Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Resumo

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Resumo

Como macrófagos residentes no sistema nervoso central, microglia controlar ativamente o desenvolvimento do cérebro e homeostase, e suas disfunções podem conduzir doenças humanas. Avanços consideráveis foram feitos para descobrir as assinaturas moleculares da microglia homeostática, bem como alterações de sua expressão gênica em resposta a estímulos ambientais. Com o advento e maturação de metodologias genômicas unicelulares, é cada vez mais reconhecido que a microglia heterogênea pode estar subjacente aos diversos papéis que desempenham em diferentes condições de desenvolvimento e patológicas. Uma dissecção mais adicional de tal heterogeneity pode ser conseguida com a isolação eficiente do microglia de uma região de interesse dada, seguida pelo perfil sensível de pilhas individuais. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para o rápido isolamento da microglia de diferentes regiões cerebrais em um único hemisfério cerebral adulto do rato. Também demonstramos como usar essas microglias classificadas para sequenciamento de RNA de células únicas profundas à base de placa. Discutimos a adaptabilidade deste método a outros cenários e fornecemos diretrizes para melhorar o sistema para acomodar estudos em larga escala.

Introdução

Microglia, representando 5%−10% de todas as células neurais, são macrófagos residentes espalhados por todo o sistema nervoso central (SNC)¹. Protegido atrás de barreira sangue-cérebro, microglia típica em um cérebro adulto saudável contêm muitos processos finos que se estendem rapidamente e se retraem para interagir com neurônios e outras células gliais na parenchyma. Microglia também pode adotar a morfologia ameboiídea associada ao aumento da função fagocítica durante estágios específicos de desenvolvimento ou sobre desafios imunológicos em lesão e doença^1,2,3,4. Recentes descobertas emocionantes demonstraram claramente que a microglia não são de forma passiva para sinais patológicos ou derivados do cérebro, mas desempenham papéis fundamentais no controle do desenvolvimento cerebral e homeostase, por exemplo, apoiando a sobrevivência neuronal, podar sinapses imaturas, promover a diferenciação de células de linhagem de oligodendrocyte, bem como angiogênese^1. À medida que mais funções da microglia são elucidadas, a excitação é ainda mais alimentada por estudos de genética humana, que mostraram que muitos genes de risco de doenças neurodegenerativas, como trem2, são predominantemente ou exclusivamente expressos pela microglia^5,6,7. Dada a sua importância no desenvolvimento e plausíveis papéis de condução de doenças, um enorme esforço foi recentemente colocado para a nossa compreensão da regulação do gene microglial e função na esperança de encontrar novos alvos terapêuticos para doenças neurodegenerativas^1,8.

O sequenciamento de RNA (RNA-seq) permite caracterização imparcial da expressão gênica específica do tipo celular, que por sua vez orienta os cientistas a investigar as funções gênicas em redes celulares densas⁷. RNA-seq tinha sido feito principalmente em amostras a granel, levando à descoberta de uma assinatura do gene microglial homeostático que os distingue de outras células neurais e imunes⁹. No entanto, tal abordagem poderia ignorar as diferenças moleculares e funcionais entre a microglia, especialmente aqueles que estão transitoriamente presentes no desenvolvimento, ou associados ao envelhecimento e à doença. Na verdade, rna-seq de célula única (scRNA-seq) oferece a sensibilidade e resolução que revolucionaram o campo, revelando a heterogeneidade anteriormente subestimada da microglia em uma variedade de contextos^2,3,10. Além disso, devido à presença de outras células imunes semelhantes na interface de circulação do SNC, a scRNA-seqs fornece informações que auxiliam o projeto de novas ferramentas para separar e dissecar funcionalmente essas células relacionadas com pouco conhecimento prévio^2,11.

Uma disposição diversa de plataformas do scRNA-seq foi inventada, cada um apropriada para determinadas aplicações^12. Em geral, os métodos baseados em gotículas, como 10x Genômica, são mais elevados em taxa de rendimento com (dezenas de) milhares de células sequenciadas em cada corrida, e são menos seletivas para a entrada que pode conter populações de células mistas que exigem uma categorização ampla. Métodos baseados em placas fornecem maior sensibilidade e ler profundidade^13,14, geralmente visando populações específicas de classificação celular para revelar diferenças sutis ou transcrições raras. Dada a pequena porcentagem de células microgliais, particularmente aquelas subpopulações associadas ao desenvolvimento ou à doença, entre todos os tipos de células do SNC, muitas vezes é desejável isolar a microglia de uma região específica de interesse e obter informações transcriomicas profundas e completas para entender sua heterogeneidade.

Aqui, fornecemos detalhes sobre como isolar a microglia de diferentes regiões cerebrais do camundongo dissecadas de um único hemisfério, que são usados para RNA-seq de célulaúnica (ou a granel) após um procedimento de preparação de biblioteca semi-automatizado baseado em placa. O outro hemisfério pode então ser usado para validação histológica. Simplificado a partir de um método publicado anteriormente^9,este protocolo de isolamento visa maximizar o rendimento de uma pequena quantidade de materiais de partida e, entretanto, manter perfis endógenos de expressão gênica microglial. Usamos a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para enriquecer a microglia (ou outras células imunes de interesse relacionadas) em placas de 96 poços e miniaturizar os volumes de reagentes para a preparação da biblioteca, a fim de aumentar a taxa de transferência. Destacamos essa plataforma scRNA-seq sensível, embora outras estratégias baseadas em placas possam ser aplicadas. Este método pode ser facilmente adaptado para isolar a microglia de outros tecidos dissecados, como lesões ou focos de doença, e a idade do rato pode variar em quase todos os estágios pós-natais. O isolamento eficiente da microglia regional para estudos de transcriptômica unicelular facilitará uma melhor compreensão de suas funções na saúde e na doença.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo roedores se conformaram com as diretrizes da Universidade de Stanford, que cumprem as leis e políticas nacionais e estaduais. Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Painel Administrativo de Cuidados Com Animais laboratoriais da Universidade de Stanford.

Nota: Todas as composições de solução e tampão são fornecidas na Tabela de Materiais.

1. Preparação no Dia do Isolamento Celular

1. Prepare os seguintes reagentes e refrigere-os no gelo: médio A (50 mL), tampão de classificação de células ativadas magnéticas (MCS) (30 mL), tampão FACS (25 mL), soro lógico tampão de fosfato (PBS; 30 mL), DNase (320 μL) e inibidor de RNase (30 μL).
   Nota: Os volumes fornecidos aqui são suficientes para isolar a microglia de 4 regiões cerebrais (por exemplo, córtex, cerebelo, hipocampo e estriado) de um único hemisfério cerebral de camundongos. Aumente se mais tecidos forem usados.
2. Coloque quatro homogeneizadores Limpos de 2 mL Dounce no gelo e adicione 2 mL de médio A com 80 μL de DNase (12.500 unidades/mL) e 5 μL de inibidor de RNase em cada homogeneizador Dounce. Chill os pistões em tubos de 15 mL.
3. Rotular quatro pratos de Petri de 6 cm com regiões cerebrais para coleta de tecidos e adicione 200 μL de meio frio A em cada prato no gelo. Adicione cerca de 5 mL de médio A em uma placa de Petri de 6 cm para dissecação.
   Nota: Antes de usar, certifique-se de que todos os reagentes são estéreis e adequados para aplicações de RNA. Ferramentas de bancada e dissecação precisam ser limpas e pulverizadas com solução de descontaminação rnase(Tabela de Materiais).

2. Dissecção da região do cérebro

Nota: Este passo deve levar ~ 30 min.

1. Injete 400 a 500 μL de cetamina/xilazine (24 mg/mL quetamina e 2,4 mg/mL xilázine) no peritônio de um rato de estágio juvenil a adulto (>1 mês de idade).
   Nota: Um rato masculino é usado aqui para ilustração, mas qualquer sexo é adequado.
2. Espere por 5 min e beliscar uma pata traseira para garantir a falta de retratação.
3. Use imediatamente uma agulha 26 G x 3/8 para realizar perfusão transcárdica com 20 a 30 mL de PBS gelada até que o tampão se esgote sem sangue visível.
4. Decapite o rato com uma tesoura cirúrgica. Use pequenas tesouras para abrir a pele para expor o crânio por baixo, e depois cortar a sutura sulácida, sutura lambdoidal e sutura coronal. Use fórceps para retirar ambos os lados do osso parietal e osso interparietal sem danificar o tecido, e mover cuidadosamente o cérebro para a placa de Petri dissecação com médio A.
5. Use uma lâmina pré-refrigerada para cortar o cérebro através da linha média em dois hemisférios.
   Nota: As quatro regiões cerebrais descritas aqui a partir de um único hemisfério produzem um número suficiente de microglia para aplicações de RNA-seq unicelulares ou em massa. O outro hemisfério pode ser usado para imunohistoquímica ou rna in situ validação.
6. Separe o cerebelo do lobo cortical e da haste do cérebro com #55 fórceps e transfira o tecido em um prato de Petri da coleção.
7. Use #55 fórceps para dissecar cuidadosamente o hipocampo e o estriado do córtex e transfira cada tecido para uma placa de Petri de coleção.

3. Dissociação de tecido mecânico

Nota: Mantenha as células e reagentes esfriar o tempo todo, exceto durante os passos de coloração. Este passo deve levar ~ 30 min.

1. Pique cada tecido cerebral com uma lâmina de barbear em 3^mm.
2. Use 1 pipette mL (com dicas cortadas) para transferir pedaços de tecido para os homogeneizadores Dounce pré-refrigerados, cada um contendo 2 mL de médio A com inibidor de DNase e RNase.
3. Homogeneize o tecido lentamente torcendo o pistão dentro e fora do homogeneizador Dounce por 6-10 traços completos, até que nenhum pedaço visível esteja presente.
   Nota: Douncing mata neurônios e a maioria das outras células gliais, mas deixar as células microgliais bastante intacta. Tanto insuficiente e over-douncing pode levar a baixo rendimento das células.
4. Transfira tecidos dissociados em tubos de 50 mL através de 70 filtros μm.
5. Lave cada homogeneizador e pistão Dounce com um total de 6 mL de frio médio A e filtrar a solução de lavagem através do mesmo filtro no tubo correspondente.
6. Transfira as suspensões de célula única (cerca de 8 mL cada) em tubos cônicos de 15 mL e centrífuga a 400 x g por 5 minutos a 4 °C com freio = 5.

4. Remoção de mielina

Nota: Este passo deve levar ~ 60 min.

1. Prepare 1 grande coluna de esgotamento (LD) (para córtex) e 3 colunas de grande seleção (LS) (para as outras 3 regiões) em um separador magnético(Tabela de Materiais). Lave cada coluna com 3 mL de tampão MCS.
2. Uma vez que a centrífugação é terminada, pipeta para fora e descarte o supernatant sem perturbar a pelota. Para os tecidos do córtex e do cerebelo, resuspenda as células em 850 μL de tampão de SMC com 1,8 μL de inibidor de RNase. Para tecidos do hipocampo e do estriado, resuspenda pilhas em 400 μL do amortecedor de MCS com 0.9 μL do inibidor de RNase.
   Nota: As colunas (LD vs LS) e o volume utilizado para resuspensão são otimizados com base na quantidade de mielina presente no tecido. Se outras regiões cerebrais são analisadas, essas condições podem precisar ser ajustadas dependendo do tamanho do tecido e quanta mielina pode existir. A eficácia da remoção da mielina pode ser estimada na etapa 4.9.
3. Adicione 100 μL de contas de remoção de mielina cada um em células de córtex e cerebelo e adicione 50 μL de contas de remoção de mielina cada um em células do hipocampo e estriado.
4. Misture delicadamente as pilhas com os grânulos e incuba os tubos no gelo por 10 min.
5. Traga o volume do tubo com células corticais para 2 mL com tampão MCS, e todos os outros para 1 mL (ou seja, adicionar 1 mL para células corticais; 500 μL para células hipocampais e estriais; não há necessidade de adicionar buffer para células cerebelares).
6. Uma vez que as colunas estão vazias de enxaguamento tampão, coloque um tubo de 15 mL abaixo de cada coluna. Carregue células corticais (2 mL) na coluna LD, e todas as outras (1 mL cada) nas colunas ls. Use imediatamente 1 mL de tampão MCS cada um para lavar os tubos originais e carregar a solução nas colunas correspondentes.
7. Lave a coluna LD uma vez com 1 mL de tampão MCS e lave cada coluna LS duas vezes com 1 mL de tampão MCS cada lavagem. Continue a recolher a solução de fluxo durante a lavagem.
8. Filtrar as células em tubos facs inferiores redondos através de 35 tampas de filtro μm.
   Nota: Cada tubo deve coletar cerca de 4 mL de suspensão de célula única esgotada de mielina.
9. Opcionalmente, pegue 10 μL da suspensão celular e misture-a com 10 μL de 0,4% solução azul trypan. Examine as células um microscópio de campo brilhante de 10x para estimar o rendimento, a taxa de sobrevivência e o nível de mielina residual.
   Nota: Uma preparação bem sucedida deve gerar mais de 90% de células vivas (redondas em forma e excluindo o tinuoso azul) com pouco ou nenhum detrito de mielina.
10. Células de pelotas nos tubos FACS a 400 x g por 5 min a 4 °C, com freio = 5. Lentamente despeje supernatant e dab a borda do tubo em papel de seda. Resuspenda as células em cada tubo com 300 μL de tampão FACS.
    Nota: Se a classificação mcs é preferido, contas CD11b pode ser usado para selecionar microglia e outras células mieloides após a remoção de mielina. Estas células podem então ser usadas para scRNA-seq não baseado em placa, bem como rna-seq em massa. A ressalva desta abordagem alternativa é que as contas CD11b não separam a microglia de outras células imunes relacionadas, que também são positivas para este antígeno.

5. Coloração para triagem celular ativada por fluorescência

Nota: Este passo deve levar ~ 40 min.

1. Adicione 5 μL de receptores do mouse Fc bloquear reagente(Tabela de Materiais)em cada tubo. Incubar por 5 min no gelo.
2. Adicione 1 μL de CD45-PE-Cy7 e 1 μL de CD11b-BV421 em cada tubo.
   Nota: Os anticorpos com outros fluorophores conjugados podem ser usados. Os anticorpos contra o TMEM119, um marcador específico para microglia homeostática^9,também podem ser incluídos, mas recomenda-se que sejam usados em conjunto com CD45 e CD11b, pois certas subpopulações de microglia podem perder a expressão superficial TMEM119.
3. Incubar os tubos em uma coqueteleira por 10 min à temperatura ambiente (RT).
4. Adicione 2 mL de buffer FACS para lavar.
5. Células de pelotas a 4 °C, 400 x g por 5 min. Lentamente despeje supernatant e dab a borda do tubo em papel de seda. Resuspenda as células em cada tubo usando 400 μL de tampão FACS com 1 μL de inibidor de RNase e 0,5 μL de iodeto propidium (PI, 1:1,000 diluição).

6. Classificação facs índice

Nota: Este passo deve levar ~ 1 h.

1. Seguindo o procedimento facs padrão, desenhar portões com base na dispersão (excluindo detritos), células individuais, células vivas (PI negativo), microglia e células mieloides (CD45⁺, CD11b⁺).
   Nota: As células microgliais típicas expressam CD45 em níveis mais baixos em comparação com outros macrófagos associados à fronteira, como macrófagos perivasculares e meningeais, e, portanto, gating em CD45 CD11b baixo⁺ deve ser suficiente se o foco da pesquisa é perfis de expressão gênica nestes microglia clássico^1,2. No entanto, certos subconjuntos de microglia podem ter maior expressão de CD45 e isso é particularmente verdadeiro durante o desenvolvimento ou em condições da doença. Para garantir a análise imparcial da expressão do gene microglial, os imunofenótipos baixos cd45 altos e cd45 podem ser registrados por meio da configuração de classificação de índices e ambas as populações coletadas para sequenciamento e análise a jusante. Além disso, a expressão superficial tmem119 pode ser usada para atingir a população microglial homeostática (ver passo 5.2) e analisada juntamente com os níveis de CD45 e os resultados de sequenciamento.
2. Classifique a microglia única (com um bico de 100 μm) em placas de reação em cadeia de polimerase de 96 poços (PCR), contendo 4 μL de lume de lise cada poço (veja o protocolo publicado¹⁴ para detalhes).
   Nota: O RNA External Control Consortium (ERCC) RNA spike-in mix(Tabela de Materiais)pode ser adicionado em 1:2.4 x 10⁷ no buffer de lyse para controle de qualidade e fins de normalização².
3. Vórtice brevemente as placas e girar para baixo usando uma centrífuga banco-top.
4. Congele imediatamente as amostras em gelo seco. Guarde as placas a -80 °C até a preparação da biblioteca.
   Nota: Alternativamente, mais células podem ser coletadas em tubos de 1,5 mL com buffer de extração de RNA para RNA-seq em massa. De acordo com a experiência dos autores, 3.000 células são suficientes para gerar bibliotecas de boa qualidade após o protocolo publicado^2,14.

7. Preparação da Biblioteca de Sequenciamento de RNA unicelular

Nota: Aqui, o protocolo publicado¹⁴ é seguido para gerar bibliotecas scRNA-seq com o auxílio de robótica de manuseio de líquidos e algumas modificações. Neste artigo, o procedimento é descrito apenas brevemente, e as diferenças são destacadas. O processamento de 4 placas simultaneamente leva cerca de 2,5 dias.

1. Descongelar placas no gelo e realizar transcrição reversa com primer Oligo-dT30VN (no tampão de lise) para gerar cDNA com cyclers térmicos (Tabela 1): 42 °C 90 min; 70 °C 5 min; 4 °C espera. Em seguida, amplificar cDNA com um passo de digestão exonuclease adicional no início (Tabela 2) usando a mistura mestre PCR e primers in situ PCR (ISPCR)(Tabela de Materiais)e a seguinte condição pcr: 37 °C 30 min; 95 °C 3 min; 23 ciclos de 98 °C 20 s, 67 °C 15 s, 72 °C 4 min; 72 °C 5 min.
2. Purificar cDNA usando 18 μL de contas magnéticas por poço (0,7:1 ratio). Incubar a placa em um suporte magnético por 5 min e lavar amostras duas vezes com recém-feito 80% etanol, 80 μL por poço de cada vez. Depois de secar a placa por 15-20 min, cDNA elute com 20 μL de tampão de elução por poço.
   Nota: Para controle de qualidade, use um analisador de fragmentos (análise de fragmentos de sequenciamento de alta sensibilidade de próxima geração [NGS], 1 a 6.000 bp) para verificar distribuições de tamanho e concentrações de CDNA, e apenas mais amostras de processo com uma mancha entre 500 e 5.000 bp e superior a 0,05 ng/μL.
3. Para gerar bibliotecas, misture 0,4 μL de cada amostra de cDNA com 1,2 μL de reagentes de tagmentation Tn5 do kit de preparação da biblioteca(Mesa de Materiais)em uma placa de 384 poços com o auxílio de uma máquina de pipetting nanolitro, a 55 °C 10 min.
   Nota: Aqui, 1/12.5 do volume de reação sugerido (5 μL amostra e 15 μL de reagentes de tagmentation) é adicionado a fim de reduzir o custo e, entretanto, aumentar a taxa de rendimento. Uma máquina de tubulação de nanolitros(Mesa de Materiais)é usada para transferir reagentes (este e a seguir passos) de e para placas de 384 poços.
4. Adicione 0,4 μL de buffer de neutralização para parar a reação de tagmentation no RT por 5 min.
5. Adicionar 384 índices(Tabela de Materiais, 0,4 μL para a frente e 0,4 μL reverso), 1,2 μL de mix de PCR para amostras (2 μL cada), e amplificar as bibliotecas usando a seguinte condição: 72 °C 3 min; 95 °C 30 s; 10 ciclos de 95 °C 10 s, 55 °C 30 s, 72 °C 1 min; 72 °C 5 min.
6. Reúna todas as bibliotecas individuais (pegue 1 μL cada) da mesma placa de 384 poços juntas, e use contas magnéticas(Tabela de Materiais,proporção de 0,7:1) para purificar as bibliotecas juntas finais.
7. Use um fluorometer(Tabela de Materiais)para medir as concentrações e um bioanalisador(Tabela de Materiais)para examinar as distribuições de tamanho de bibliotecas agrupadas antes do sequenciamento. Alvo a profundidade de sequenciamento em 1 milhão de leituras cruas por célula.
8. Siga os procedimentos bioinformatic padrão para filtrar e aparar leituras de sequenciamento e realizar alinhamento^2. Use a tabela de contagem e meta dados como entradas para fazer análise de agrupamento com o pacote Seurat¹⁵.

Resultados

Este protocolo descreve um método para isolar e classificar microglia de diferentes regiões cerebrais em um hemisfério cerebral adulto perfundido, seguido por scRNA-seq. Usamos douncing para criar suspensão de célula única e também como um primeiro passo para enriquecer microglia. Insuficiente ou excesso de douncing reduz o rendimento. Além disso, os cérebros de camundongos adultos contêm altos níveis de mielina, o que também pode reduzir a eficiência de classificação e o rendimento se não for removido co...

Discussão

Microglia interage ativamente com outros tipos de células no SNC, e eles são muito sensíveis a estímulos ambientais. A fim de minimizar as respostas inflamatórias e as mudanças aberrantes em sua expressão gênica durante o processo de isolamento, este protocolo foi simplificado a partir de um método publicado anteriormente⁹, e agora é adequado para isolar microglia de várias regiões de um único hemisfério cerebral do rato em paralelo. Os tecidos e reagentes são mantidos em temperatur...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 M Betaine	Sigma-Aldrich	Cat# B0300-5VL
10 mM dNTP mix	Thermo Fisher Scientific	Cat# R0192
0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15575020
10X Hanks’ Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	Cat# 14185-052
1 M HEPES	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix	Kapa Biosciences	Cat# KK2602
5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap	Corning	Cat# 352235
AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp)	Advanced Analytical	Cat# DNF-474-1000
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A8806
DNase I	Worthington	Cat# LS002007	Working solution: 12500 units/ml
DTT, Molecular Grade	Promega	Cat# P1171
ERCC RNA Spike-In Mix	Thermo Fisher Scientific	Cat# 4456740
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10437-028
Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2001
Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2002
Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2003
Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2004
Lambda Exonuclease (5 U/μl)	New England BioLabs	Cat# M0262S
Mouse Fc block	BD Pharmingen	Cat# 553142
Myelin removal beads	Miltenyl Biotec	Cat# 130-096-433
Nextera XT DNA Sample Prep Kit	Illumina	Cat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)	Illumina	Cat# 20024907
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	Cat# 70011044
PCRClean DX beads	Aline Biosciences	Cat# C-1003-50
Propidium Iodide	Thermo Fisher Scientific	Cat# P3566	Staining: 1:1000
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermal Fisher Scientific	Cat# Q32851
Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101236; RRID: AB_11203704	Staining: 1:300
Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)	Thermo Fisher Scientific	Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625	Staining: 1:300
Recombinant RNase Inhibitor	Takara Bio	Cat# 2313B
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)	Clontech	Cat# 639538	Containing 5x First strand buffer
Oligonucleotides
0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3'			(Picelli et al., 2014)
Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3'			(Picelli et al., 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base)			(Picelli et al., 2014)
Solutions
FACS buffer			Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS
MCS buffer			Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS
Medium A			Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red
Plates
384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific	VWR	89005-556
Hard-shell 96-well PCR plates	Bio-Rad	HSP9631
Others
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dounce homogenizer, 2 ml	Wheaton	357422
Large depletion column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Large selection column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RNAzap	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Strainer (70 μm)	Falcon	352350
Equipment
BD FACSAria II	BD Biosciences	http://www.bdbiosciences.com/
Bioanalyzer	Agilent	2100
Fragment Analyzer	Agilent	5300
Mosquito HTS nanoliter pipetting robot	TTP Labtech	https://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33226