从一个成年小鼠脑半球分离区域特异性微胶质，进行深度单细胞RNA测序

摘要

我们为从成年小鼠大脑半球的不同解剖区域分离微胶质提供方案，然后为全长转录体进行深度单细胞RNA测序的半自动库制备。该方法将有助于阐明微胶质在健康和疾病中的功能异质性。

摘要

作为中枢神经系统中的常住巨噬细胞，微胶质能积极控制大脑发育和平衡，其功能障碍可能导致人类疾病。在发现静温微胶质的分子特征以及其基因表达的变化以响应环境刺激方面取得了相当大的进展。随着单细胞基因组方法的出现和成熟，人们越来越认识到，异质微胶质可能是它们在不同发育和病理条件下所发挥的不同作用的基础。通过有效分离微胶质与特定感兴趣区域，然后对单个细胞进行敏感分析，可以进一步剖析这种异质性。在这里，我们提供了一个详细的协议，从单个成年小鼠大脑半球的不同大脑区域快速分离微胶质。我们还演示了如何使用这些排序的微胶用于基于板的深层单细胞RNA测序。我们讨论了此方法对其他场景的适应性，并为改进系统以适应大规模研究提供了指南。

引言

微胶质，占所有神经细胞的5%-10%，是分散在中枢神经系统（CNS）1的常驻巨噬细胞。在血脑屏障的背后，健康成人大脑中典型的微胶质包含许多精细过程，这些过程会迅速延伸和缩回，与脑血管瘤中的神经元和其他胶质细胞相互作用。微胶质也可以采用与在特定发育阶段或损伤和^{疾病1、2、3、4}中的免疫挑战相关的与增加的咽喉功能相关的阿米巴细胞形态。最近令人振奋的发现清楚地表明，微胶质绝不是大脑衍生或病理信号的被动旁观者，但在控制大脑发育和平衡方面起着关键作用，例如，通过支持神经元生存、修剪未成熟的突触、促进寡核苷酸系细胞分化以及血管^生成1。随着微胶质的更多功能被阐明，兴奋进一步由人类遗传学研究，这表明，许多神经退行性疾病风险基因，如TREM2，主要或完全表达微胶质5，6，7。鉴于它们在发育中的重要性和合理的疾病驱动作用，我们最近为理解微胶质基因调控和功能而付出巨大努力，以期找到神经退行性^疾病1、8的新治疗靶点。

RNA测序（RNA-seq）允许对细胞类型特异性基因表达进行无偏的表征，这反过来又指导科学家研究致密细胞网络中的基因^功能7。RNA-seq主要在大体积样品上进行，导致发现一种静温微胶质基因特征，使其与其他神经和免疫^细胞9区分开来。然而，这种方法可以忽视微胶质之间的分子和功能差异，特别是那些暂时存在于发育中，或与衰老和疾病相关的差异。事实上，单细胞RNA-seq（scRNA-seq）提供了敏感性和分辨率，通过揭示以前未被认识的微胶质异质性，在各种^{上下文中2，3，10，}彻底改变了该领域。此外，由于在CNS循环界面中存在其他类似的免疫细胞，scRNA-seq提供了信息，有助于设计新的工具，以分离和功能解剖这些相关细胞，而事先^{知之甚少2，11。}

已经发明了一系列不同的scRNA-seq平台，每个平台都适合某些^应用12。通常，基于滴滴的方法（如 10x 基因组学）的吞吐量较高，每次运行中测序的 （数千个）细胞，并且对于可能包含需要广泛分类的混合细胞群的输入的选择性较低。基于板的方法提供更高的灵敏度和读取^{深度13，14，}通常针对特定人群从细胞排序，以揭示细微的差异或罕见的成绩单。鉴于在所有CNS细胞类型中微胶质细胞，特别是发育或疾病相关亚群的较小比例，通常可取地将微胶质从特定感兴趣的区域分离，并获取深度和全长转录组信息，以了解其异质性。

在这里，我们详细介绍了如何从从单个半球解剖的不同小鼠大脑区域分离微胶质，这些区域在半自动基于板的库制备程序后用于单细胞（或散装）RNA-seq。另一半球则可用于组织学验证。这种分离方案从先前公布的^方法9中简化，旨在最大化少量起始材料的产量，同时维持内源性微胶质基因表达谱。我们使用荧光活性细胞分拣（FACS）将微胶质（或其他相关的相关免疫细胞）浓缩到96孔板中，并将试剂体积小型化，用于库制备，以提高产量。我们重点介绍这个敏感的scRNA-seq平台，尽管可以应用其他基于板的策略。这种方法可以很容易地适应，以分离微胶质从其他解剖组织，如损伤或疾病病灶，和小鼠的年龄可以改变几乎任何产后阶段。单细胞转录组学研究对区域微胶质的有效分离将有助于更好地了解其在健康和疾病中的功能。

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研究方案

涉及啮齿动物的所有程序都符合斯坦福大学的指导方针，该准则符合国家和州法律和政策。所有动物程序都通过了斯坦福大学实验室动物护理行政小组的批准。

注:所有溶液和缓冲组合物均在材料表中提供。

1. 细胞隔离日的准备工作

1. 准备以下试剂并将其冷却在冰上:中等A（50 mL）、磁活细胞分拣（MCS）缓冲液（30 mL）、FACS缓冲液（25 mL）、磷酸盐缓冲盐水（PBS;30 mL）、DNase（320 μL）和RNase抑制剂（30 μL）。
   注:这里提供的体积足以从单个小鼠大脑半球的4个大脑区域（如皮层、小脑、海马和纹状体）中分离微胶质。如果使用更多组织，则向上扩展。
2. 将4个干净的2 mL光合质器放在冰上，并在每个脱粒均质器中加入2 mL的A介质，其中80μL的DNase（12，500单位/mL）和5μL的RNase抑制剂。在 15 mL 管中冷却活塞。
3. 标记四个6厘米培养皿与大脑区域组织收集，并添加200μL的冷介质A到每盘冰上。将约 5 mL 的介质 A 添加到 6 厘米培养皿中进行解剖。
   注:使用前，确保所有试剂无菌且适合RNA应用。台面和解剖工具需要清洁，并喷洒RNase去污溶液（材料表）。

2. 脑区解剖

注:此步骤应需要约 30 分钟。

1. 将400~500 μL的氯胺酮/木氨酸（24毫克/mL氯胺酮和2.4毫克/mL木兰西他辛）注射到幼年鼠的围护中（>1个月大）。
   注:此处使用雄性鼠标进行插图，但任一性别都适合。
2. 等待 5 分钟，捏一个后爪，以确保没有回缩。
3. 立即使用 26 G x 3/8 针使用 20~30 mL 的冷型 PBS 进行转盘灌注，直到缓冲液用完，没有可见血液。
4. 用一把手术剪刀把老鼠斩首。用小剪刀切开皮肤，露出头骨下面，然后切开下垂缝合线、羔羊皮缝合线和冠状缝合线。使用钳子拉出骨骼和间断骨的两侧，而不会损坏组织，并小心地将大脑移入具有中等 A 的解剖培养皿中。
5. 使用预冷却刀片将大脑穿过中线切成两个半球。
   注:这里描述的四个大脑区域从一个单一半产生足够的微胶质为单细胞或散装RNA-seq应用。另一半球可用于免疫性化学或RNA原位验证。
6. 用#55钳将小脑从皮质叶和脑干中分离出来，并将组织转移到集合培养皿中。
7. 使用#55钳子仔细解剖出海马和纹状体从皮层，并转移每个组织到一个集合培养皿。

3. 机械组织分离

注:除非在染色步骤中，否则会一直保持细胞和试剂冷却。此步骤应需要约 30 分钟。

1. 用剃刀刀片将每个脑组织切成 <1 mm³细片。
2. 使用 1 mL 移液器（切断吸头）将组织件转移到预冷却的 Dounce 均质器中，每个液位包含 2 mL 的 A 培养基，带有 DNase 和 RNase 抑制剂。
3. 通过缓慢地将活塞扭出"点"均质器进行 6–10 次完全冲程，直到不存在可见块，使组织变均匀。
   注:点胶会杀死神经元和大多数其他胶质细胞，但使微胶质细胞保持相当完整。不足和过度的解决都会导致细胞产量低。
4. 通过70μm滤网将分离组织转移到50mL管中。
5. 用总共 6 mL 的冷介质 A 冲洗每个大通式和活塞，并通过同一滤网将冲洗溶液过滤到相应的管中。
6. 将单细胞悬浮液（每个约8 mL）转移到15 mL锥形管中，在4°C下以400 x g离心5分钟，制动= 5。

4. 骨髓去除

注:此步骤需要约 60 分钟。

1. 在磁分离器（材料表）中准备 1 个大损耗 （LD） 列（用于皮层）和 3 个大选择 （LS） 列（对于其他 3 个区域）。用 3 mL 的 MCS 缓冲液冲洗每列。
2. 离心完成后，移液器流出并丢弃上清液，而不会干扰颗粒。对于皮层和小脑组织，用1.8μL的RN酶抑制剂在850μL的MCS缓冲液中重新悬浮细胞。对于海马和纹状体组织，用0.9μL的RNase抑制剂在400μL的MCS缓冲液中重新悬浮细胞。
   注:列（LD 与 LS）和用于重新悬浮的体积根据组织中存在的骨髓量进行了优化。如果其他大脑区域被测定，这些条件可能需要根据组织的大小和骨髓可能存在多少进行调整。在步骤4.9中可以估计骨髓去除的有效性。
3. 将100μL的骨髓去除珠分别加入皮层和小脑的细胞中，并加入50μL的骨髓去除珠子，每个珠子从海马和纹状体进入细胞。
4. 轻轻地将细胞与珠子混合，在冰上孵育管子10分钟。
5. 使用MCS缓冲液将带皮质细胞的管的体积达到2 mL，并将所有其他体积增加到1 mL（即，为皮质细胞添加1 mL;海马和纹状细胞增加500 μL;无需向小脑细胞添加缓冲液）。
6. 一旦柱没有浸液缓冲液，将每列下方放置一个 15 mL 的管。将皮质细胞 （2 mL） 加载到 LD 列上，将所有其他（每个 1 mL）加载到 LS 列上。立即使用 1 mL 的 MCS 缓冲液，每个缓冲液清洗原始管，并将溶液加载到相应的柱上。
7. 用 1 mL 的 MCS 缓冲液清洗 LD 列一次，每次洗涤时用 1 mL 的 MCS 缓冲液洗涤每个 LS 列两次。在洗涤过程中继续收集流过溶液。
8. 通过 35 μm 滤网盖将细胞过滤到圆形底部 FACS 管中。
   注:每个管应收集约4 mL的单细胞悬浮液耗尽的骨髓。
9. 可选择服用10μL的细胞悬浮液，并将其与10μL的0.4%锥蓝色溶液混合。在10倍的明亮场显微镜下检查细胞，以估计产量、存活率和残留骨髓水平。
   注:成功的制备应产生超过90%的活细胞（圆形，不包括蓝色染料），很少或没有骨髓碎片。
10. 在 4°C 下，在 400 x g的 FACS 管中，在 4°C 下 5 分钟，制动 = 5。慢慢倒出上清液，在纸巾上涂抹管的边缘。用300μL的FACS缓冲液在每个管中重新悬浮细胞。
    注:如果最好进行 MCS 分拣，CD11b 珠子可用于在去除骨髓后选择微胶质和其他骨髓细胞。然后，这些细胞可用于非基于板的scRNA-seq以及散装RNA-seq。这种替代方法的警告是，CD11b珠子不会将微胶质与其他相关的免疫细胞分离，而这些免疫细胞也对这种抗原呈阳性。

5. 荧光激活细胞分拣的染色

注:此步骤需要约 40 分钟。

1. 在每个管中加入5μL的小鼠Fc受体块试剂（材料表）。在冰上孵育5分钟。
2. 将 1 μL CD45-PE-Cy7 和 1 μL CD11b-BV421 添加到每个管中。
   注:可与其他结合的荧光光道使用抗体。针对TMEM119的抗体，一种用于静温微胶^质9的特定标记物，也可以包括在内，但建议与CD45和CD11b一起使用，因为某些微胶亚亚体群可能会失去TMEM119表面表达。
3. 在室温 （RT） 下在摇床上孵育管子 10 分钟。
4. 添加 2 mL 的 FACS 缓冲液进行洗涤。
5. 4°C的颗粒细胞，400 x g，5分钟。缓慢倒出上清液，在纸巾上涂抹管的边缘。使用 400 μL 的 FACS 缓冲液，使用 1 μL 的 RNase 抑制剂和 0.5 μL 的碘化钠（PI，1:1，000 稀释）在每个管中重新悬浮细胞。

6. 索引 FACS 排序

注:此步骤应需要 ±1 小时。

1. 遵循标准FACS程序，根据散射（不包括碎片）、单细胞、活细胞（PI负数）、微胶质和骨髓细胞（CD45+，CD11b+）绘制闸门。
   注:典型的微胶质细胞表达CD45在较低的水平相比，与其他边界相关的巨噬细胞，如血管和脑咽，因此门在CD45低CD11b^-应该足够，如果研究的重点是基因表达配置文件在这些经典的微胶^质1，2。然而，微胶质的某些子集可能具有更高的CD45表达，这在发育或疾病条件下尤其如此。为了确保对微胶质基因表达的无偏见分析，CD45高免疫表型和CD45低免疫表型可以通过指数分集设置和采集的两个人群进行测序和下游分析。此外，TMEM119表面表达可用于靶向静动微胶质总体（参见步骤5.2），并与CD45水平和测序结果一起进行分析。
2. 将单个微胶质（带 100 μm 喷嘴）分类到 96 孔聚合酶链反应 （PCR） 板中，每个孔包含 4 μL 的莱沙缓冲液（详情见已发布的协议^14）。
   注:外部RNA控制联盟（ERCC）RNA尖刺混合（材料表）可以在1:2.4 x 10⁷的莱沙缓冲液中加入，用于质量控制和正常化^目的2。
3. 使用台式离心机短暂涡旋板并旋转。
4. 立即将样品冷冻在干冰上。将盘子储存在-80°C，直到库准备。
   注:或者，更多的细胞可以收集到1.5 mL管中，用RNA提取缓冲液进行散装RNA-seq。根据作者的经验，3000个细胞足以在已发布的^协议2，14之后生成高质量的库。

7. 单细胞RNA测序库制备

注:在这里，遵循已发布的^协议14，在液体处理机器人和一些修改的帮助下生成scRNA-seq库。在本文中，仅简要描述了该过程，并突出显示了差异。同时处理4个盘子大约需要2.5天。

1. 在冰上解冻板，用Oligo-dT30VN底漆（在发散缓冲液中）进行逆转录，用热循环器生成cDNA（表1:42°C 90分钟）;70 °C 5 分钟;4 °C 保持。然后用PCR主混合物和原位PCR（ISPCR）引物（材料表）和以下PCR条件（37°C 30分钟）在开始时用额外的外糖酶消化步骤扩增cDNA（表2）;95 °C 3 分钟;23 周期 98 °C 20 s、67 °C 15 s、72 °C 4 分钟;72 °C 5 分钟
2. 每井使用 18 μL 的磁珠（0.7:1 比率）纯化 cDNA。在磁性支架上孵育板 5 分钟，每次用新鲜制作的 80% 乙醇、每口 80 μL 清洗样品两次。干燥板 15-20 分钟后，每孔洗脱缓冲液为 20 μL 的洗脱 cDNA。
   注:对于质量控制，使用片段分析仪（高灵敏度的下一代测序 [NGS] 片段分析，1⁄6，000 bp）来检查 cDNA 的大小分布和浓度，并且仅进一步处理涂片在 500~5，000 bp 之间且高于 0.05 纳克/μL 的样品。
3. 要生成文库，在 55°C 10 分钟时，将每个 cDNA 样品的 0.4 μL 与来自库制备试剂盒（材料表）的 1.2 μL Tn5 标记试剂混合在 384 孔板中。
   注:在这里，添加建议的反应体积的1/12.5（5μL样品和15μL的标记试剂），以降低成本，同时增加产量。纳米升移液机（材料表）用于将试剂（本和以下步骤）从384孔板转移到384孔板。
4. 加入0.4 μL的中和缓冲液，以停止RT的标记反应5分钟。
5. 添加 384 个索引（材料表，0.4 μL 正向和 0.4 μL 反向），1.2 μL PCR 混合物到样品中（每个 2 μL），并使用以下条件放大库:72 °C 3 分钟;95 °C 30 s;10个周期 95 °C 10 s，55 °C 30 s，72 °C 1 分钟;72 °C 5 分钟
6. 将同一 384 孔板中的所有单个库（每块 1 μL）集中起来，并使用磁珠（材料表，0.7:1 比率）来净化最终的池库。
7. 使用荧光计（材料表）测量浓度，使用生物分析仪（材料表）在测序前检查集合库的大小分布。将测序深度定位于每个单元 100 万次原始读取。
8. 遵循标准生物信息学程序来过滤和修剪测序读取和执行对齐²。使用计数表和元数据作为输入，使用 Seurat 包¹⁵进行聚类分析。

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结果

该协议描述了一种在一个成人注入脑半球中从不同大脑区域分离和排序微胶质的方法，然后是scRNA-seq。我们使用点心来创建单个细胞悬浮液，并作为丰富微胶质的第一步。不足或过度采用会降低产量。此外，成年小鼠大脑含有高水平的骨髓，如果去除不当，也会降低分拣效率和产量。因此，在进行抗体染色之前，我们使用锥蓝色锥形和血细胞计来估计骨髓去除的产量、细胞活力和疗效（步骤4.9）?...

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讨论

微胶质积极与中枢神经系统中的其他细胞类型相互作用，并且对环境刺激非常敏感。为了尽量减少在分离过程中其基因表达的炎症反应和异常变化，该协议从先前公布的^方法9进行了简化，现在适合从单个小鼠大脑半球的多个区域并行分离微胶质。组织和试剂保存在低温下，实验及时进行（从解剖到分拣约3.5小时），根据有限的组织尺寸，处理次数更少，试剂较少。我们选择其他...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 M Betaine	Sigma-Aldrich	Cat# B0300-5VL
10 mM dNTP mix	Thermo Fisher Scientific	Cat# R0192
0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15575020
10X Hanks’ Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	Cat# 14185-052
1 M HEPES	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix	Kapa Biosciences	Cat# KK2602
5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap	Corning	Cat# 352235
AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp)	Advanced Analytical	Cat# DNF-474-1000
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A8806
DNase I	Worthington	Cat# LS002007	Working solution: 12500 units/ml
DTT, Molecular Grade	Promega	Cat# P1171
ERCC RNA Spike-In Mix	Thermo Fisher Scientific	Cat# 4456740
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10437-028
Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2001
Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2002
Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2003
Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2004
Lambda Exonuclease (5 U/μl)	New England BioLabs	Cat# M0262S
Mouse Fc block	BD Pharmingen	Cat# 553142
Myelin removal beads	Miltenyl Biotec	Cat# 130-096-433
Nextera XT DNA Sample Prep Kit	Illumina	Cat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)	Illumina	Cat# 20024907
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	Cat# 70011044
PCRClean DX beads	Aline Biosciences	Cat# C-1003-50
Propidium Iodide	Thermo Fisher Scientific	Cat# P3566	Staining: 1:1000
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermal Fisher Scientific	Cat# Q32851
Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101236; RRID: AB_11203704	Staining: 1:300
Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)	Thermo Fisher Scientific	Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625	Staining: 1:300
Recombinant RNase Inhibitor	Takara Bio	Cat# 2313B
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)	Clontech	Cat# 639538	Containing 5x First strand buffer
Oligonucleotides
0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3'			(Picelli et al., 2014)
Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3'			(Picelli et al., 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base)			(Picelli et al., 2014)
Solutions
FACS buffer			Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS
MCS buffer			Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS
Medium A			Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red
Plates
384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific	VWR	89005-556
Hard-shell 96-well PCR plates	Bio-Rad	HSP9631
Others
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dounce homogenizer, 2 ml	Wheaton	357422
Large depletion column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Large selection column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RNAzap	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Strainer (70 μm)	Falcon	352350
Equipment
BD FACSAria II	BD Biosciences	http://www.bdbiosciences.com/
Bioanalyzer	Agilent	2100
Fragment Analyzer	Agilent	5300
Mosquito HTS nanoliter pipetting robot	TTP Labtech	https://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33226