Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

Resumen

Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.

Resumen

Como macrófagos residentes en el sistema nervioso central, la microglia controla activamente el desarrollo cerebral y la homeostasis, y sus disfunciones pueden impulsar enfermedades humanas. Se han realizado avances considerables para descubrir las firmas moleculares de la microglia homeostática, así como las alteraciones de su expresión génica en respuesta a los estímulos ambientales. Con el advenimiento y la maduración de metodologías genómicas de una sola célula, se reconoce cada vez más que la microglia heterogénea puede subyacen a las diversas funciones que desempeñan en diferentes condiciones de desarrollo y patológicas. La disección adicional de dicha heterogeneidad puede lograrse mediante el aislamiento eficiente de la microglia de una región determinada de interés, seguido de perfiles sensibles de células individuales. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento rápido de la microglia de diferentes regiones cerebrales en un solo hemisferio cerebral de ratón adulto. También demostramos cómo utilizar estas microglia ordenadas para la secuenciación de ARN de una sola célula profunda a base de placas. Discutimos la adaptabilidad de este método a otros escenarios y proporcionamos directrices para mejorar el sistema para adaptarse a estudios a gran escala.

Introducción

Microglia, que representa el 5% al 10% de todas las células neuronales, son macrófagos residentes dispersos por todo el sistema nervioso central (SNC)¹. Protegida detrás de la barrera hematoencefálica, la microglia típica en un cerebro adulto sano contiene muchos procesos finos que se extienden y se retraen rápidamente para interactuar con las neuronas y otras células gliales en el parénquima. Microglia también puede adoptar la morfología amoeboides asociada con el aumento de la función fagocítica durante etapas específicas del desarrollo o ante los desafíos inmunológicos en lesiones y enfermedades^1,2,3,4. Descubrimientos emocionantes recientes han demostrado claramente que la microglia no son de ninguna manera transeúntes pasivos a señales derivadas del cerebro o patológicas, pero desempeñan un papel fundamental en el control del desarrollo cerebral y la homeostasis, por ejemplo, apoyando la supervivencia neuronal, podando sysese inmaduros, promoviendo la diferenciación de las células del linaje de oligodendrocitos, así como la angiogénesis¹. A medida que se aclaran más funciones de la microglia, la excitación se alimenta aún más de estudios de genética humana, que mostraron que muchos genes de riesgo de enfermedades neurodegenerativas, como TREM2, se expresan predominante o exclusivamente por microglia^5,6,7. Dada su importancia en el desarrollo y los roles plausibles de conducción de enfermedades, recientemente se ha hecho un enorme esfuerzo para nuestra comprensión de la regulación y función de los genes microgliales con la esperanza de encontrar nuevas dianas terapéuticas para las enfermedades neurodegenerativas^1,8.

La secuenciación de ARN (RNA-seq) permite la caracterización imparcial de la expresión génica específica del tipo de célula, que a su vez guía a los científicos para investigar las funciones genéticas en redes celulares densas^7. ARN-seq se había hecho principalmente en muestras a granel, lo que llevó al descubrimiento de una firma de genes microgliales homeostáticos que las distingue de otras células neuronales e inmunitarias^9. Sin embargo, este enfoque podría pasar por alto las diferencias moleculares y funcionales entre la microglia, especialmente las presentes transitoriamente en el desarrollo, o asociadas con el envejecimiento y la enfermedad. De hecho, el ARN-seq de una sola célula (scRNA-seq) ofrece la sensibilidad y la resolución que han revolucionado el campo al revelar la heterogeneidad previamente poco apreciada de la microglia en una variedad de contextos^2,3,10. Además, debido a la presencia de otras células inmunitarias similares en la interfaz de circulación del SNC, scRNA-seq proporciona información que ayuda al diseño de nuevas herramientas para separar y diseccionar funcionalmente estas células relacionadas con poco conocimiento previo^2,11.

Se ha inventado una amplia gama de plataformas scRNA-seq, cada una adecuada para ciertas aplicaciones¹². En general, los métodos basados en gotas, como 10x Genomics, son mayores en rendimiento con (decenas de) miles de celdas secuenciadas en cada ejecución, y son menos selectivos para la entrada que puede contener poblaciones de células mixtas que requieren una categorización amplia. Los métodos basados en placas proporcionan una mayor sensibilidad y profundidad de lectura^13,14, por lo general dirigidos a poblaciones específicas de la clasificación celular para revelar diferencias sutiles o transcripciones raras. Dado el pequeño porcentaje de células microglia, en particular las subpoblaciones asociadas al desarrollo o a la enfermedad, entre todos los tipos de células del SNC, a menudo es deseable aislar la microglia de una región específica de interés y obtener información transcriptomica profunda y completa para comprender su heterogeneidad.

Aquí, proporcionamos detalles sobre cómo aislar la microglia de diferentes regiones cerebrales de ratón diseccionadas de un solo hemisferio, que se utilizan para ARN-seq de una sola célula (o a granel) siguiendo un procedimiento de preparación de biblioteca ssemi-automatizado basado en placas. El otro hemisferio se puede utilizar para la validación histológica. Simplificado a partir de un método publicado anteriormente⁹, este protocolo de aislamiento tiene como objetivo maximizar el rendimiento de una pequeña cantidad de materiales de partida, y mientras tanto mantener perfiles de expresión génica microglial endógenos. Utilizamos la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para enriquecer la microglia (u otras células inmunitarias relacionadas de interés) en placas de 96 pocillos y miniaturizar los volúmenes de reactivos para la preparación de la biblioteca con el fin de aumentar el rendimiento. Destacamos esta plataforma sensible scRNA-seq, aunque se pueden aplicar otras estrategias basadas en placas. Este método se puede adaptar fácilmente para aislar la microglia de otros tejidos diseccionados, como lesiones o focos de enfermedad, y la edad del ratón puede variar en casi cualquier etapa postnatal. El aislamiento eficiente de la microglia regional para estudios de transcriptomica de una sola célula facilitará una mejor comprensión de sus funciones en salud y enfermedades.

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Protocolo

Todos los procedimientos que involucran roedores se ajustan a las directrices de la Universidad de Stanford, que cumplen con las leyes y políticas nacionales y estatales. Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Panel Administrativo de La Universidad de Stanford sobre Cuidado de Animales de Laboratorio.

NOTA: Todas las composiciones de solución y tampón se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Preparación en el Día del Aislamiento Celular

1. Preparar los siguientes reactivos y enfriarlos en hielo: medio A (50 ml), tampón de clasificación de células activada sormicas magnéticamente (MCS) (30 ml), tampón FACS (25 ml), solución salina con fosfato (PBS; 30 ml), DNase (320 l) e inhibidor de la rnasa (30 l).
   NOTA: Los volúmenes proporcionados aquí son suficientes para aislar la microglia de 4 regiones cerebrales (por ejemplo, corteza, cerebelo, hipocampo y estriado) de un solo hemisferio cerebral de ratón. Escalar verticalmente si se utilizan más tejidos.
2. Colocar cuatro homogeneizadores de Dounce limpios de 2 ml sobre hielo y añadir 2 ml de medio A con 80 ml de DNase (12.500 unidades/ml) y 5 ml de inhibidor de la rnalosa en cada homogeneizador Dounce. Enfríe los pistones en tubos de 15 ml.
3. Etiquetar cuatro platos Petri de 6 cm con regiones cerebrales para la recolección de tejidos y añadir 200 ml de medio frío A en cada plato sobre hielo. Añadir unos 5 ml de medio A en una placa Petri de 6 cm para la disección.
   NOTA: Antes de su uso, asegúrese de que todos los reactivos sean estériles y adecuados para aplicaciones de ARN. Las herramientas de banco y disección deben limpiarse y rociarse con la solución de descontaminación RNase(Tabla de materiales).

2. Disección de la región cerebral

NOTA: Este paso debe tomar 30 min.

1. Inyectar 400 a 500 l de ketamina/xilazina (24 mg/ml de ketamina y 2,4 mg/ml de xilazina) en el peritoneo de un ratón de etapa de menor a adulto (>1 mes de edad).
   NOTA: Un ratón macho se utiliza aquí para la ilustración, pero cualquiera de los dos géneros es adecuado.
2. Espere 5 minutos y pellizca una pata trasera para asegurar la falta de retracción.
3. Utilice inmediatamente una aguja de 26 G x 3/8 para realizar perfusión transcardial con 20 a 30 ml de PBS helado hasta que el tampón se agote sin sangre visible.
4. Decapita el ratón con un par de tijeras quirúrgicas. Usa tijeras pequeñas para abrir la piel para exponer el cráneo debajo, y luego corta a través de la sutura sagital, sutura lambdoidal y sutura coronal. Use fórceps para extraer ambos lados del hueso parietal y el hueso interparietal sin dañar el tejido, y mueva cuidadosamente el cerebro a la disección Petri plato con medio A.
5. Usa una hoja preenfriada para cortar el cerebro a través de la línea media en dos hemisferios.
   NOTA: Las cuatro regiones cerebrales descritas aquí desde un solo hemisferio producen un número suficiente de microglia para aplicaciones de ARN-seq de una sola célula o a granel. El otro hemisferio se puede utilizar para inmunohistoquímica o validación in situ de ARN.
6. Separe el cerebelo del lóbulo cortical y el tallo cerebral con #55 fórceps y transfiera el tejido a una placa Petri de colección.
7. Use #55 fórceps para diseccionar cuidadosamente el hipocampo y el estriado de la corteza y transferir cada tejido a una placa Petri de colección.

3. Disociación mecánica de tejidos

NOTA: Mantenga las células y los reactivos frescos todo el tiempo, excepto durante los pasos de tinción. Este paso debe tomar 30 min.

1. Pica cada tejido cerebral con una cuchilla de afeitar en <1 mm³ piezas finas.
2. Utilice una pipeta de 1 ml (con las puntas cortadas) para transferir piezas de tejido a los homogeneizadores Dounce pre-enfriados, cada uno de los cuales contiene 2 ml de medio A con DNase e inhibidor de la RNase.
3. Homogeneizar el tejido girando lentamente el pistón dentro y fuera del homogeneizador Dounce para 6 x 10 trazos completos, hasta que no haya trozos visibles presentes.
   NOTA: Douncing mata las neuronas y la mayoría de las otras células gliales, pero deja las células microgliales bastante intactas. Tanto la insuficiencia como el exceso de douncción pueden conducir a un bajo rendimiento de las células.
4. Transfiera los tejidos disociados a tubos de 50 ml a través de coladores de 70 m.
5. Enjuague cada homogeneizador y pistón Dounce con un total de 6 ml de medio frío A y filtre la solución de enjuague a través del mismo colador en el tubo correspondiente.
6. Transfiera las suspensiones de una sola célula (alrededor de 8 ml cada una) en tubos cónicos de 15 ml y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 oC con freno 5.

4. Eliminación de mielina

NOTA: Este paso debe tomar 60 min.

1. Preparar 1 columna de agotamiento grande (LD) (para corteza) y 3 columnas de selección grande (LS) (para las otras 3 regiones) en un separador magnético(Tabla de materiales). Enjuague cada columna con 3 ml de búfer MCS.
2. Una vez finalizada la centrifugación, descarte y deseche el sobrenadante sin molestar el pellet. Para los tejidos de corteza y cerebelo, resuspendan las células en 850 ml de tampón de MCS con 1,8 ml de inhibidor de la RNase. Para los tejidos del hipocampo y del estriado, resuspenda las células en 400 ml de tampón de MCS con 0,9 ml de inhibidor de la RNase.
   NOTA: Las columnas (LD vs LS) y el volumen utilizado para la resuspensión se optimizan en función de la cantidad de mielina presente en el tejido. Si se ensayan otras regiones cerebrales, estas condiciones pueden necesitar ser ajustadas dependiendo del tamaño del tejido y la cantidad de mielina puede existir. Eficacia de la eliminación de mielina se puede estimar en el paso 4.9.
3. Añadir 100 s l de cuentas de eliminación de mielina cada una en las células de la corteza y el cerebelo y añadir 50 s de cuentas de eliminación de mielina cada una en las células del hipocampo y el estriado.
4. Mezclar suavemente las células con cuentas e incubar los tubos sobre hielo durante 10 min.
5. Lleve el volumen del tubo con células corticales a 2 ml con tampón MCS, y todos los demás a 1 ml (es decir, agregue 1 ml para las células corticales; 500 l para las células hipocampales y estriales; no hay necesidad de agregar tampón a las células cerebelosas).
6. Una vez que las columnas estén vacías de tampón de enrteo, coloque un tubo de 15 ml debajo de cada columna. Cargue las células corticales (2 mL) en la columna LD, y todas las demás (1 mL cada una) en las columnas LS. Utilice inmediatamente 1 ml de búfer MCS cada uno para lavar los tubos originales y cargar la solución en las columnas correspondientes.
7. Lave la columna LD una vez con 1 mL del buffer MCS y lave cada columna LS dos veces con 1 mL del buffer MCS cada lavado. Continúe recogiendo la solución de flujo a través durante el lavado.
8. Filtre las células en tubos FACS de fondo redondo a través de tapas de colador de 35 m.
   NOTA: Cada tubo debe recoger unos 4 ml de suspensión de una sola célula agotada de mielina.
9. Opcionalmente, tome 10 s de la suspensión celular y mezcle con 10 sL de solución azul trypan al 0,4%. Examine las células bajo un microscopio de campo brillante 10x para estimar el rendimiento, la tasa de supervivencia y el nivel de mielina residual.
   NOTA: Una preparación exitosa debe generar más del 90% de células vivas (redondas en forma y excluyendo el tinte azul) con poco o ningún residuo de mielina.
10. Células de pelet en los tubos FACS a 400 x g durante 5 min a 4oC, con freno a 5. Vierta lentamente el sobrenadante y aterve el borde del tubo en papel tisú. Resuspenda las células de cada tubo con 300 ml de tampón FACS.
    NOTA: Si se prefiere la clasificación MCS, se pueden utilizar perlas CD11b para seleccionar microglia y otras células mieloides después de la eliminación de mielina. Estas células se pueden utilizar para scRNA-seq no a base de placas, así como ARN-seq a granel. La advertencia de este enfoque alternativo es que las cuentas CD11b no separan la microglia de otras células inmunitarias relacionadas que también son positivas para este antígeno.

5. Tinción para clasificación celular activada por fluorescencia

NOTA: Este paso debe tomar 40 min.

1. Añadir 5 l de reactivo de bloque de receptores Fc de ratón(Tabla de materiales)en cada tubo. Incubar durante 5 minutos sobre hielo.
2. Añadir 1 l de CD45-PE-Cy7 y 1 l de CD11b-BV421 en cada tubo.
   NOTA: Se pueden utilizar anticuerpos con otros fluoróforos conjugados. También se pueden incluir anticuerpos contra TMEM119, un marcador específico para la microglia homeostática^9,pero se recomienda utilizar junto con CD45 y CD11b, ya que ciertas subpoblaciones de microglia pueden perder la expresión superficial TMEM119.
3. Incubar los tubos en una coctelera durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
4. Agregue 2 mL de tampón FACS para lavar.
5. Células de pelet a 4 oC, 400 x g durante 5 min. Vierta lentamente el sobrenadante y vierta el borde del tubo en papel tisú. Resuspender las células en cada tubo utilizando 400 ml de tampón de FACS con 1 l de inhibidor de la RNase y 0,5 ml de yoduro de propidio (PI, 1:1.000 dilución).

6. Clasificación de FACS de índice

NOTA: Este paso debe tomar 1 h.

1. Siguiendo el procedimiento FACS estándar, dibuje compuertas basadas en dispersión (excluyendo desechos), celdas individuales, células vivas (PI negativo), células microglia y células mieloides (CD45⁺, CD11b⁺).
   NOTA: Las células microgliales típicas expresan CD45 a niveles más bajos en comparación con otros macrófagos asociados a los fronteras, como los macrófagos perivasculares y meningeales, y por lo tanto la medición de CD45 bajo CD11b⁺ debería ser suficiente si el enfoque de la investigación son los perfiles de expresión génica en estas microglia clásicas^1,2. Sin embargo, ciertos subconjuntos de microglia pueden tener una expresión CD45 más alta y esto es particularmente cierto durante el desarrollo o en condiciones de enfermedad. Para garantizar un análisis imparcial de la expresión génica microglial, se pueden registrar inmunofenotipos altos cd45 y CD45 bajos a través de la clasificación de índices y ambas poblaciones recopiladas para la secuenciación y el análisis posterior. Además, la expresión superficial TMEM119 puede utilizarse para dirigirse a la población microglial homeostática (véase el paso 5.2) y analizarse junto con los niveles de CD45 y los resultados de la secuenciación.
2. Ordenar una sola microglia (con una boquilla de 100 m) en placas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de 96 pocillos, que contengan 4 ml de tampón de lisis cada pocil (consulte el protocolo publicado¹⁴ para obtener más información).
   NOTA: El mix de espiga de ARN del Consorcio de Control de ARN Externo (ERCC)(Tabla de Materiales) se puede añadir a 1:2.4 x 10⁷ en el tampón de lisis para fines de control de calidad y normalización².
3. Reórtca brevemente las placas y gire hacia abajo usando una centrífuga de sobremesa.
4. Congele inmediatamente las muestras en hielo seco. Conservar las placas a -80oC hasta la preparación de la biblioteca.
   NOTA: Alternativamente, se pueden recolectar más células en tubos de 1,5 ml con tampón de extracción de ARN para ARN-seq a granel. Según la experiencia de los autores, 3.000 celdas son suficientes para generar bibliotecas de buena calidad siguiendo el protocolo publicado^2,14.

7. Preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN de una sola célula

NOTA: Aquí, el protocolo publicado¹⁴ se sigue para generar bibliotecas scRNA-seq con la ayuda de la robótica de manipulación de líquidos y algunas modificaciones. En este artículo, el procedimiento solo se describe brevemente y se resaltan las diferencias. El procesamiento de 4 placas simultáneamente toma alrededor de 2,5 días.

1. Descongelar las placas sobre hielo y realizar la transcripción inversa con imprimación Oligo-dT30VN (en el tampón de lisis) para generar ADNc cDNA con ciclodores térmicos(Tabla 1): 42 oC 90 min; 70 oC 5 min; 4 oC de espera. A continuación, amplifique el ADNc con un paso adicional de digestión exonucleasina al principio(Tabla 2) utilizando la mezcla maestra de PCR y las imprimaciones de PCR in situ (ISPCR)(Tabla de materiales)y la siguiente condición de PCR: 37 oC 30 min; 95 oC 3 min; 23 ciclos de 98 oC 20 s, 67 oC 15 s, 72 oC 4 min; 72oC 5 min.
2. Purificar el ADNC usando 18 s de perlas magnéticas por pozo (relación 0.7:1). Incubar la placa en un soporte magnético durante 5 minutos y lavar las muestras dos veces con etanol recién hecho 80%, 80 ol por pocal cada vez. Después de secar la placa durante 15-20 min, eluda elAD con 20 s de tampón de elución por pocal.
   NOTA: Para el control de calidad, utilice un analizador de fragmentos (análisis de fragmentos de secuenciación de próxima generación de alta sensibilidad [NGS], 1 a 6.000 bp) para comprobar las distribuciones de tamaño y las concentraciones de ADNc, y solo otras muestras de proceso con un frotis entre 500 a 5.000 bp y superior a 0,05 ng/L.
3. Para generar bibliotecas, mezcle 0,4 ml de cada muestra de ADNc con 1,2 l de reactivos de etiquetado Tn5 a partir del kit de preparación de la biblioteca(Tabla de materiales)en una placa de 384 pocillos con la ayuda de una máquina de pipeteo de nanolitros, a 55 oC 10 min.
   NOTA: Aquí, se añade 1/12.5 del volumen de reacción sugerido (muestra de 5 l y 15 l de reactivos de etiquetado) con el fin de reducir el costo y mientras tanto aumentar el rendimiento. Una máquina de pipeteo de nanolitros(Tabla de materiales)se utiliza para transferir reactivos (este y los siguientes pasos) desde y hacia 384 placas de pozos.
4. Añadir 0,4 l de búfer de neutralización para detener la reacción de etiquetación en RT durante 5 min.
5. Añadir 384 índices(Tabla de Materiales, 0,4 l hacia delante y 0,4 l hacia atrás), 1,2 ml de mezcla de PCR a muestras (2 l cada una) y amplificar las bibliotecas utilizando la siguiente condición: 72 oC 3 min; 95 oC 30 s; 10 ciclos de 95 oC 10 s, 55 oC 30 s, 72 oC 1 min; 72oC 5 min.
6. Agrupe todas las bibliotecas individuales (tome 1 l cada una) de la misma placa de 384 pocillos, y utilice cuentas magnéticas(Tabla de materiales,proporción 0.7:1) para purificar las bibliotecas agrupadas finales.
7. Utilice un fluorómetro(Tabla de materiales)para medir las concentraciones y un bioanalizador(Tabla de materiales)para examinar las distribuciones de tamaño de las bibliotecas agrupadas antes de la secuenciación. Apunte a la profundidad de secuenciación en 1 millón de lecturas sin procesar por celda.
8. Siga los procedimientos bioinformáticos estándar para filtrar y recortar las lecturas de secuenciación y realizar la alineación^2. Utilice la tabla de recuento y los metadatos como entradas para realizar el análisis de agrupación en clústeres con el paquete Seurat¹⁵.

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Resultados

Este protocolo describe un método para aislar y clasificar la microglia de diferentes regiones cerebrales en un hemisferio cerebral perfundido adulto, seguido de scRNA-seq. Utilizamos la douncing para crear una suspensión de una sola célula y también como un primer paso para enriquecer la microglia. Insuficiente o excesivamente douncing reduce el rendimiento. Además, los cerebros adultos del ratón contienen altos niveles de mielina, que también pueden reducir la eficiencia de clasificación y el rendimiento si no ...

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Discusión

Microglia interactúa activamente con otros tipos de células en el SNC, y son muy sensibles a los estímulos ambientales. Con el fin de minimizar las respuestas inflamatorias y los cambios aberrantes en su expresión génica durante el proceso de aislamiento, este protocolo se ha simplificado a partir de un método publicado previamente^9,y ahora es adecuado aislar la microglia de múltiples regiones de un solo hemisferio cerebral de ratón en paralelo. Los tejidos y reactivos se mantienen a tempe...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 M Betaine	Sigma-Aldrich	Cat# B0300-5VL
10 mM dNTP mix	Thermo Fisher Scientific	Cat# R0192
0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15575020
10X Hanks’ Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	Cat# 14185-052
1 M HEPES	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix	Kapa Biosciences	Cat# KK2602
5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap	Corning	Cat# 352235
AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp)	Advanced Analytical	Cat# DNF-474-1000
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A8806
DNase I	Worthington	Cat# LS002007	Working solution: 12500 units/ml
DTT, Molecular Grade	Promega	Cat# P1171
ERCC RNA Spike-In Mix	Thermo Fisher Scientific	Cat# 4456740
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10437-028
Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2001
Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2002
Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2003
Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes)	Illumina	Cat# FC-131-2004
Lambda Exonuclease (5 U/μl)	New England BioLabs	Cat# M0262S
Mouse Fc block	BD Pharmingen	Cat# 553142
Myelin removal beads	Miltenyl Biotec	Cat# 130-096-433
Nextera XT DNA Sample Prep Kit	Illumina	Cat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles)	Illumina	Cat# 20024907
PBS (10X), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	Cat# 70011044
PCRClean DX beads	Aline Biosciences	Cat# C-1003-50
Propidium Iodide	Thermo Fisher Scientific	Cat# P3566	Staining: 1:1000
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermal Fisher Scientific	Cat# Q32851
Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101236; RRID: AB_11203704	Staining: 1:300
Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11)	Thermo Fisher Scientific	Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625	Staining: 1:300
Recombinant RNase Inhibitor	Takara Bio	Cat# 2313B
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl)	Clontech	Cat# 639538	Containing 5x First strand buffer
Oligonucleotides
0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3'			(Picelli et al., 2014)
Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3'			(Picelli et al., 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base)			(Picelli et al., 2014)
Solutions
FACS buffer			Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS
MCS buffer			Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS
Medium A			Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red
Plates
384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific	VWR	89005-556
Hard-shell 96-well PCR plates	Bio-Rad	HSP9631
Others
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dounce homogenizer, 2 ml	Wheaton	357422
Large depletion column	Miltenyi Biotec	130-042-901
Large selection column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RNAzap	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Strainer (70 μm)	Falcon	352350
Equipment
BD FACSAria II	BD Biosciences	http://www.bdbiosciences.com/
Bioanalyzer	Agilent	2100
Fragment Analyzer	Agilent	5300
Mosquito HTS nanoliter pipetting robot	TTP Labtech	https://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33226