيتري 6 سم لتشريح.
    ملاحظه: قبل الاستخدام ، تاكد من ان جميع الكواشف معقمه ومناسبه لتطبيقات RNA. مقاعد البدلاء وأداات تشريح تحتاج إلى ان تكون نظيفه ورش مع محلول أزاله التلوث RNase (جدول المواد).

2. تشريح منطقه الدماغ

ملاحظه: هذه الخطوة يجب ان يستغرق ~ 30 دقيقه.

  1. حقن 400 − 500 μL من الكيتامين/اكسيليازين (24 ملغ/مل الكيتامين و 2.4 ملغ/مل اكسيليازين) في الصفاق من الحدث إلى الكبار الفار مرحله (> 1 شهر من العمر).
    ملاحظه: ويستخدم الماوس الذكور هنا للتوضيح ، ولكن اما نوع الجنس هو مناسب.
  2. انتظر لمده 5 دقائق وقرصه مخلب الخلفية لضمان عدم التراجع.
  3. علي الفور استخدام 26 جرام x 3/8 ابره لأداء العمليات ترويه مع 20 − 30 مل من الجليد الباردة تلفزيوني حتى تنفد العازلة مع عدم وجود الدم مرئية.
  4. قطع راس الماوس مع زوج من المقص الجراحي. استخدام مقص صغير لقطع فتح الجلد لفضح تحت الجمجمة ، ومن ثم قطع من خلال خياطه السهمي ، خياطه أفاريز الباب وخياطه إكليلي. استخدام ملقط لسحب قباله كلا الجانبين من العظام الجدارية والعظام الجدارية دون الاضرار الانسجه ، ونقل بعناية الدماغ في الطبق بيتري تشريح مع المتوسطة ا.
  5. استخدم شفره مبرده مسبقا لقطع المخ من خلال الخط النصفي إلى نصفين.
    ملاحظه: مناطق الدماغ الاربعه الموصوفة هنا من نصف الكره الواحد تسفر عن اعداد كافيه من الخلايا الصغيرة للتطبيقات أحاديه الخلية أو الجزء الأكبر من الحمض الريبي-المتسلسل. الأخرى نصف كره يستطيع كنت استعملت ل مناعي أو [رنا] في موقعه تحقق.
  6. افصل المخيخ عن الفص القشري وجذع المخ بملقط #55 وانقل الانسجه إلى طبق بيتري الخاص بالمجموعة.
  7. استخدام ملقط #55 لتشريح بعناية من الحصين والمخطط من القشرة ونقل كل الانسجه إلى مجموعه طبق بيتري.

3. تفكك الانسجه الميكانيكية

ملاحظه: إبقاء الخلايا والكواشف بارده في كل وقت الا اثناء الخطوات تلطيخ. هذه الخطوة يجب ان يستغرق ~ 30 دقيقه.

  1. ختم كل نسيج الدماغ مع شفره الحلاقة في < 1 مم3 قطع دقيقه.
  2. استخدام ماصه 1 مل (مع قطع نصائح) لنقل قطع الانسجه إلى الخالطون Dounce قبل المبردة ، كل منها يحتوي علي 2 مل من المتوسطة A مع DNase ومثبط RNase.
  3. تجانس النسيج عن طريق التواء ببطء المكبس داخل وخارج الخالط Dounce لمده 6 − 10 السكتات الدماغية الكاملة ، حتى لا توجد قطع مرئية.
    ملاحظه: دونسينج يقتل الخلايا العصبية ومعظم الكريات الأخرى ولكن ترك خلايا ميكروجليال سليمه بدلا. كلا غير كافيه والإفراط في الدونسينج يمكن ان يؤدي إلى انخفاض الغلة من الخلايا.
  4. نقل الانسجه غير المنفصلة في أنابيب 50 mL من خلال strainers 70 μm.
  5. شطف كل الخالط Dounce والمكبس مع ما مجموعه 6 مل من المتوسطة الباردة A وتصفيه محلول الشطف من خلال نفس مصفاه في أنبوب المقابلة.
  6. نقل المعلقات خليه واحده (حوالي 8 مل لكل) في 15 مل أنابيب مخروطيه وأجهزه الطرد المركزي في 400 x g ل 5 دقيقه في 4 °c مع الفرامل = 5.

4. أزاله الميالين

ملاحظه: هذه الخطوة يجب ان يستغرق ~ 60 دقيقه.

  1. اعداد 1 العمود استنزاف كبير (LD) (للقشرة) و 3 اختيار كبير (LS) الاعمده (للمناطق 3 الأخرى) في فاصلالمغناطيسي (جدول المواد). شطف كل عمود مع 3 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف.
  2. بمجرد الانتهاء من طرد ، ماصه خارج وتجاهل ماده طافي دون إزعاج بيليه. بالنسبة للانسجه القشرة والمخيخ ، أعاده تعليق الخلايا في 850 μL من المخزن المؤقت للرصد والتقييم مع 1.8 μL من مثبط RNase. بالنسبة للانسجه الحصينة والشريطية ، أعاده تعليق الخلايا في 400 μL من المخزن المؤقت للرصد والتقييم مع 0.9 μL من مثبط RNase.
    ملاحظه: يتم تحسين الاعمده (LD مقابل LS) ووحده التخزين المستخدمة لأعاده التعليق استنادا إلى كميه الميلين الموجودة في الانسجه. إذا كانت المناطق الدماغية الأخرى التي يتم التهاوي, هذه الشروط قد تحتاج إلى تعديل اعتمادا علي حجم الانسجه ومقدار الميالين قد تكون موجودة. يمكن تقدير فعاليه أزاله الميلين في الخطوة 4.9.
  3. أضافه 100 μl من الخرز أزاله المايلين كل في الخلايا من القشرة والمخيخ وأضافه 50 μl من الخرز أزاله المايلين كل في الخلايا من الحصين والشريطية.
  4. تخلط برفق الخلايا مع الخرز واحتضان الأنابيب علي الجليد لمده 10 دقيقه.
  5. جلب حجم الأنبوب مع الخلايا القشرية إلى 2 مل مع المخزن المؤقت للرصد والاشراف ، وجميع الآخرين إلى 1 مل (اي ، أضافه 1 مل للخلايا القشرية ؛ 500 μL للخلايا الهيبوكامباله والشريطية ؛ لا حاجه لأضافه العازلة إلى الخلايا المخيخ).
  6. مره واحده الاعمده فارغه من الشطف العازلة ، ووضع أنبوب 15 مل تحت كل عمود. تحميل الخلايا القشرية (2 مل) علي العمود LD ، وجميع الآخرين (1 مل لكل منهما) علي أعمده LS. علي الفور استخدام 1 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف لكل منهما لغسل الأنابيب الاصليه وتحميل الحل علي الاعمده المقابلة.
  7. غسل العمود LD مره واحده مع 1 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف وغسل كل عمود LS مرتين مع 1 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف كل غسل. الاستمرار في جمع الحل من خلال التدفق اثناء الغسيل.
  8. تصفيه الخلايا في أنابيب FACS أسفل الجولة من خلال قبعات مصفاه 35 μm.
    ملاحظه: وينبغي لكل أنبوب جمع حوالي 4 مل من تعليق خليه واحده المنضب من myelin.
  9. اختياريا ، خذ 10 μL من تعليق الخلية ومزجها مع 10 μL من 0.4% الحل الأزرق التريبين. فحص الخلايا تحت 10x المجهر حقل مشرق لتقدير العائد ، ومعدل البقاء علي قيد الحياة ومستوي myelin المتبقية.
    ملاحظه: التحضير الناجح يجب ان يولد أكثر من 90% من الخلايا الحية (مستديرة الشكل وباستثناء الصبغة الزرقاء) مع القليل من الحطام العضلي.
  10. الخلايا بيليه في أنابيب FACS في 400 x g ل 5 دقيقه في 4 °c ، مع الفرامل = 5. يصب ببطء ماده طافي والداب حافه الأنبوب علي الورق المناديل. أعاده تعليق الخلايا في كل أنبوب مع 300 μL من المخزن المؤقت FACS.
    ملاحظه: إذا كان الفرز الاشراف المفضل ، يمكن استخدام CD11b الخرز لاختيار الخلايا الدقيقة وغيرها من الكريات النخاعية بعد أزاله الميلين. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه الخلايا لغير المستندة إلى لوحه scRNA-seq ، فضلا عن الجزء الأكبر RNA-seq. والتحذير من هذا النهج البديل هو ان الخرز CD11b لا تفصل الخلايا الصغيرة الأخرى من الخلية المناعية ذات الصلة التي هي أيضا ايجابيه لهذا مستضد.

5. تلطيخ لفرز الخلايا المنشطة الفلورية

ملاحظه: هذه الخطوة يجب ان يستغرق ~ 40 دقيقه.

  1. أضافه 5 μL من الماوس Fc مستقبلات كتله كاشف (جدول المواد) في كل أنبوب. احتضان لمده 5 دقائق علي الجليد.
  2. أضافه 1 μL من CD45-Cy7 و 1 μL من CD11b-BV421 في كل أنبوب.
    ملاحظه: ويمكن استخدام الأجسام المضادة مع الفلوبهورس المترافقة الأخرى. يمكن أيضا تضمين الأجسام المضادة ضد TMEM119 ، وهي علامة محدده للمسكنات الصغيرة الساكنة9، ولكن من المستحسن استخدامها مع CD45 و CD11b ، لان بعض الفئات الفرعية من الخلايا الصغيرة قد تفقد TMEM119 تعبير السطح.
  3. احتضان الأنابيب علي شاكر لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT).
  4. أضافه 2 مل من العازلة FACS لغسل.
  5. الخلايا بيليه في 4 درجه مئوية ، 400 x g لمده 5 دقائق ببطء تصب في ماده طافي والداب علي حافه الأنبوب علي المناديل الورقية. أعاده التعليق الخلايا في كل أنبوب باستخدام 400 μL من المخزن المؤقت FACS مع 1 μL من مثبطات RNase و 0.5 μL من يوديد بروبيديوم (PI ، 1:1000 التخفيف).

6. مؤشر FACS الفرز

ملاحظه: يجب ان تاخذ هذه الخطوة ~ 1 h.

  1. بعد اجراء FACS القياسية ، ورسم بوابات علي أساس مبعثر (باستثناء الحطام) ، وخلايا واحده ، والخلايا الحية (PI السلبية) ، الخلايا الصغيرة والكريات النخاعية (CD45 +،CD11b +).
    ملاحظه: الخلايا ميكروجليال النموذجية اكسبرس CD45 في مستويات اقل مقارنه مع الضامة الأخرى المرتبطة الحدود ، مثل الضامة الوعائية والمكورات السحائية ، التالي النابضة علي CD45 منخفضهCD11b + يجب ان تكون كافيه إذا كان تركيز البحث هو ملامح التعبير الجيني فيهذهالكلاسيكية الصغرى ومع ذلك ، قد يكون بعض مجموعات فرعيه من الخلايا الصغيرة الصغرى التعبير CD45 اعلي وهذا صحيح بشكل خاص اثناء التنمية أو في ظروف المرض. لضمان التحليل غير المتحيز للتعبير الجيني المجهري ، يمكن تسجيل CD45 عاليه و CD45 منخفضه الإيمونوفينوتيبيس من خلال اعداد الفرز الفهرس وجمع كل من السكان للتسلسل وتحليل المصب. الاضافه إلى ذلك ، TMEM119 التعبير السطحي يمكن استخدامها لاستهداف السكان ميكروجليال الساكنة (انظر الخطوة 5.2) وتحليلها مع مستويات CD45 ونتائج التسلسل.
  2. فرز الخلايا الصغيرة واحده (مع فوهه 100 μm) في 96-بئر البلمره سلسله تفاعل (PCR) لوحات, تحتوي علي 4 μL من تحلل العازلة كل بئر (انظر البروتوكول المنشور14 للحصول علي التفاصيل).
    ملاحظه: الخارجية [رنا] تحكم اتحاد ([رك]) [رنا] سبايك-في مزيج (جدول المواد) يستطيع كنت أضفت في 1:2.4 x 107 في ال تحلل عازل لنوعيه تحكم وتطبيع أغراض2.
  3. لفتره وجيزة دوامه لوحات وتدور باستخدام جهاز الطرد المركزي اعلي مقعد.
  4. تجميد العينات علي الجليد الجاف فورا. تخزين لوحات في-80 درجه مئوية حتى اعداد المكتبة.
    ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن جمع المزيد من الخلايا في أنابيب 1.5 mL مع الجيش النيبالي المؤقت استخراج العازلة لمعظم RNA-seq. ووفقا لتجربه المؤلفين ، 3,000 خليه كافيه لإنشاء مكتبات ذات نوعيه جيده بعد البروتوكول المنشور2،14.

7. خليه واحده الجيش الريبي النيبالي تسلسل اعداد المكتبة

ملاحظه: هنا ، يتبع البروتوكول14 المنشورة لتوليد scrna-seq المكتبات مع المعونة من التعامل مع الروبوتات السائل وبعض التعديلات. في هذه المقالة ، يتم وصف الاجراء لفتره وجيزة فقط ، ويتم تمييز الاختلافات. معالجه 4 لوحات في وقت واحد يستغرق حوالي 2.5 أيام.

  1. ذوبان لوحات علي الجليد وأداء النسخ العكسي مع التمهيدي Oligo-dT30VN (في المخزن المؤقت تحلل) لتوليد cDNA مع الدوريات الحرارية (الجدول 1): 42 درجه مئوية 90 دقيقه ؛ 70 درجه مئوية 5 دقيقه; 4 درجه مئوية عقد. ثم تضخيم cDNA مع خطوه الهضم اضافيه التبرئة في البداية (الجدول 2) باستخدام المزيج الرئيسي pcr وفي الموقع PCR (ispcr) الإشعال (جدول المواد) وحاله pcr التالية: 37 درجه مئوية 30 دقيقه; 95 درجه مئوية 3 دقيقه; 23 دورات من 98 درجه مئوية 20 ثانيه ، 67 درجه مئوية 15 ثانيه ، 72 درجه مئوية 4 دقيقه ؛ 72 درجه مئوية 5 دقيقه.
  2. تنقيه cDNA باستخدام 18 μL من الخرز المغناطيسي في بئر (0.7:1 نسبه). احتضان لوحه علي موقف المغناطيسي لمده 5 دقائق وغسل العينات مرتين مع الطازجة 80 ٪ الايثانول ، 80 μL في كل بئر في كل مره. بعد تجفيف لوحه لمده 15-20 دقيقه ، الوت cdna مع 20 μl من العازلة لكل بئر.
    ملاحظه: لمراقبه الجودة ، واستخدام محلل جزء (حساسية عاليه الجيل التالي التسلسل [خ ع] تحليل الجزء ، 1 − 6000 bp) للتحقق من حجم التوزيعات وتركيزات cDNA ، وعينات عمليه أخرى فقط مع مسحه بين 500 − 5000 bp ، واعلي من 0.05 ng/μL.
  3. لإنشاء المكتبات ، ومزيج 0.4 μL من كل عينه cDNA مع 1.2 μL من الكواشف Tn5 التغريد من مجموعه اعداد المكتبة (جدول المواد) في لوحه 384 بشكل جيد مع المعونة من اله الأنابيب نانووليتر ، في 55 درجه مئوية 10 دقيقه.
    ملاحظه: هنا ، يتم أضافه 1/12.5 من حجم رد الفعل المقترح (5 عينه μL و 15 μL من الكواشف التغريد) من أجل خفض التكلفة وفي الوقت نفسه زيادة الانتاجيه. يتم استخدام اله الأنابيب نانونوليتر (جدول المواد) لنقل الكواشف (هذه والخطوات التالية) من والي لوحات 384.
  4. أضافه 0.4 μL من العازلة تحييد لوقف رد فعل التغريد في RT لمده 5 دقائق.
  5. أضافه 384 فهارس (جدول المواد، 0.4 μl إلى الامام و 0.4 μl عكس) ، 1.2 μl من PCR مزيج إلى عينات (2 μl كل) ، وتضخيم المكتبات باستخدام الشرط التالي: 72 °c 3 دقيقه ؛ 95 درجه مئوية 30 ثانيه; 10 دورات من 95 درجه مئوية 10 ثانيه ، 55 درجه مئوية 30 ثانيه ، 72 درجه مئوية 1 دقيقه ؛ 72 درجه مئوية 5 دقيقه.
  6. تجمع جميع المكتبات الفردية (تاخذ 1 μL كل) من نفس لوحه 384 معا ، واستخدام الخرز المغناطيسي (جدول المواد، 0.7:1 نسبه) لتنقيه المكتبات المجمعة النهائية.
  7. استخدام مقياس فلوري (جدول المواد) لقياس التركيزات ومحلل حيوي (جدول المواد) لفحص توزيعات حجم المكتبات المجمعة قبل التسلسل. استهداف عمق التسلسل في 1,000,000 القراءة الاوليه لكل خليه.
  8. اتبع إجراءات المعلوماتية الحيوية القياسية لتصفيه وتقليم التسلسل يقرا وتنفيذ المحاذاة2. استخدام جدول العد وبيانات التعريف كمدخلات للقيام بتحليل التجميع مع حزمه Seurat15.

النتائج

يصف هذا البروتوكول أسلوبا لعزل وفرز الخلايا الصغيرة من مناطق الدماغ المختلفة في نصف الكره الارضيه الدماغ البالغة ، تليها scRNA-seq. نحن نستخدم دونسينج لإنشاء تعليق خليه واحده وأيضا كخطوه اولي لإثراء الخلايا الصغيرة. نقص أو الإفراط في دونسينج يقلل من الغلة. الاضافه إلى ذلك ، تحتوي أدمغه الفئرا...

Discussion

الميكروبات تتفاعل بنشاط مع أنواع الخلايا الأخرى في الوحدة العصبية الخاصة ، وانها حساسة جدا للمؤثرات البيئية. من أجل التقليل من الاستجابات التهابيه والتغيرات الشاذة في التعبير الجيني اثناء عمليه العزل ، تم تبسيط هذا البروتوكول من الطريقة9المنشورة سابقا ، وهو الآن مناسب لعزل ...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

نشكر ماريكو ل. بينيت ، ليانا نيكول بونانو ، و سبيروس دارمانيس لمساعدتهم خلال تطوير هذا البروتوكول. ونشكر أيضا المرفق المشترك لمؤسسه "ستانفورد" ، ولا سيما ميريديث وايغلارز وليزا نيكولز ؛ ين تران ، مايكل Eckart من البروتين ستانفورد ومرفق الحمض النووي (PAN) لدعمهم الكبير للتصوير. ويتم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسه JPB ومؤسسه فنسنت j. Coates.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5 M BetaineSigma-AldrichCat# B0300-5VL
10 mM dNTP mixThermo Fisher ScientificCat# R0192
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher ScientificCat# 15575020
10X Hanks’ Balanced Salt SolutionThermo Fisher ScientificCat# 14185-052
1 M HEPESThermo Fisher ScientificCat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master MixKapa BiosciencesCat# KK2602
5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer CapCorningCat# 352235
AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp)Advanced AnalyticalCat# DNF-474-1000
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichCat# A8806
DNase IWorthingtonCat# LS002007Working solution: 12500 units/ml
DTT, Molecular GradePromegaCat# P1171
ERCC RNA Spike-In MixThermo Fisher ScientificCat# 4456740
Fetal Bovine SerumThermo Fisher ScientificCat# 10437-028
Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)IlluminaCat# FC-131-2001
Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)IlluminaCat# FC-131-2002
Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)IlluminaCat# FC-131-2003
Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)IlluminaCat# FC-131-2004
Lambda Exonuclease (5 U/μl)New England BioLabsCat# M0262S
Mouse Fc blockBD PharmingenCat# 553142
Myelin removal beadsMiltenyl BiotecCat# 130-096-433
Nextera XT DNA Sample Prep KitIlluminaCat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)IlluminaCat# 20024907
PBS (10X), pH 7.4Thermo Fisher ScientificCat# 70011044
PCRClean DX beadsAline BiosciencesCat# C-1003-50
Propidium IodideThermo Fisher ScientificCat# P3566Staining: 1:1000
Qubit dsDNA HS Assay KitThermal Fisher ScientificCat# Q32851
Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)BioLegendCat# 101236; RRID: AB_11203704Staining: 1:300
Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)Thermo Fisher ScientificCat# 25-0451-82; RRID: AB_469625Staining: 1:300
Recombinant RNase InhibitorTakara BioCat# 2313B
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)ClontechCat# 639538Containing 5x First strand buffer
Oligonucleotides
0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGT-3'		(Picelli et al., 2014)
Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA
GAGTACT 30 VN-3'		(Picelli et al., 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA
GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base)		(Picelli et al., 2014)
Solutions
FACS bufferRecipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS
MCS bufferRecipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS
Medium ARecipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red
Plates
384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen ScientificVWR89005-556
Hard-shell 96-well PCR platesBio-RadHSP9631
Others
Dumont #55 forcepsFine Science Tools11295-51
Dounce homogenizer, 2 mlWheaton357422
Large depletion columnMiltenyi Biotec130-042-901
Large selection columnMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976
RNAzapThermo Fisher ScientificAM9780
Strainer (70 μm)Falcon352350
Equipment
BD FACSAria IIBD Bioscienceshttp://www.bdbiosciences.com/
BioanalyzerAgilent2100
Fragment AnalyzerAgilent5300
Mosquito HTS nanoliter pipetting robotTTP Labtechhttps://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33226

References

  1. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  2. Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
  3. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  4. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  5. Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
  6. Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
  7. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  8. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  9. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  10. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  11. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  12. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
  13. Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
  14. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  17. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  18. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
  19. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  20. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
  21. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  22. Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
  23. Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), 79-89 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

154

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved