Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

Zusammenfassung

Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.

Zusammenfassung

Als ansässige Makrophagen im zentralen Nervensystem, Mikroglia aktiv Steuern gehirnentwicklung und Homöostase, und ihre Funktionsstörungen können menschliche Krankheiten antreiben. Erhebliche Fortschritte wurden gemacht, um die molekularen Signaturen von heimostatischen Mikroglia sowie Veränderungen ihrer Genexpression als Reaktion auf Umweltreize aufzudecken. Mit dem Aufkommen und der Reifung einzelliger genomischer Methoden wird zunehmend erkannt, dass heterogene Mikroglia den unterschiedlichen Rollen zugrunde liegen können, die sie in verschiedenen entwicklungs- und pathologischen Bedingungen spielen. Eine weitere Zerlegung einer solchen Heterogenität kann durch eine effiziente Isolierung von Mikroglia aus einer bestimmten Interessensregion erreicht werden, gefolgt von einer sensiblen Profilierung einzelner Zellen. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die schnelle Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen Hirnregionen in einer einzigen erwachsenen Maus-Gehirnhälfte. Wir zeigen auch, wie diese sortierten Mikroglia für die plattenbasierte tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung verwendet werden. Wir diskutieren die Anpassungsfähigkeit dieser Methode an andere Szenarien und stellen Richtlinien für die Verbesserung des Systems für groß angelegte Studien bereit.

Einleitung

Mikroglia, die 5 % der Nervenzellen ausmacht, sind über das zentralnervousische System (ZNS) verstreute^Makrophagen. Geschützt hinter Blut - Hirn-Schranke, typische Mikroglia in einem gesunden erwachsenen Gehirn enthalten viele feine Prozesse, die schnell erweitern und zurückziehen, um mit Neuronen und anderen Gliazellen im Parenchym interagieren. Microglia kann auch die amoemoide Morphologie annehmen, die mit einer erhöhten phagozytischen Funktion in bestimmten Entwicklungsstadien oder bei Immunherausforderungen bei Verletzungen und Krankheiten^1,2,3

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Protokoll

Alle Verfahren, an denen Nagetiere beteiligt sind, entsprachen den Richtlinien der Stanford University, die den nationalen und staatlichen Gesetzen und Richtlinien entsprechen. Alle Tierverfahren wurden vom Verwaltungsgremium für Labortierpflege der Stanford University genehmigt.

HINWEIS: Alle Lösungs- und Pufferzusammensetzungen sind in Tabelle der Materialienenthalten.

1. Vorbereitung am Tag der Zellisolierung

1. Bereiten Sie folgende Reagenzien vor und kühlen Sie sie auf Eis: Medium A (50 ml), magnetaktivierter Zellsortierungspuffer (30 ml), FACS-Puffer (25 ml), phospha....

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Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Mikroglia aus verschiedenen Hirnregionen in einer erwachsenen perfundierten Gehirnhälfte zu isolieren und zu sortieren, gefolgt von scRNA-seq. Wir verwenden Douncing, um einzellige Suspension zu erstellen und auch als ersten Schritt, um Mikroglia zu bereichern. Unzureichende oder überdouncing reduziert die Ausbeute. Darüber hinaus enthalten erwachsene Mausgehirne hohe Myelinspiegel, die auch die Sortiereffizienz reduzieren und nachgeben können, wenn sie nicht richtig entfe.......

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Diskussion

Mikroglia interagieren aktiv mit anderen Zelltypen im ZNS und sind sehr empfindlich auf Umweltreize reagieren. Um Entzündungsreaktionen und abnorme Veränderungen in ihrer Genexpression während des Isolationsprozesses zu minimieren, wurde dieses Protokoll von einer zuvor veröffentlichten Methode⁹gestrafft und ist nun geeignet, Mikroglia aus mehreren Regionen einer einzelnen Maushirnhälfte parallel zu isolieren. Die Gewebe und Reagenzien werden bei kalter Temperatur gehalten und Experimente wer.......

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 M Betaine	Sigma-Aldrich	Cat# B0300-5VL
10 mM dNTP mix	Thermo Fisher Scientific	Cat# R0192
0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15575020
10X Hanks’ Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	Cat# 14185-052
1 M HEPES	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix	Kapa Biosciences	Cat# KK2602
5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap	Corning	Cat# 352235
AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp)	Advanced Analytical	Cat# DNF-474-1000
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A8806
DNase I	Worthington	Cat# LS002007	Working solution: 12500 units/ml
DTT, Molecular Grade	Promega	Cat# P1171
ERCC RNA Spike-In Mix	Thermo Fisher Scientific	Cat# 4456740
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10437-028
Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2001
Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2002
Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2003
Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2004
Lambda Exonuclease (5 U/μl)	New England BioLabs	Cat# M0262S
Mouse Fc block	BD Pharmingen	Cat# 553142
Myelin removal beads	Miltenyl Biotec	Cat# 130-096-433
Nextera XT DNA Sample Prep Kit	Illumina	Cat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)	Illumina	Cat# 20024907
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	Cat# 70011044
PCRClean DX beads	Aline Biosciences	Cat# C-1003-50
Propidium Iodide	Thermo Fisher Scientific	Cat# P3566	Staining: 1:1000
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermal Fisher Scientific	Cat# Q32851
Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101236; RRID: AB_11203704	Staining: 1:300
Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)	Thermo Fisher Scientific	Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625	Staining: 1:300
Recombinant RNase Inhibitor	Takara Bio	Cat# 2313B
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)	Clontech	Cat# 639538	Containing 5x First strand buffer
Oligonucleotides
0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3'			(Picelli et al., 2014)
Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3'			(Picelli et al., 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base)			(Picelli et al., 2014)
Solutions
FACS buffer			Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS
MCS buffer			Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS
Medium A			Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red
Plates
384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific	VWR	89005-556
Hard-shell 96-well PCR plates	Bio-Rad	HSP9631
Others
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dounce homogenizer, 2 ml	Wheaton	357422
Large depletion column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Large selection column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RNAzap	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Strainer (70 μm)	Falcon	352350
Equipment
BD FACSAria II	BD Biosciences	http://www.bdbiosciences.com/
Bioanalyzer	Agilent	2100
Fragment Analyzer	Agilent	5300
Mosquito HTS nanoliter pipetting robot	TTP Labtech	https://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33226