Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Riepilogo

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Abstract

Come macrofagi residenti nel sistema nervoso centrale, microglia controllano attivamente lo sviluppo cerebrale e l'omeostasi, e le loro disfunzioni possono guidare le malattie umane. Sono stati compiuti notevoli progressi per scoprire le firme molecolari della microglia omeostatica e le alterazioni della loro espressione genica in risposta agli stimoli ambientali. Con l'avvento e la maturazione delle metodologie genomiche unicellulari, è sempre più riconosciuto che la microglia eterogina può essere alla base dei diversi ruoli che svolgono in diverse condizioni di sviluppo e patologiche. Un'ulteriore dissezione di tale eterogeneità può essere ottenuta attraverso un isolamento efficiente delle microglia da una determinata regione di interesse, seguito da una profilazione sensibile delle singole cellule. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per il rapido isolamento della microglia da diverse regioni del cervello in un singolo emisfero certo adulto. Dimostriamo anche come utilizzare queste microglia ordinate per il sequenziamento profondo dell'RNA a cellule a base di piastre. Discutiamo l'adattabilità di questo metodo ad altri scenari e forniamo linee guida per migliorare il sistema per accogliere studi su larga scala.

Introduzione

Le microglia, che rappresentano il 5%-10% di tutte le cellule neurali, sono macrofagi residenti sparsi in tutto il sistema nervoso centrale (SNC)¹. Protetto dietro barriera emato-encefalica, microglia tipica in un cervello adulto sano contengono molti processi fini che si estendono rapidamente e si ritraggono per interagire con i neuroni e altre cellule gliali nel parenchyma. La microglia può anche adottare la morfologia ameboide associata ad una maggiore funzione fagocitica durante specifiche fasi di sviluppo o su sfide immunitarie in lesioni e malattie^1,2,3,4. Recenti scoperte entusiasmanti hanno chiaramente dimostrato che le microglia non sono affatto astanti passivi a segnali derivati dal cervello o patologici, ma svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dello sviluppo cerebrale e dell'omeostasi, ad esempio, sostenendo la sopravvivenza neuronale, potando sinapsi immature, promuovendo la differenziazione delle cellule lignaggio oligodocito e l'asgiogenesi^{1 .} Man mano che le funzioni della microglia sono chiarite, l'eccitazione è ulteriormente alimentata da studi di genetica umana, che hanno dimostrato che molti geni del rischio di malattie neurodegenerative, come TREM2, sono prevalentemente o esclusivamente espressi da microglia^5,6,7. Data la loro importanza nello sviluppo e nei plausibili ruoli guidati dalle malattie, recentemente è stato compiuto un enorme sforzo verso la nostra comprensione della regolazione genica microgliale e della funzione nella speranza di trovare nuovi bersagli terapeutici per le malattie neurodegenerative^1,8.

Il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) consente una caratterizzazione imparziale dell'espressione genica specifica del tipo di cellula, che a sua volta guida gli scienziati a studiare le funzioni geniche nelle reti cellulari dense⁷. L'RNA-seq era stato fatto per lo più su campioni sfusi, portando alla scoperta di una firma del gene microgliale omeostatica che li distingue da altre cellule neurali e immunitarie⁹. Tuttavia, un tale approccio potrebbe trascurare le differenze molecolari e funzionali tra le microglia, in particolare quelle temporanee presenti in fase di sviluppo o associate all'invecchiamento e alla malattia. Infatti, RNA-seq unicellulare (scRNA-seq) offre la sensibilità e la risoluzione che hanno rivoluzionato il campo rivelando l'eterogeneità della microglia precedentemente sottovalutata in una varietà di contesti^2,3,10. Inoltre, a causa della presenza di altre cellule immunitarie simili all'interfaccia di circolazione del CNS, scRNA-seq fornisce informazioni che aiutano la progettazione di nuovi strumenti per separare e sezionare funzionalmente queste cellule correlate con poca conoscenza precedente^2,11.

È stata inventata una vasta gamma di piattaforme scRNA-seq, ognuna adatta per determinate applicazioni¹². In generale, i metodi basati sulle goccioline, come 10x Genomica, sono più elevati in termini di produttività con (decine di) migliaia di cellule sequenziate in ogni esecuzione e sono meno selettivi per l'input che può contenere popolazioni di cellule miste che richiedono un'ampia categorizzazione. I metodi a base di piastre forniscono una maggiore sensibilità e profondità di lettura^13,14, di solito mirando a popolazioni specifiche dallo smistamento delle cellule per rivelare sottili differenze o trascrizioni rare. Data la piccola percentuale di cellule microgliali, in particolare quelle sottopopolazioni associate allo sviluppo o alla malattia, tra tutti i tipi di cellule SNC, è spesso auspicabile isolare la microglia da una specifica regione di interesse e ottenere informazioni trascrittomiche profonde e complete per comprenderne l'eterogeneità.

Qui, forniamo dettagli su come isolare microglia da diverse regioni del cervello del topo sezionate da un singolo emisfero, che vengono utilizzate per l'RNA-seq a singola cellula (o alla rinfusa) seguendo una procedura di preparazione della libreria semi-automatica basata su lamiere. L'altro emisfero può quindi essere utilizzato per la convalida istologica. Semplificato da un metodo^{precedentemente}pubblicato 9 , questo protocollo di isolamento mira a massimizzare la resa da piccole quantità di materiali di partenza, e nel frattempo mantenere profili di espressione genica microgliale endogeni. Utilizziamo lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per arricchire la microglia (o altre cellule immunitarie correlate di interesse) in piastre di 96 pozze e diimentare i volumi di reagenti per la preparazione della biblioteca al fine di aumentare la produttività. Mettiamo in evidenza questa piattaforma scRNA-seq sensibile, anche se possono essere applicate altre strategie basate su piastre. Questo metodo può essere facilmente adattato per isolare microglia da altri tessuti sezionati, come lesioni o foci di malattia, e l'età del topo può variare in quasi tutti gli stadi postnatali. L'isolamento efficiente della microglia regionale per gli studi sulla trascrittomica a una cellula faciliterà una migliore comprensione delle loro funzioni in materia di salute e malattia.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono roditori sono conformi alle linee guida della Stanford University, che rispettano le leggi e le politiche nazionali e statali. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal gruppo amministrativo della Stanford University sulla cura degli animali da laboratorio.

NOT: Tutte le composizioni di soluzioni e buffer sono disponibili nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione il giorno dell'isolamento cellulare

1. Preparare i seguenti reagenti e raffreddarli sul ghiaccio: medio A (50 mL), buffer di smistamento cellulare ad attivazione magnetica (30 mL), buffer FACS (25 mL), salina con buffer fosfato (PBS; 30 mL), DNase (320 zL) e inibitore di RNase (30 l).
   NOT: I volumi qui forniti sono sufficienti per isolare microglia da 4 regioni cerebrali (ad esempio, corteccia, cervelletto, ippocampo e striato) di un singolo emisfero cerebrale del topo. Scalabilità verticale se vengono utilizzati più tessuti.
2. Mettete quattro omogeneizzatori puliti da 2 mL sul ghiaccio e aggiungete 2 mL di mezzo A con 80 gradi di DNase (12.500 unità/mL) e 5 luna di inibitore di RNase in ogni omogeneizzatore Dounce. Raffreddare i pistoni in tubi da 15 mL.
3. Etichettare quattro piatti Petri da 6 cm con regioni cerebrali per la raccolta dei tessuti e aggiungere 200 l di mezzo freddo A in ogni piatto sul ghiaccio. Aggiungere circa 5 mL di mezzo A in un piatto Petri di 6 cm per la dissezione.
   NOT: Prima dell'uso, assicurarsi che tutti i reagenti siano sterili e adatti per applicazioni di RNA. Gli utensili da banco e dissezione devono essere puliti e spruzzati con la soluzione di decontaminazione RNase (Tabella dei materiali).

2. Dissezione della Regione del Cervello

NOT: Questo passaggio dovrebbe richiedere 30 min.

1. Iniettare nel peritoneo di un topo da giovane a stamiche da giovane a xilometro (>1 mese di vita).
   NOT: Un topo maschio è usato qui per illustrazione, ma entrambi i sessi sono adatti.
2. Attendere 5 min e pizzicare una zampa posteriore per garantire la mancanza di retrazione.
3. Utilizzare immediatamente un ago da 26 G x 3/8 per eseguire la perfusione transcardiale con 20-30 mL di PBS ghiacciato fino a quando il buffer non si esaurisce senza sangue visibile.
4. Decapitare il topo con un paio di forbici chirurgiche. Utilizzare piccole forbici per tagliare aprire la pelle per esporre il cranio sottostante, e poi tagliare attraverso la sutura sagittale, sutura lambdoidal e sutura coronale. Utilizzare pinze per tirare fuori entrambi i lati dell'osso parietale e dell'osso interparietale senza danneggiare il tessuto, e spostare con attenzione il cervello nella dissezione piatto Petri con mezzo A.
5. Utilizzare una lama pre-raffreddata per tagliare il cervello attraverso la linea mediana in due emisferi.
   NOT: Le quattro regioni cerebrali qui descritte da un singolo emisfero producono un numero sufficiente di microglia per applicazioni RNA-seq singole o sfuse. L'altro emisfero può essere utilizzato per l'immunostochimica o l'RNA nella convalida in situ.
6. Separare il cervelletto dal lobo corticale e dal tronco encefalico con #55 pinze e trasferire il tessuto in un piatto Petri di raccolta.
7. Utilizzare #55 pinze per sezionare con attenzione l'ippocampo e lo striato dalla corteccia e trasferire ogni tessuto in un piatto Petri di raccolta.

3. Dissociazione dei tessuti meccanici

NOT: Mantenere le cellule e reagenti fresco tutto il tempo tranne durante le fasi di colorazione. Questo passaggio dovrebbe richiedere 30 min.

1. Tritare ogni tessuto cerebrale con una lama di rasoio in pezzi <1 mm³ fini.
2. Utilizzare 1 mL pipette (con punte tagliate) per trasferire i pezzi di tessuto negli omogeneizzatori Dounce pre-raffreddati, ciascuno contenente 2 mL di media A con inibitore DNase e RNase.
3. Omogeneizzare il tessuto ruotando lentamente il pistone dentro e fuori l'omogeneizzatore dounce per 6-10 colpi completi, fino a quando non sono presenti pezzi visibili.
   NOT: Douncing uccide i neuroni e la maggior parte delle altre cellule gliali, ma lasciare le cellule microgliali piuttosto intatte. Sia l'insufficiente che l'esagerazione possono portare a un basso rendimento delle cellule.
4. Trasferire i tessuti dissociati in tubi da 50 mL attraverso ceppi di 70 m.
5. Sciacquare ogni omogeneizzatore e pistone Dounce con un totale di 6 mL di mezzo freddo A e filtrare la soluzione di risciacquo attraverso lo stesso colino nel tubo corrispondente.
6. Trasferire le sospensioni a singola cella (circa 8 mL ciascuna) in tubi conici da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi con freno 5.

4. Rimozione della mielina

NOT: Questo passaggio dovrebbe richiedere 60 min.

1. Preparare 1 colonna di esaurimento di grandi dimensioni (LD) (per la corteccia) e 3 colonne di selezione ampia (LS) (per le altre 3 regioni) in un separatore magnetico (Tabella dei materiali). Risciacquare ogni colonna con 3 mL di buffer MCS.
2. Una volta terminata la centrifuga, pipetta fuori e scartare il supernatale senza disturbare il pellet. Per i tessuti della corteccia e del cervelletto, risospendere le cellule in buffer MCS da 850 litri con 1,8 gradi di inibitore di RNase. Per i tessuti ippocampo e striato, risospendere le cellule in 400 - L di buffer MCS con 0,9 .
   NOT: Le colonne (LD vs LS) e il volume utilizzato per la sospensione sono ottimizzati in base alla quantità di mielina presente nel tessuto. Se altre regioni del cervello sono sapientemente, queste condizioni potrebbero essere necessario regolare a seconda delle dimensioni del tessuto e quanto mielina può esistere. L'efficacia della rimozione della mielina può essere stimata al passo 4.9.
3. Aggiungete 100 l di perline di rimozione della mielina ciascuna nelle cellule della corteccia e del cervelletto e aggiungete 50 -L di rimozione della mielina ciascuna nelle cellule dell'ippocampo e dello striato.
4. Mescolare delicatamente le cellule con perline e incubare i tubi sul ghiaccio per 10 min.
5. Portare il volume del tubo con cellule corticali a 2 mL con buffer MCS, e tutti gli altri a 1 mL (cioè, aggiungere 1 mL per le cellule corticali; 500 L per le cellule ippocampali e striacali; non c'è bisogno di aggiungere buffer alle cellule cerebellari).
6. Una volta che le colonne sono vuote di tampone di risciacquo, posizionare un tubo da 15 mL sotto ogni colonna. Caricare le celle corticali (2 mL) nella colonna LD e tutte le altre (1 mL ciascuna) sulle colonne LS. Utilizzare immediatamente 1 mL di buffer MCS ciascuno per lavare i tubi originali e caricare la soluzione sulle colonne corrispondenti.
7. Lavare la colonna LD una volta con 1 mL di buffer MCS e lavare ogni colonna LS due volte con 1 mL di tampone MCS ogni lavaggio. Continuare a raccogliere la soluzione di flusso attraverso durante il lavaggio.
8. Filtrare le cellule in tubi FACS rotondi attraverso i tappi del colino da 35 m.
   NOT: Ogni tubo dovrebbe raccogliere circa 4 mL di sospensione a cella singola impoverito di mielina.
9. Facoltativamente, prendere 10 l della sospensione cellulare e mescolare con 10 .L di 0,4% soluzione di trypan blu. Esaminare le cellule al microscopio a campo luminoso 10 volte per stimare la resa, il tasso di sopravvivenza e il livello di mielina residua.
   NOT: Una preparazione di successo dovrebbe generare oltre il 90% di cellule vive (di forma rotonda ed escludendo il colorante blu) con poco o nessun detriti di mielina.
10. Celle di pellet nei tubi FACS a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, con freno 5. Versare lentamente supernatali e tamponare il bordo del tubo su carta velina. Risospendere le cellule in ogni tubo con 300 l di tampone FACS.
    NOT: Se lo smistamento MCS è preferito, perline CD11b possono essere utilizzate per selezionare microglia e altre cellule mieloidi dopo la rimozione della mielina. Queste cellule possono quindi essere utilizzate per lo scRNA-seq non a base di piastra e per l'RNA-seq sfuso. L'avvertenza di questo approccio alternativo è che le perline CD11b non separano microglia da altre cellule immunitarie correlate che sono anche positive per questo antigene.

5. Colorazione per lo smistamento delle celle attivato dalla fluorescenza

NOT: Questo passaggio dovrebbe richiedere 40 min.

1. Aggiungere 5 -L di topo Fc recettori blocco reagente (Tabella dei materiali) in ogni tubo. Incubare per 5 min sul ghiaccio.
2. Aggiungete 1 - L di CD45-PE-Cy7 e 1 - L di CD11b-BV421 in ogni tubo.
   NOT: Possono essere utilizzati anticorpi con altri fluorofori coniugati. È inoltre possibile includere anticorpi contro TMEM119, un marcatore specifico per la microglia omeostatica^9,ma si consiglia di essere utilizzati insieme a CD45 e CD11b, perché alcune sottopopolazioni di microglia possono perdere l'espressione superficiale di TMEM119.
3. Incubare i tubi su uno shaker per 10 min a temperatura ambiente (RT).
4. Aggiungere 2 mL di tampone FACS per lavare.
5. Cellule di Pellet a 4 gradi centigradi, 400 x g per 5 min. versare lentamente supernatali e tamponare il bordo del tubo su carta velina. Risospendere le cellule in ogni tubo utilizzando 400 l di TAC tampone con 1 L di inibitore di RNase e 0,5 L di propidio iodide (PI, 1:1,000 diluizione).

6. Ordinamento FACS indice

NOT: Questo passaggio dovrebbe richiedere 1 h.

1. Seguendo la procedura FACS standard, disegnare cancelli in base a dispersione (esclusi detriti), singole cellule, cellule vive (PI negativo), microglia e cellule mieloidi (CD45^,CD11b).
   NOT: Le cellule microgliali tipiche esprimono CD45 a livelli inferiori rispetto ad altri macrofagi associati ai confini, come i macrofagi perivascolari e meningei, e quindi gating su CD45 basso CD11b^- dovrebbe essere sufficiente se il focus della ricerca sono profili di espressione genica in queste microglia classiche^1,2. Tuttavia, alcuni sottoinsiemi di microglia possono avere una maggiore espressione cd45 e questo è particolarmente vero durante lo sviluppo o in condizioni di malattia. Per garantire un'analisi imparziale dell'espressione genica microgliale, i immunofenotipi alti e CD45 sono registrati tramite l'ordinamento degli indici ed entrambe le popolazioni raccolte per il sequenziamento e l'analisi a valle. Inoltre, l'espressione superficiale di TMEM119 può essere utilizzata per indirizzare la popolazione microgliale omeostatica (cfr. passo 5.2) e analizzata insieme ai livelli di CD45 e ai risultati del sequenziamento.
2. Ordinare le microglie singole (con un ugello di 100 m) in piastre di reazione a catena di polimerasi 96-well (PCR), contenenti 4 l'lofilisi tamponare ogni pozzo (vedere il protocollo pubblicato¹⁴ per i dettagli).
   NOT: Il mix di RNA spike-in (Tabella dei materiali) del Consorzio esterno per il controllo dell'RNA (ERCC) può essere aggiunto a 1:2,4 x 10⁷ nel buffer di lisi per il controllo della qualità e la normalizzazione².
3. Vorticare brevemente le piastre e girare verso il basso utilizzando una centrifuga panca-top.
4. Congelare immediatamente i campioni sul ghiaccio secco. Conservare le piastre a -80 gradi centigradi fino alla preparazione della biblioteca.
   NOT: In alternativa, più cellule possono essere raccolte in tubi da 1,5 mL con buffer di estrazione dell'RNA per RNA-seq sfuso. Secondo l'esperienza degli autori, 3.000 cellule sono sufficienti per generare librerie di buona qualità seguendo il protocollo pubblicato^2,14.

7. Preparazione della libreria di sequenziamento di RNA a cella singola

NOT: Qui, il protocollo pubblicato¹⁴ è seguito per generare librerie scRNA-seq con l'aiuto della robotica di movimentazione dei liquidi e alcune modifiche. In questo articolo, la procedura viene descritta solo brevemente e le differenze vengono evidenziate. La lavorazione simultanea di 4 piastre richiede circa 2,5 giorni.

1. Scongelare le piastre sul ghiaccio ed eseguire la trascrizione inversa con il primer Oligo-dT30VN (nel buffer di lisi) per generare cDNA con riciclati termici (Tabella 1): 42 C 90 min; 70 s 5 min; attesa a 4 gradi centigradi. Quindi amplificare cDNA con un ulteriore passo di digestione di eonucleale all'inizio (Tabella 2) utilizzando il mix master PCR e primer in situ PCR (ISPCR) ( Tabelladei materiali) e la seguente condizione pcR: 37 . 95 C 3 min; 23 cicli di 98 s C 20 s, 67 c 15 s, 72 c 4 min; 72 c 5 min.
2. Purificare il cDNA utilizzando 18 l'l di perline magnetiche per pozzo (rapporto 0,7:1). Incubare la piastra su un supporto magnetico per 5 min e lavare i campioni due volte con l'80% di etanolo appena fatto, 80 l per ogni volta. Dopo aver asciugato la piastra per 15-20 min, elute cDNA con 20 l di tampone di eluizione per pozzo.
   NOT: Per il controllo della qualità, utilizzare un analizzatore di frammenti (analisi dei frammenti di nuova generazione ad alta sensibilità , 1,6.000 bp) per controllare le distribuzioni delle dimensioni e le concentrazioni di cDNA, e solo ulteriori campioni di processo con uno striscio compreso tra 500,5.000 bp e superiore a 0,05 ng/L.
3. Per generare librerie, mescolare 0,4 l di ogni campione di cDNA con 1,2 di reagenti di tagmenttazione Tn5 dal kit di preparazione della libreria (Tabella dei materiali) in una piastra di 384 pozzetti con l'aiuto di una macchina di tubi nanoliteri, a 55 c 10 min.
   NOT: In questo caso, viene aggiunto 1/12,5 del volume di reazione suggerito (5 campione L e 15 l di reagenti di tagmentation) al fine di ridurre i costi e nel frattempo aumentare la produttività. Una macchina di pipettatura nanolitera (Tabella dei materiali) viene utilizzata per trasferire reagenti (questo e seguendo passaggi) da e a 384 pozze.
4. Aggiungete 0,4 l di buffer di neutralizzazione per fermare la reazione di tagment a RT per 5 min.
5. Aggiungere 384 indici (Tabella dei materiali, 0,4 L in avanti e 0,4 ll di miscela PCR su campioni (2 ll ciascuno) e amplificare le librerie utilizzando la seguente condizione: 72 C 3 min; 95 s 30 s; 10 cicli di 95 gradi centigradi, 55 gradi centigradi 30 s, 72 c 1 min; 72 c 5 min.
6. Raggruppare insieme tutte le singole librerie (prendere 1 X) dalla stessa piastra 384-po' e utilizzare perline magnetiche (Rapporto Tabella dei materiali, 0,7:1) per purificare le librerie raggruppate finali.
7. Utilizzare un fluorometro (Tabella dei materiali) per misurare le concentrazioni e un bioanalisi ( Tabella deimateriali) per esaminare le distribuzioni delle dimensioni delle librerie raggruppate prima del sequenziamento. Puntare la profondità di sequenziamento a 1 milione di letture non elaborate per cella.
8. Seguire le procedure bioinformatiche standard per filtrare e tagliare le letture di sequenziamento ed eseguire l'allineamento². Utilizzare la tabella di conteggio e i metadati come input per eseguire l'analisi del clustering con il pacchetto Seurat¹⁵.

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Risultati

Questo protocollo descrive un metodo per isolare e ordinare microglia da diverse regioni del cervello in un emisfero cerebrale perfuso adulto, seguito da scRNA-seq. Usiamo il douncing per creare sospensioni a singola cellula e anche come primo passo per arricchire la microglia. Insufficiente o sovradosso riduce la resa. Inoltre, cervelli di topi adulti contengono alti livelli di mielina, che può anche ridurre l'efficienza di selezione e la resa se non rimosso correttamente. Pertanto, esaminiamo la sospensione cellulare ...

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Discussione

Microglia interagiscono attivamente con altri tipi di cellule nel SNC, e sono molto sensibili agli stimoli ambientali. Al fine di ridurre al minimo le risposte infiammatorie e i cambiamenti aberranti nella loro espressione genica durante il processo di isolamento, questo protocollo è stato semplificato da un metodo^{precedentemente}pubblicato 9 ed è ora adatto per isolare la microglia da più regioni di un singolo emisfero cerebrale del topo in parallelo. I tessuti e i reagenti sono tenuti a temper...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 M Betaine	Sigma-Aldrich	Cat# B0300-5VL
10 mM dNTP mix	Thermo Fisher Scientific	Cat# R0192
0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15575020
10X Hanks’ Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	Cat# 14185-052
1 M HEPES	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix	Kapa Biosciences	Cat# KK2602
5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap	Corning	Cat# 352235
AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp)	Advanced Analytical	Cat# DNF-474-1000
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A8806
DNase I	Worthington	Cat# LS002007	Working solution: 12500 units/ml
DTT, Molecular Grade	Promega	Cat# P1171
ERCC RNA Spike-In Mix	Thermo Fisher Scientific	Cat# 4456740
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10437-028
Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2001
Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2002
Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2003
Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2004
Lambda Exonuclease (5 U/μl)	New England BioLabs	Cat# M0262S
Mouse Fc block	BD Pharmingen	Cat# 553142
Myelin removal beads	Miltenyl Biotec	Cat# 130-096-433
Nextera XT DNA Sample Prep Kit	Illumina	Cat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)	Illumina	Cat# 20024907
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	Cat# 70011044
PCRClean DX beads	Aline Biosciences	Cat# C-1003-50
Propidium Iodide	Thermo Fisher Scientific	Cat# P3566	Staining: 1:1000
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermal Fisher Scientific	Cat# Q32851
Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101236; RRID: AB_11203704	Staining: 1:300
Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)	Thermo Fisher Scientific	Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625	Staining: 1:300
Recombinant RNase Inhibitor	Takara Bio	Cat# 2313B
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)	Clontech	Cat# 639538	Containing 5x First strand buffer
Oligonucleotides
0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3'			(Picelli et al., 2014)
Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3'			(Picelli et al., 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base)			(Picelli et al., 2014)
Solutions
FACS buffer			Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS
MCS buffer			Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS
Medium A			Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red
Plates
384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific	VWR	89005-556
Hard-shell 96-well PCR plates	Bio-Rad	HSP9631
Others
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dounce homogenizer, 2 ml	Wheaton	357422
Large depletion column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Large selection column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RNAzap	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Strainer (70 μm)	Falcon	352350
Equipment
BD FACSAria II	BD Biosciences	http://www.bdbiosciences.com/
Bioanalyzer	Agilent	2100
Fragment Analyzer	Agilent	5300
Mosquito HTS nanoliter pipetting robot	TTP Labtech	https://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33226