ثقافة الخلية علي اغشيه نيرايد السيليكون والتعويض عن البرد لل Synchrotron الاشعه السينية الفلورية نانو-تحليل

Summary

ويرد هنا بروتوكول لثقافة الخلية علي الاغشيه نيتريد السيليكون ويغرق-تجميد قبل التصوير الشعاعي الاشعه السينية مع السنكروتروني المبردة الاشعه السينية نانوسبر. عندما يتم توفير درجه حرارة الغرفة فقط نانو التحليل ، يمكن ان تكون العينات المجمدة مزيد من التجميد المجفف. هذه هي الخطوات الحاسمة للحصول علي معلومات حول تكوين عنصري داخل الخلايا.

Abstract

ولا يعرف سوي القليل جدا عن توزيع أيونات المعادن علي المستوي دون الخلوي. ومع ذلك ، فان هذه العناصر الكيميائية لها وظائف تنظيميه أساسيه والتوازن المضطرب وتشارك في مختلف الامراض. الدولة من بين الفن السنكروتروني الاشعه السينية النانو الفلورية توفير الحساسية المطلوبة والدقة المكانية لتوضيح ثنائي الابعاد (2d) وثلاثي الابعاد (3d) توزيع وتركيز المعادن داخل الخلايا بأكملها في مستوي عضيه. وهذا يفتح مجالات علميه جديده مثيره للتحقيق في دور المعادن في الفيزيولوجيا الفسيولوجية للخلية. ويعد الاعداد الخلوي اجراء رئيسيا ومعقدا في كثير من الأحيان ، ولا سيما بالنسبة للتحليل الأساسي. علي الرغم من ان تقنيات الاشعه السينية الآن علي نطاق واسع واستخدمت أساليب الاعداد المختلفة ، والدراسات قليله جدا وقد حققت في الحفاظ علي محتوي عنصري من الخلايا في أحسن الحال ، وليس بروتوكول مفصل متدرج للتعويض عن البرد وقد تم الإفراج عن الخلايا الملتصقة للاشعه السينية النانو الفلورية حتى الآن. هذا هو وصف للبروتوكول الذي يوفر اعداد الخلوية تدريجيا لكريوفيكسيشن السريع لتمكين السنكروتروني الاشعه السينية الشعاعية التحليل نانو الخلايا في حاله رطبه المجمدة عندما تتوفر بيئة المبردة ونقل. في حاله النانو-تحليل يجب ان يؤديها في درجه حرارة الغرفة ، ويتم توفير اجراء إضافي لتجميد التجفيف الاعداد الخلوي كريوفيكسيد. وقد تم استخدام البروتوكولات المقترحة بنجاح في الاعمال السابقة ، ومؤخرا في دراسة التوزيع الثنائي الابعاد والثلاثي الابعاد لمركب فلزي في خلايا سرطان الثدي.

Introduction

المصممة حديثا السنكروتروني الاشعه السينية الفلورية (SR-xrf) النانو تحقيقات تسمح التصور للتوزيع تحت الخلوية من العناصر بطريقه كميه بالبالكامل. وعلي سبيل المثال ، تسمح هذه القدرة التحليلية بالتحقيق في امتصاص جزيئات جسيمات نانويه¹ أو فلزي مثل المجمعات المستندة إلى الاوزميوم²، وتوفر نظره ثاقبه علي الامتصاص داخل الخلايا للجسيمات القائمة علي المعادن مع خصائص مضاده للسرطان قويه. كتقنية متعددة العناصر ، يوفر SR-XRF³ مع نانوسبر وسيله لقياس وتعريب اينتراسيلولارلي معظم العناصر الهامه بيولوجيا في وقت واحد ، بما في ذلك الفوسفور والكبريت والبوتاسيوم والكالسيوم والحديد والنحاس والزنك. في الواقع ، فان استخدام الاشعه السينية الصلبة يوفر عمق اختراق كبير للصورة كامله الخلايا المجمدة الرطبة في أزياء خاليه من التسمية. وعلاوة علي ذلك ، وتوفير الوصول إلى الحافة K من معظم عناصر الفائدة ، والاشعه السينية الفلورية هو متحمس أكثر كفاءه. ويسمح استخدام النهج المبردة بالحد من الضرر الإشعاعي والتحسين الأمثل للحفاظ علي هيكل الخلية والتوزيع العنصري.

ومعظم التقنيات التحليلية المتاحة التي تحل مكانيا لدراسة الفلزات في الخلايا هي تقنيات سطحيه تتطلب إنتاج أجزاء رقيقه جدا ومسطحه من الخلايا. ويشمل هذا أساسا مسح المجهر الكترون الإرسال مع تحليل الطاقة التشتت الاشعه السينية (الجذعية-EDX) ، والطاقة المصفاة المجهر الكترون الإرسال (EF-TEM) ، والنانو الثانوية الطيف الكتلة الايونيه (نانوسيمس). لا يمكن اجراء هذا الأخير علي أقسام الخلايا المجمدة والمائية بينما يمكن اجراء تحليل التبريد باستخدام المجهر الكتروني مع دقه مكانيه غير مسبوقة ولكن الحساسية العنصرية الضعيفة. وقد سمحت انبعاثات الاشعه السينية المستحثة بالجسيمات بدراسة التوزيعات العنصرية في الخلايا الكاملة. لديها ميزه كونها كميه تماما مع حساسية عنصري عادله علي مقياس ميكرون وحتى في submicron القرار⁴، ولكن يعاني من الاضرار الاشعاعيه وعدم وجود قدرات المبردة لدراسة الخلايا المتجمدة الرطب. كل هذه التقنيات التحليلية تكمل بعضها البعض في التصوير العنصري للخلايا ، ولكن بالنسبة لجميع التقنيات ، يعد اجراء اعداد العينات خطوه حاسمه. وينبغي الإبقاء عليه بسيطا للحد من التلوث المحتمل فضلا عن أعاده التوزيع العنصري و/أو التسرب للحصول علي نتائج ذات مغزى. كما هو موضح في المجهر الكتروني ، وسير العمل المبردة ، بما في ذلك تجميد التبريد من الخلية والكريوترانسفير إلى مرحله كرويوكانينج ، يسمح الحفاظ علي عنصري الأمثل في مستويات شبه الخلوية أقرب ما يمكن إلى الدولة الاصليه^{5،6،7،8،9،10}. وقد تم تنفيذ هذا الفهم بنجاح في تطوير المجهرية السينية الاشعه السينية اللينة (علي سبيل المثال ، المجاهر الميدانية الكاملة والمجاهر المسح الضوئي) لإنتاج التصوير الهيكلي الشامل لكامل الخلايا المجمدة الرطب في 2D أو 3D. تم تطوير مهام سير العمل المبردة المختلفة¹¹ لمجاهر الاشعه السينية الناعمة في Beamline 2.1 (XM-2) من مصدر الضوء المتقدم في مختبر لورانس بيركلي الوطني¹²، beamline U41 في حلقه تخزين الكترون Bessy الثاني (ألمانيا)¹³، BEAMLINE MISTRAL من مصدر الضوء البا (اسبانيا)¹⁴، وفي Beamline B24 من مصدر ضوء الماس¹⁵، من بين أمور أخرى. وقد تبين مؤخرا ان سير العمل المماثل هو الطريقة الأكثر موثوقيه للاعداد والحفظ للتحليل العنصري داخل الخلايا باستخدام الاشعه السينية المجهرية^16،17.

علي الرغم من ان تقنيات النانو الاشعه السينية بدات تستخدم علي نطاق واسع لتحليل عنصري الخلوية ، وخاصه مع ظهور قدرات المبردة SR-XRF ، لم يتم نشر بروتوكول متدرج حتى الآن إلى المجتمع البحثي. هنا ، يتم توفير اجراء مفصل لاعداد كريوفيكسيد الخلايا الملتصقة المستزرعة كطبقات أحاديه علي اغشيه نيرايد السيليكون ليتم تحليلها في ظل الظروف المبردة. وتقدم أيضا خطوه التجفيف بالتجميد بعد البروتوكول في حاله وجوب اجراء تحليل الاشعه السينية في درجه حرارة الغرفة. في حين تم استخدام البروتوكول المقترح بنجاح مع خلايا سرطان الثدي الإنسان MD-MB-231² وتم التدليل علي تجميد التجفيف من بين أمور أخرى علي الخلايا العصبية الماوس^18،20،21، ويمكن توسيعها بسهوله إلى أنواع مختلفه من الإنسان أو الخلية الحيوانية.

Protocol

تمت الموافقة علي الإجراءات التجريبية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية من شعبه علوم الحياة CEA (CETEA ، A14-006). وقد أجريت هذه الاتفاقات وفقا للتشريع الفرنسي والتوجيه الصادر عن مجلس الجماعة الاوروبيه في 24 تشرين الثاني/نوفمبر 1986 (86/609/EEC).

1. نيرايد السيليكون (Si₃ن₄) غشاء اعداد الدعم

ملاحظه: لان الغشاء هش وحساسة ، ودعمها (200 μm الإطار السيليكون سميكه) يجب التعامل معها بلطف ، ومثالي مع ملاقط الكربون رقيقه أو الملاقط دومونت #5 ، علي التوالي الذاتي إغلاق نصائح غرامه. استخدم هذا البروتوكول اغشيه نيرايد السيليكون مع اطار من 5 مم × 5 مم وحجم غشاء 1.5 مم × 1.5 مم. يجب اعداد الغشاء حوالي 12 ساعة قبل بدء التجربة (اي بذر الخلايا). ويمكن اعداد الاغشيه في نهاية اليوم وترك التجفيف بين عشيه وضحيها تحت الطبقة الثانية غطاء للتدفق الرقائقي بحيث تكون جاهزه للاستخدام في الصباح التالي. سمك اطار السيليكون من 200 μm هو المعيار بالنسبة لمعظم الشركات التي تبيع السيليكون نيتريد النوافذ. إذا كان المنتج المستخدم في هذا البروتوكول غير متوفر ، يمكن استخدام حجم غشاء في نطاق 0.5 − 1.5 ملم مع حجم اطار قياسي من 5 مم × 5 مم. ويفضل حجم الغشاء أكبر عندما سيتم استخدام التصوير المقطعي الاشعه السينية. TEM نوع الشبكة السيليكون نيتريد النوافذ مع حجم غشاء 0.5 مم وسمك 50 nm يمكن أيضا ان تستخدم.

1. افتح الكبسولة التي تحتوي علي دعم الغشاء Si₃N₄ (الشكل 1). اضغط برفق علي الكبسولة من أجل تخفيف الدعم بخفه.
2. عقد واحده من زوايا الإطار السيليكون باستخدام ملاقط رقيقه. يجب الحرص علي عدم لمس الغشاء Si₃N₄ في المركز. 200 أو 500 nm غشاء سميك يمكن ان تتلف بسهوله.
3. باستخدام ملاقط رقيقه ، وضع بلطف Si₃ن₄ غشاء الدعم في طبق بتري الزجاج معقمه ، سطح مستو من السيليكون نيتريد النافذة التي تواجه (اي ، تجويف التي تواجه الجزء السفلي من الطبق).
4. أزاله غطاء طبق بيتري وترك الاغشيه تحت ضوء الاشعه فوق البنفسجية لمده 25 − 30 دقيقه تحت مجلس الوزراء تدفق الرقائقي.
   ملاحظه: يتم تعيين ضوء UVC (254 nm) عاده في 200 μW/سم².
5. وضع 10 μL من بولي-L-ليسين علي الغشاء. وينبغي ان تغطي قطره Si₃ن₄ غشاء جيدا ويمكن ان ينتشر قليلا علي اطار السيليكون. ترك الأمر عند 37 درجه مئوية لمده 25 دقيقه في الحاضنة النسيج الثقافة القياسية في 100 ٪ الرطوبة النسبية و 95 ٪ الهواء ، 5 ٪ CO₂.
   ملاحظه: في هذه الحالة تم استخدام طلاء بولي-L-يسين لخلايا سرطان الثدي MDA-MB-231. اعتمادا علي نوع خط الخلية ، يمكن استخدام الطلاءات المختلفة ، وينبغي ان تكون هذه الخطوة الأمثل وفقا لذلك.
6. في لوحه معقمه 48 جيدا ، وملء ابار مختلفه مع 200 − 250 μL من المياه فائقه نقيه وفائقه الأثر تصفيتها من خلال فلتر معقم 0.22 μm. عاده ، يمكن استخدام كل بئر لشطف ما يصل إلى 2 − 3 اغشيه. باستخدام ملاقط غرامه ، والبيك أب دعم الغشاء في زاوية من اطار السيليكون. شطف الغشاء برفق عن طريق دمجه عموديا 10 ثانيه في ثلاثه ابار متتالية.
   ملاحظه: يتم أخذ الغشاء يدعم من الحاضنة ويمكن معالجتها في درجه حرارة الغرفة ، مع درجه الحرارة والرطوبة المحددة من قبل الطبقة الثانية غطاء للتدفق الرقائقي.
7. وضع الدعم غشاء عموديا في بئر فارغه من لوحه معقمه 96 جيدا ، وتغطيه ذلك ، والسماح لها الجافة بين عشيه وضحيها تحت الطبقة الثانية غطاء للتدفق.

2-بذر الخلايا

1. في لوحه معقمه 4 جيدا ، ووضع الاغشيه مع الجانب المسطح التي تواجه ما يصل.
2. يتم الحفاظ علي الخلايا MDA-MB-231 في ثقافة أحاديه الطبقة في DMEM مع الفينول الأحمر/جلوساماكس الأول ، تستكمل مع 10 ٪ مصل الساق الجنين و 1 ٪ البنسلين والسستربتومايسين في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO₂ الهواء ترطيب الحاضنة.
3. عندما تصل الخلايا 60 − 70 ٪ كونفلوينسي أزاله وسائل الاعلام من الطبق أو قارورة.
4. غسل 1x مع 10 مل من الفوسفات دولبيكو المالحة مخزنه دون Ca^{2 +} أو Mg^{2 +}.
5. أضافه 3 مل/T75 قارورة من 0.05 ٪ التريبسين/الحل أدتا والتاكد من ان الطبقة الاحاديه بأكملها مغطاه بمحلول التريبسين.
6. احتضان لمده 3 − 5 دقيقه عند 37 درجه مئوية حتى تبدا الخلايا في الفصل. يجب الحرص علي عدم الإفراط في التريسيسيزي الخلايا وعدم إجبار الخلايا علي فصل قبل الأوان.
7. أضف 8 مل من DMEM مع مصل العجل الجنيني بنسبه 10% و 1% من البنسلين والسستربتومايسين أو وسائل الاعلام الكاملة واجمع الخلايا عن طريق التنضيد. سوف المصل في وسائل الاعلام تحييد التريبسين.
8. تدور في 250 x g لمده 3 دقائق في درجه حرارة الغرفة. يستنشق العملاق.
9. أضافه 8 مل من وسائل الاعلام الطازجة كامله إلى أنبوب 15 مل التي تحتوي علي بيليه الخلية ، وماصه pipet-x الخلايا صعودا وهبوطا حتى يتم تفريق الخلايا في تعليق خليه واحده.
10. عد الخلايا باستخدام مقياس اللزوجة وتمييع إلى تركيز 5 × 10⁶ خلايا لكل مل في وسائل الاعلام الكاملة (dmem مع الفينول الأحمر/1 ٪ من 200 mM l-الانيل-الجلوتامين ديببتيد في 0.85 ٪ محلول كلوريد الصوديوم تكمله مع 10 ٪ الجنين الساق المصل و 1 ٪ البنسلين والستربتومايسين).
11. خذ 10 μL من تعليق الخلية MDA-ميغابايت-231 وإيداعه علي الغشاء. هذا يماثل إلى 50,000 خليه/10 μL ل MDA-MB-231. وينبغي ان تغطي قطره Si₃ن₄ غشاء جيدا ويمكن ان تنتشر قليلا علي اطار السيليكون. وينبغي الحرص علي عدم لمس الغشاء Si₃N₄ مع غيض من ميكروماص.
    ملاحظه: اعتمادا علي نوع خط الخلية والتجارب أو القياسات ، قد تختلف كثافة الخلايا ويجب اختبارها وفقا لذلك. هنا ، تم العثور علي كثافة الخلية المقترحة لبذر الغشاء Si₃N₄ الأمثل للظروف التجريبية ومزيد من التحليل الدقيق-xrf نانو--231 الخلايا MDA-MB-².
12. للخلايا العصبية هيبوكامبال (HN) ، وأزاله الانسجه الدماغ الحصين من اليوم الجنيني 18.5 الفئران وهضمه في 0.25 ٪ التربسين في hepes-hbss (5.3 mm kcl ، 0.44 mm KH₂po₄، 137.9 mm nacl ، 0.34 mm الجناح₂po₄، 5.56 mm الجلوكوز) في 37 درجه مئوية لمده 15 دقيقه^18،19.
13. باستخدام ماصه P1000 بطرف P1000 وطرف P200 ، قم باجراء التفكك الميكانيكي عن طريق رسم وتحرير محتوي المخروط مع الماصة عده مرات. خلال هذه الخطوة ، يجب الحرص علي عدم إنشاء فقاعات الهواء في الوسط ، لان فقاعات الهواء هي سامه للخلايا العصبية.
14. انتظر بضع دقائق حتى يستقر المجموع في الجزء السفلي من الأنبوب.
15. انقل الديدان التي تحتوي علي الخلايا المشتتة إلى أنبوب ابندورف معقم. ترك ~ 25 ميكرولتر من الثقافة المتوسطة التي تحتوي علي المجموع.
16. عد الخلايا المنفصلة باستخدام مقياس الكريات الدموية. يتم طلاء الخلايا العصبية HN معزولة في تركيز من 7 × 10⁴ خليه سم^-2 علي بولي-l-ليسين (1 ملغ/مل بولي-l-يسين)-المغلفة السيليكون نيرايد الغشاء.
17. فقط لاغشيه مع HN ، احتضان الخلايا العصبية في DMEM الاولي تستكمل مع 10 ٪ الجنين البقري المصل. ساعة واحده بعد الطلاء HN في dmem ، يتم تغيير المتوسطة إلى وسائل الاعلام الطلاء العصبي (200 mM l-الانيل-الجلوتامين ديببتيد في 0.85 ٪ محلول كلوريد الصوديوم ، و B27 الملحق د = 1/50 المخفف في neurobasal)^18،19.
18. للخلايا MDA-ميغابايت-231 ، وضع الغشاء يدعم في 37 درجه مئوية في الحاضنة (100 ٪ الرطوبة النسبية ، 95 ٪ الهواء و 5 ٪ CO₂) لمده 25 دقيقه. وهذا يسمح للخلايا لتسويه والبدء في نعلق علي الركيزة. ويمكن تكييف هذا الأمر اعتمادا علي خط الخلية المستخدم.
19. أضافه 1 مل من المتوسط الثقافة الكاملة المطلوبة (DMEM مع الفينول الأحمر/1 ٪ من 200 mM L-الانيل-جلوتامين ديببتيد في 0.85 ٪ محلول كلوريد الصوديوم تكمله مع 10 ٪ الجنين الساق المصل و1 ٪ البنسلين والسستربتومايسين) في كل بئر من الخلايا MDA-ميغابايت-231 عن طريق وضع غيض ماصه ضد جدار بئر من البلاستيك والإفراج عن المتوسطة ببطء شديد في حين انه يغطي الغشاء.
20. وضع الغشاء العمودي ضد جدار لوحه 4 جيدا من أجل ان تاخذ بعيدا اي فقاعات الهواء المحاصرين في تجويف بئر من Si₃N₄ الغشاء (الشكل 2). للقيام بذلك ، واستخدام ملاقط غرامه ودفع بعيدا فقاعه بلطف جدا ، وتتحرك موازيه للإطار Si₃N₄ المؤخر لتجنب لمس واتلاف الغشاء.
21. وضع الغشاء مره أخرى أفقيا في الجزء السفلي من البئر وترك 4 لوحه جيدا في الحاضنة للوقت المطلوب اعتمادا علي معدل النمو من خط الخلية المستخدمة. تم احتضان الخلايا MDA-ميغابايت-231 بين عشيه وضحيها.

3-العلاج أو التغير المتوسط

1. أزاله المتوسطة من 4 لوحه جيدا.
2. شطف مره واحده مع 1 مل من محلول تلفزيوني في 37 درجه مئوية. تخلص من الشريط التلفزيوني وأضف 1 مل من المتوسط الطازج الكامل في الوجود أو في الغياب (الضوابط) من العلاج المطلوب باستخدام طرف ماصه 1 مل ، والإفراج عن السائل ببطء شديد ضد جدار لوحه جيدا. يجب ان يتم غمر الغشاء Si₃N₄ ببطء دون اي إزعاج لتجنب الحركة الغشائية أو الرفع.

4. البرد--تجميد الاعداد الخلوية بواسطة يغرق--تجمد

ملاحظه: في نهاية وقت الحضانة المطلوب ، في وجود أو عدم وجود العلاج ، يجب شطف الخلايا بعناية وكريوفيكسيد. حوالي 30 دقيقه قبل البدء في شطف ولطخه اعداد الخلوية قبل يغرق-تجميد ، أول اعداد وتهدئه التلقائي اله يغرق الفريزر. كما يمكنك التلاعب كريوجينس ، والمطلوب استخدام القفازات المبردة المناسبة ، نظارات السلامة ، والاحذيه المغلقة ، ومعطف المختبر. ويجب نقل النيتروجين السائل في ديوارس المناسبة ، وينبغي ان يكون مكان العمل التهوية بما فيه الكفاية مع وجود رصد الأكسجين. ومن الناحية المثالية ، يساعد المستوي المنخفض لقياس الرطوبة من 20 − 30% علي الحد من تلوث الجليد بالمواد ، ديوارس ، والكريوجينس ، الأمر الذي يضر بالتزجيج للعينات (اي طبقه جليدية غير متبلورة). ومن الناحية المثالية ، واعتمادا علي مستوي خبره الباحث ، يمكن اعداد ما يصل إلى 10 − 12 عينه لجلسة واحده باستخدام نفس كاس الإيثان الثانوي السائل للتزجيج. بين الدورات ، ويغرق الفريزر التلقائي يتطلب 1 ح التلقائي الخبز الداخلي الاجراء. ومن الناحية المثالية ، ينبغي معالجه العينات بشروط حضانة متطابقة. ومع ذلك ، يمكن معالجه الضوابط أولا ، تليها العينات مع حاله علاج معينه.

ملاحظه: بالنسبة ليغرق-تجميد الخطوات التالية تطبيق كلا من MDA-ميغابايت-231 أو HN الخلايا.

1. قم باعداد الكريوبلونجير لكريوفيكسيشن السريع للخلايا.
   1. قم بتشغيل التجميد التلقائي.
   2. ادخل المعلمات (علي سبيل المثال ، درجه الحرارة ، والرطوبة في المئة ، ووقت التنقيط إذا تم استخدام التنقيط التلقائي ، وموقف لرفع العينة إلى سطح كريوجين لتسهيل نقل إلى حاويه المبردة) مباشره من وحده التحكم والمعلمات قائمه الإعدادات. في هذه الحالة ، تم تعيين المعلمات من غرفه الرطوبة إلى 37 درجه مئوية و 80 ٪ الرطوبة.
      ملاحظه: تم الحصول علي أفضل النتائج التزجيج لهذا البروتوكول والتصوير بالاشعه السينية مع دليل سريع ودقيق التنقيط. التالي ، لا يستخدم البروتوكول برنامج تسلسل التنقيط التلقائي.
   3. نعلق غرفه المرطب ومن أجل الحفاظ علي الرطوبة أولا تعبئته باستخدام حقنه مع 60 مل من الماء المقطر المزدوج ، ومن ثم 20 مل كما دعا علي وحده التحكم يغرق التجميد التلقائي.
      ملاحظه: تجنب استخدام الماء نقاء لأنه قد يضر نظام التبخير. إغلاق صمام وترك الأنابيب المرفقة علي المؤخر من المرطب.
   4. قم بتركيب كاس الإيثان الأسود في حاملها وغطيها بالاغطيه البلاستيكية.
   5. ملء ديوان الغرفة الباردة مع LN₂، وبذلك يصل إلى مستوي الشبكة داخل منطقه العمل.
   6. وضع صندوق تبريد مخصص لتخزين الاغشيه بعد كريوفيكسيشن في حاويه النقل المحتفظ بها في الموقع المخصص في منطقه العمل EM-GP القرب من حامل كاس الإيثان.
      ملاحظه: ومخصصه البرد مربع هو التنمية في المنزل في ID16A beamline نانوسبر من الإشعاع السنكروتروني الأوروبي في غرونوبل. تتوفر الرسومات مع المواصفات عند الطلب (الشكل 3). ويمكن تخزينها أربعه في وقت في أنبوب مخروطي 50 mL للتخزين علي المدى الطويل في ديوار LN2. وهناك امكانيه بديله في استخدام صغيره 0.2 mL العادية PCR أنبوب الجدار رقيقه مع قبعات قبة لتخزين واحد Si₃ن₄ غشاء الدعم. سوف تحتاج إلى حفر ثقب ~ 2 ملم في الجزء العلوي من أنبوب الجدار باستخدام ابره حقنه ساخنه من أجل السماح LN₂ لملء الأنبوب.
   7. أملا حاويه النقل مع LN₂ وغطيها بغطاء ألمنيوم المخصص. الاستمرار في ملء الغرفة الباردة مع LN₂ (عاده ~ 2 L مطلوب) حفظ في 100% الشاشة ln₂ مستوي عرض علي وحده التحكم. انتظر حتى يتم الوصول إلى درجه الحرارة النهائية المطلوبة.
   8. قم بازاله الغطاء البلاستيكي وغطي كاس الإيثان مع التسييل المتصل بزجاجه الإيثان. انتظر حتى درجه حرارة كاس الإيثان يتوازن إلى نقطه الحرارة. عند الوصول ، البدء في استخدام كريوجين الثانوية (اي ، الإيثان المسيل).
      ملاحظه: كانت المطالب المستخدمة-180 درجه مئوية ، قليلا فوق نقطه انصهار الإيثان (-182.8 درجه مئوية). أنت لست بحاجه إلى الدقة في تسييل الإيثان لأنه يمكن ان يكون مصدرا لتشكيل الصقيع والتلوث من كاس الإيثان.
   9. فتح الصمام الرئيسي زجاجه الإيثان عاليه النقاء وفتح ببطء شديد منظم الضغط حتى تحصل علي ضباب بطيء من الإيثان. حافظ علي هذا التدفق المنخفض جدا حتى يبني الإيثان السائل. ملء الكاس إلى الحافة العلوية. إغلاق منظم الضغط والصمام الرئيسي للزجاجة الإيثان. أزاله الاساله لأيكا بعناية وتركها جانبا علي دعم البوليسترين الصغيرة تحت غطاء محرك الدخان. الحفاظ علي منطقه العمل مغطاه فضفاضة مع غطاء البوليسترين الأسود المقدمة مع الجهاز لمنع تلوث الصقيع من منطقه العمل وحاويه الإيثان.
   10. فقط قبل التنقيط اليدوي من العينة ، وأزاله غطاء البوليسترين الأسود ومن القائمة من وحده الصحافة "غرفه السفلي" ، الذي يجمع الغرفة البيئية في اتصال مع منطقه العمل المبردة.
2. استعد لتلطيخ العينة.
   1. اعداد العازلة كافيه لأزاله اثار الأملاح من الوسط الثقافي. لهذا البروتوكول ، تم استخدام المخزن المؤقت خلات الأمونيوم لشطف الخلايا MDA-ميغابايت-231.
      ملاحظه: العازل خلات الأمونيوم مناسبه لمعظم أنواع الخلايا ، وانه لا يضيف إلى اشاره الفلورية الاشعه السينية (النظر في العناصر مع Z > 9). قد تتطلب بعض خطوط الخلايا الخاصة مثل الخلايا العصبية استخدام مخزن مؤقت مخصص. علي سبيل المثال ، للخلايا العصبية القشرية الاوليه ، حل ملحي يتكون من 1.8 حجم 0.5 M Na₂hpo₄ و 1.9 حجم 0.5 m الجناح₂PO₄ يمكن استخدام¹⁵. ومن ناحية أخرى ، فان الفوسفور أو الكلور الموجود في المخزن المؤقت سيساهم في طيف XRF. ويجب ان يوضع في الاعتبار هذا الحد من خطوط انبعاثات الاشعه السينية الزائفة اعتمادا علي عناصر الفائدة التي يتعين الكشف عنها.
   2. اعداد محلول خلات الأمونيوم 150 mM من محلول خلات الأمونيوم نقاء والتحقق من الحموضة (7.0 – 7.3) و الاسموليه (270 – 300 mosm/kg)
      ملاحظه: الاسموليه المذكورة أعلاه هو ما يعادل المالحة العازلة دولبيكو في الفوسفات (D-التلفزيونية) دون الكالسيوم والمغنيسيوم ويمكن التحقق باستخدام الصغرى-الاسموليه.
   3. أملا العدد المطلوب من الآبار من 12 صفيحه بلاستيكية جيدا مع العازل خلات الأمونيوم.
   4. قطع ربع ورقه فلتر لتنقيط ، اما من ورقه فلتر رقم 1 مع ثقب بريكوت ، أو من اللكم يدويا ورقه فلتر من قطرها 55 ملم مع ثقب مركزي 15 ملم.
   5. إخراج العينة المطلوبة المخزنة في الحاضنة في 37 درجه مئوية في اللحظة الاخيره قبل الشطف ويغرق-تجميد الغشاء.
   6. فتح ملاقط باستخدام عصابه المشبك الأسود من ملقط الإفراج السريع (وعاده ما يكون الطوق دومونت لقط عاليه الدقة ملاقط الطبية) والاستيلاء علي Si₃ن₄ غشاء دعم من الثقافة جيدا.
      ملاحظه: الاستيلاء علي منتصف اطار السيليكون ، والحفاظ علي غيض من ملاقط بالقرب من الغشاء. حرك المشبك الأسود الدائري وصولا إلى المشارب الاولي لقفل ملاقط.
   7. تزج الدعم الغشاء Si₃ن₄ عموديا في محلول العازلة خلات الأمونيوم ابقي في 37 درجه مئوية ل ~ 5 s.
      ملاحظه: يجب ان يظل الدعم العمودي في المخزن المؤقت. لاحظ ان حل المخزن المؤقت في كل بئر من لوحه يمكن استخدامها لمده تصل إلى ثلاثه اغشيه لنفس ظروف الحضانة.
   8. لطخه يدويا مع ورقه فلتر لاستنزاف العازلة الزائدة من محلول الشطف الغشاء (الشكل 4) من أجل ترك طبقه رقيقه ومتجانسة من محلول خلات الأمونيوم المائية التي تغطي الخلايا.
      ملاحظه: للقيام بذلك ، أولا اضغط علي المؤخر من النافذة علي ورقه فلتر لأزاله ما يقرب من كل العازلة المائية المتبقية في البئر والظهر من الغشاء. ثانيا ، لطخه الجانب الامامي ، بدءا من كلا الجانبين من ملاقط ، ثم كل جانب من الإطار (الشكل 4). لا تلمس الغشاء أبدا يمكن مراقبه فائض المخزن المؤقت المصفي مع aureole شكلت علي ورقه التصفية.
   9. فتح باب الغرفة البيئية وتحميل بسرعة ملاقط ، والانزلاق في التعشيق ملقط ، وإغلاق الباب (الشكل 5).
   10. اضغطعلي "لطخه/A يغرق". سيتم بسرعة سقطت ملاقط عقد Si₃ن₄ غشاء في cryogen.
   11. قم بازاله غطاء حاويه النقل بالملقط الذي تم الإفراج عنه.
   12. اضغط علي "نقل". سيتم نقل الغشاء Si₃N₄ قليلا فوق cryogen.
   13. في حركه واحده سريعة ، افصل ملاقط عن طريق تحريكها من التعشيق ملقط وأماله قليلا من التعشيق لجلب مباشره إلى فتحه فارغه من صندوق التبريد في حاويه نقل مليئه LN₂. حرر خاتم المشبك الأسود لتحرير الغشاء (الشكل 5).
       ملاحظه: يجب دائما تغطيه حاويه النقل مع LN₂. عند الحاجة لملء العبوه ، غطي كوب الإيثان بالغطاء البلاستيكي المزود بالماكينة لتجنب خلط LN₂ والإيثان.
   14. غطي حاويه النقل بغطاء واستخدم كوب البوليسترين ابيض صغير مليء ب LN₂ لنقله إلى صندوق البوليستيرين المليء ب ln₂.
       ملاحظه: يمكن بعد ذلك تخزين صندوق التبريد أو الأنبوب الذي يحتوي علي الاغشيه في أنابيب مخروطيه الشكل 50 مل مملوءة ب LN₂ ونقلها إلى تخزين طويل الأجل ln₂ dewar. قبل البدء في الغطس تجميد العينة القادمة ، والإحماء جميع ملاقط الباردة ومتجمد مع مجفف الشعر أو مجفف لوحه ساخنه/كريتوولس (45 درجه مئوية) لتجنب التلوث مع بلورات الثلج.

5. تجميد--تجفيف الخلايا يغرق--المجمدة المزروعة علي الاغشيه نيرايد السيليكون

ملاحظه: بالنسبة لتجفيف التجميد ، يتم تطبيق الخطوات التالية علي كل من MDA-ميغابايت-231 والخلايا HN. لتهدئه مجفف تجميد ، وسوف تحتاج إلى الانتظار حوالي 40 دقيقه إلى 1 ساعة.

1. اعداد مجفف التجميد
   1. قم بتبديل الطاقة باستخدام مفتاح الروك الموجود علي اللوحة الخلفية للاداه.
   2. أبدا في إدخال المعلمات التالية لقائمه LCD: الجزء 1 = 2 h عند-120 درجه مئوية ؛ الجزء 2 = 2 ح المنحدر من-120 درجه مئوية إلى-80 درجه مئوية ؛ الجزء 3 = 2 ح في-80 درجه مئوية ؛ الجزء 4 = 2 ح المنحدر من-80 درجه مئوية إلى 50 درجه مئوية ؛ الجزء 5 = 2 ح في-50 درجه مئوية ؛ الجزء 6 = 6 h المنحدر من-50 درجه مئوية إلى 30 درجه مئوية.
   3. في نهاية اعداد المعلمة ، احفظ الإعدادات ، اغلق غطاء الغرفة واضغط علي "START".
   4. سوف الوحدة ضخ وصولا إلى 1.10^-5 mbar. عند الوصول إلى هذا الضغط ، سيظهر سطر الأوامر للعرض "بدء التبريد الآن ، أبدا للمتابعة".
   5. ملء النيتروجين السائل ديوار بانتظام لتهدئه المرحلة تحت درجه الحرارة الثلاث نقطه الاعداد.
      ملاحظه: يتم تعيين درجه الحرارة نقطه الثلاثي المرحلة إلى-140 درجه مئوية. قبل تحميل العينة لهذا البروتوكول ، فمن الأفضل ان ننتظر حوالي 1 h ودرجه حرارة المرحلة-160 درجه مئوية.
   6. سوف تظهر الشاشة "اضغط علي المفتاحR" عند الاستعداد ل "تحميل العينة".
   7. تهدئه إلى درجه حرارة النيتروجين السائل داخل LN₂ شغل البوليسترين ديوار ، وصاحب عينه نقل المقدمة من قبل المورد ، واثنين اضافيه أسطواني النحاس Si₃ن₄ حاملي الغشاء.
   8. جبل Si₃ن₄ غشاء حامل النحاس الأصفر علي راس صاحب نقل عينه المقدمة من قبل المورد في ديوار البوليسترين (الشكل 6ا). الحفاظ علي مستوي LN₂ إلى حوالي 1 − 2 مم تحت الحافة العلوية من القطعة النحاسية الاولي.
   9. التقاط Si₃ن₄ غشاء دعم عينه من البرد مربع أو أنبوب PCR باستخدام الملقط الذاتي الإغلاق precooled في اينونوكس أو تفلون المغلفة.
   10. إيداع الغشاء مع الجانب عينه الخلايا التي تواجه حتى في تجويف النحاس مرقمه.
   11. تغطيه التجميع مع القطعة النحاسية الثانية كغطاء (الشكل 6ج).
       ملاحظه: قمنا بتصميم اثنين من الاقراص النحاسية كل منها سماكه 5 ملم ، وقطرها 50 ملم ، وثقب القطر 11 ملم المركزية. القرص النحاسي الأول لديه 14 تشكيله مستطيله (8 مم × 6 مم) المواقع لاستيعاب الدعم (5 مم × 5 مم). كل فتحه لديها شقه ومصقول جيدا مع عمق 2 ملم. القرص النحاسي الثاني هو مسطح لتغطيه Si₃N₄ غشاء دعم النحاس وبمثابه الضميمه فخ الباردة.
   12. Precool قضيب نقل في LN₂ معباه رغوة البوليسترين مربع واستخدامها لقفل في التجمع الكامل (الشكل 6د ، ه).
   13. اضغط علي "ENTER" علي اللوحة الاماميه من مجفف تجميد.
   14. وسوف تتوقف مضخات توربو والدوارة وتطهير الغرفة مع غاز النيتروجين الجاف للسماح فتح غطاء الغرفة.
   15. نقل علي الفور التجمع عينه نقل مع قضيب نقل الربيع محمله في غرفه مجفف تجميد ومقطع علي النحاس LN₂ المرحلة الباردة.
       ملاحظه: ترك التجميع الكامل مع قضيب نقل في الغرفة.
   16. اغلق علي الفور غطاء غرفه التجفيف بالتجميد واضغط علي "START" للمتابعة مع دوره التجميد.
   17. ملء خزان LN₂ من مجفف تجميد يدويا كل 2 ساعة.
       ملاحظه: قد يكون نظام التعبئة LN₂ التلقائي متصلا بهذا الخزان.
   18. في نهاية دوره التجفيف بالتجميد ، اضغط علي "STOP" لتنفيس الغرفة ، وقم بازاله التجميع الكامل للوصول إلى العينات المجففة بالتجميد.

النتائج

عرض مجهر الفيديو البصرية نموذجيه من الخلايا المجمدة الرطبة MDA-ميغابايت-231 التي كانت شبه مثقف علي بولي-L-يسين المغلفة Si₃ن₄ ويظهردعم غشاء في الشكل 7ا. تم الحصول علي الرؤية البصرية للعينه في غرفه فراغ في وضع التفكير باستخدام المجهر الفيديو مخصصه علي الإنترنت من ID16A beamline من ESRF²². في حين يتطلب الكترون أو الاشعه السينية الناعمة المجهرية طبقه الجليد تضمين الخلية لتكون رقيقه قدر الإمكان (عاده < 0.5 μm) ، والاشعه السينية الصلبة (> 10 كيلو) لديها ميزه عمق الاختراق اعلي بكثير وترسب الجرعة المنخفضة. سمك الجليد التالي يمكن ان تكون أكبر ، عاده < 10 μm بما في ذلك الخلية بحيث الجليد تضمين الخلية هو عدد قليل ميكرون في سمك. ويمكن تقدير هذا من خلال كثافة الاشعه السينية تقاس في انتقال مقارنه مع كثافة دون العينة ، مع الأخذ بعين الاعتبار امتصاص 500 nm سميكه Si₃N₄ غشاء. ويمكن تحقيق هذا السمك الجليدي من خلال دليل التنقيط علي النحو المبين في هذا البروتوكول. في المنطقة حلقات نيوتن ، سمك الجليد يمكن ان يكون حتى ارق (لا يقاس).

ويبين الشكل 7باء رسم الخرائط العنصرية بالاشعه السينية للخلية الرطبة المجمدة ، مع توزيع العناصر الفسيولوجية مثل البوتاسيوم (K) ، والكبريت (ق) ، والزنك (Zn). وتمثل هذه الخرائط الكتلة المساحية العنصرية (اي الكتلة المسقطة العنصرية). وفي حين ان هذه الخرائط لم يتم القيام بها في هذه الحالة ، فانه يمكن تطبيعها من خلال تصوير تباين المراحل القائم علي الانتشار بالاشعه السينية الذي يوفر تقدير العينة المتوقعة من الكتلة²³. كما ذكرت من قبل العديد من الدراسات ، ويفترض ان أيون شديد التشتت في الخلايا المحفوظة في دولتهم القريبة من السكان الأصليين ان تكون متجانسة توزيعها في جميع انحاء الخلية^23،24،16. وكما هو مبين في الصور العنصرية ثنائيه الابعاد بالاشعه السينية في الشكل 7ب، فان العنصر المنضم باحكام قد وزع بالتساوي داخل الخلية ، بالمثل إلى K ، ويمثل تقديرا جيدا للتشكيل الشامل الخلوي. وكان توزيع الزنك اشاره اعلي في النواة مما كانت عليه في عصارة وحددت بوضوح النواة. ويمكن الاشاره إلى ان المناطق الصغيرة المخصبة بالزنك يمكن الكشف عنها عند الاستبانة المكانية (50 نانومتر) في المنطقة النووية.

ان النانو الموجودة في الاشعه السينية أو تلك التي سيتم بناؤها لا تستوعب بالضرورة القدرات المبردة. في هذه الحالة ، فان أفضل بديل للحصول علي صور شعاعي الاشعه السينية من الخلايا في القرارات المكانية الفرعية 100 nm هو اجراء تجميد التجفيف المنصوص عليها في هذا البروتوكول بعد يغرق-تجميد الخلية. الشكل 8a يظهر نموذجي مشرق عرض المجهر الميداني من الناتجة تجميد المجفف الرئيسية الماوس هيبوكامبال الخلايا العصبية المزروعة مباشره علي الغشاء Si₃N₄ . في هذه الحالة ، إذا كانت مخزنه في غرفه المجففة نظيفه ، يمكن اعداد عينات 1 − 2 أسابيع مقدما وان يلاحظ مع المجهر البصري تستقيم العادية لتسجيل المناطق ذات الاهميه. وينبغي توخي الحذر لمنع التعرض للرطوبة المحيطة لأنه قد يتم الاستيلاء عليها بواسطة العينة المجففة بالتجميد وتؤدي إلى تلف تحت الاشعه السينية نانوبي. تم تطبيق هذا الاجراء بنجاح علي الخلايا الحساسة جدا (اي الخلايا العصبية) وتم الحصول علي نتائج أفضل مع أنواع أخرى أكثر قوه من الخلايا ، مثل الخلايا السرطانية. اما بالنسبة للخلايا المجمدة ، فان صور الاشعه السينية من K و S و Zn علي كامل عرض الخلية المجففة تشبه تلك المذكورة أعلاه. وهي تمثل التوزيعات العنصرية التي يمكن العثور عليها في أنواع مختلفه من الخلايا المجففة بالتجميد باستبانة مكانيه بدقه 50 − 100 نانومتر. في حين تجميد التجفيف الخلايا الكاملة هو بديل للحفاظ علي سلامه عنصري ، فمن علي حساب الحفاظ علي الكمال من الشكل الخلية¹⁶، وخاصه اغشيه الخلايا.

الشكل 1: نموذج الدعم النموذجي للاشعه السينية لتحليل النانو. دعم الغشاء Si₃N₄ في الكبسولة الواقية. ويمكن استخدام هذا النوع من الركيزة علي حد سواء لتحليل درجه حرارة الغرفة (يغرق تجميد اعداد الخلوية تليها درجه حرارة منخفضه وانخفاض فراغ تجميد التجفيف عمليه) أو لتحليل المبردة الاشعه السينية الفلورية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: عرض تخطيطي للنوافذ نيرايد السيليكون بعد بذر الخلية. يتم استزراع الخلايا مباشره علي السطح المسطح بولي-L-ليسين المغلفة لدعم الغشاء Si₃N₄ . في بعض الأحيان يمكن ان تكون المحاصرين فقاعات الهواء في تجويف المؤخر لدعم الغشاء Si₃ن₄ ويجب ازالتها كما هو موضح في البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: في المنزل وضعت 3D المطبوعة البرد مربع للتخزين علي المدى الطويل من يغرق المجمدة Si₃N₄ غشاء يدعم في ديوار النيتروجين السائل. (ا) صندوق التبريد المفكك مع الحاوية والاغطيه (الجزء السفلي) و (ب) صندوق التبريد المجمع مع قبعات مقفله. يمكن التلاعب القبعات مع ملاقط ، فتح أو قفل بالتناوب. تتوفر خطه مفصله للطباعة ثلاثية الابعاد عند الطلب من ESRF ID16A. وقد تم تصميم لاستيعاب شبكات السيليكون نيتريد TEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التنقيط من الخلايا المستزرعة علي Si₃N_4. قبل يغرق-تجميد الخلية أحاديه الطبقة المستزرعة علي الغشاء Si₃N₄ يحتاج إلى شطف في محلول خلات الأمونيوم (ا) وبعناية يدويا باستخدام ورقه فلتر (ب). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التلقائي يغرق تجميد الام-GP الجهاز. (ا) يغرق الفريزر التلقائي. (ب) الغرفة البيئية مع ملاقط مقفله في. (ج) كوب الإيثان المغطي بالتسييل لأيكا المتصل بزجاجه الإيثان. (د) الضميمه المبردة التي تظهر الكوب الأسود الكامل من الإيثان المسال وصندوق التبريد لمزيد من التخزين في LN₂ من الاغشيه Si₃N₄ اللاذعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: عينه كريوترانسفير تجميع لاجراء تجميد التجفيف. (ا) المتلقي النحاس الأول ل Si₃N₄ الاغشيه هي التي شنت علي راس العينة حامل النقل المقدمة من قبل المورد تجميد مجفف. (ب) و (ج) تبين ان القرص النحاسي المسطح الثاني يستخدم كغطاء ويعمل كالضميمه الباردة لادراجها في الضميمه فراغ من مجفف تجميد. (د) التجميع الكامل مع قضيب النقل المحمل بالزنبرك. (ه) يجب أضافه حامل العينة الذي يحمل الاعداد الخلوي اللاذع المزروع علي غشاء Si₃N₄ في مجفف التجميد المبرد LN₂. يتم اجراء كافة الخطوات لتركيب التجميع في LN₂ في مربع الستايروفوم. للتوضيح ، تم إنتاج جميع الصور في غياب LN₂. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: صور فلورية بالاشعه السينية لخليه رطبه مجمده باستخدام القرص الصلب للاشعه السينية النانويه. (ا) العرض النموذجي علي الإنترنت في وضع الانعكاس باستخدام مجهر الفيديو البصري المخصص ل ESRF ID16A beamline. بعد التنقيط اليدوي ، تم تحقيق سماكه الجليد الاجماليه من حوالي 5 − 10 ميكرومتر التي تسمح برؤية واضحة للخلايا الرطبة المجمدة. منطقه مع نيوتن حلق دلاله من حتى كثير ارق جليد ملحوظة. (ب) التوزيعات الخلوية بالاشعه السينية التمثيلية للعناصر الفسيولوجية البوتاسيوم (K) ، والكبريت (ق) ، والزنك (Zn). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: صور الاشعه السينية للخلايا العصبية المجففة بالتجميد باستخدام القرص الصلب للاشعه السينية النانويه. (ا) عرض المجهر الميداني الساطع النموذجي للخلايا العصبية القشرية الاوليه الناتجة عن التجميد التي تم استزراعها مباشره علي الغشاء Si₃N₄ . شريط مقياس = 200 μm (ب) درجه حرارة الغرفة التمثيلية الصور الشعاعية الاشعه السينية من الخلايا العصبية هيبوكامبال المجففة واحده تظهر توزيعات العناصر الفسيولوجية البوتاسيوم (K) ، والكبريت (ق) ، والزنك (Zn). شريط مقياس = 2 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

[برد-الكترون] مجهريه ([برد-م]) يربح ال 2017 [نوبل بريز] في كيمياء وبما ان مثل هذا التطوير يجعل ب [ج.]. [دوبوشت] علي تزجيج من ماده احيائيه ل ال [هيغ-ديكايشن] بنيه تحديد الجزيئات احيائيه في حل²⁵. وكما ذكر دوبوشيت في محاضرته التي ألقاها بجائزه نوبل "ان معرفه كيفيه القيام بالتزجيج لقطره من الماء شيء واحد ، فان اعداد عينه بيولوجية للمراقبة البيولوجية هو آخر"²⁵. وتعتبر الآن خطوات التعويض عن البرد التقنية القياسية للتخفيف من الضرر الناجم عن الجرعة الاشعاعيه ودراسة الخلايا القريبة من حالتها الاصليه. غير ان الاعداد لا يزال مملا. وذلك لان المجهر الكتروني ، نظرا لدقته المكانية غير المسبوقة ، حساس لأي قطعه أثريه بنيوية تحدث اثناء اعداد العينة. وتقترب الآن المجسات المتزامنة من الصعوبات المماثلة التي تنخفض إلى القرارات المكانية بحيث تصل إلى 13 نانومتر في نطاق الاشعه السينية العالية الطاقة²⁶. من الصعب الاشعه السينية المجهر يمكن تحليل الخلايا بأكملها في حين يعاني المجهر الكترون من عمق تغلغل الفقراء من الكترونات تمكين فقط شرائح رقيقه جدا الخلية التي يمكن ملاحظتها.

أحاديه الخلايا هي رقيقه بما يكفي بحيث يغرق-تجميد في الإيثان السائل ، يتم تحقيق معدلات التبريد المطلوبة لتزجيج المياه. من الناحية النظرية ، معدلات التبريد عاليه مثل 10⁸ ك/س ممكنة باستخدام الضغط العالي التجميد²⁷ الذي يسمح التزجيج من العينات سميكه جدا ليغرق تجميد. يتم الوصول إلى معدل تبريد 10⁵ ك/ثانيه ، المطلوبة للسماح بالتزجيج الكامل للعينه في الضغط المحيط²⁸، التكرار باستخدام التلقائي يغرق-تجميد اله والمعلمات المعروضة هنا. وهذا يسمح للباحث بان يرمم العينات البيولوجية الرقيقة (< 10 ميكرومتر) مثل الطبقة الاحاديه من الخلايا^{12،13،14،15،29،30} بالتجميد في الإيثان السائل.

ومن التحديات الهامه مع هذا البروتوكول هو أيضا الحفاظ علي قدر الإمكان السلامة الكيميائية للمحتوي داخل الخلايا لتوفير توزيعات عنصري موثوق بها في الخلية في 2D أو 3D. كما نشرت في مكان آخر^{2،16،17،31}، في حاله التصوير العنصري علي المستوي تحت الخلوي ، ينبغي النظر في تحليل الخلايا الرطبة المجمدة. والا ، يمكن استخدام مزيج من يغرق-تجميد وتجميد تجفيف الخلايا لتحليل درجه حرارة الغرفة. بالنسبة لهذا الأخير ، يتم أزاله الجليد غير متبلور من خلال عمليه التسامي ، في حين يتم أزاله جزيئات الماء المنضم من خلال عمليه الامتصاص. قد تكون هذه العملية بعيده عن المثالية مقارنه بالعينات الرطبة المجمدة بسبب التغير المحتمل في الاغشيه الخلوية وشكل بعض الهياكل الخلوية³². أيضا ، بالنسبة للدراسات المحددة ، قد يؤدي استخراج المياه إلى قطع أثريه معدنيه. ومع ذلك ، فقد كان ناجحا وأفضل بديل لعينات رطبه المجمدة للتصوير عنصري في المستويات الفرعية 100 nm^{2،16،17،18،20،33،34،35،36}.

كما تم الإبلاغ عن³⁷، ويمكن تقييم نوعيه الاستعدادات الخلوية بالتبريد من خلال نسبه K/Na البوتاسيوم إلى الصوديوم. لسوء الحظ ، فانه لا يمكن حتى الآن ان تحدد مع الصلبة الاشعه السينية نانوسبر المستخدمة هنا ، وذلك بسبب انخفاض الطاقة المنخفضة للكشف عن الانجراف السيليكون المستخدمة للكشف عن الفوتونات الاشعه السينية من العناصر (E ≥ 1.3 كيلو المغنيسيوم). في الواقع ، نسبه عاليه K/Na (> 10) التي يمكن قياسها باستخدام توف-سيمز ، epma ، أو ميكروسبر النووية pixe^16،37 هو مؤشر علي سلامه المواد الكيميائية المحفوظة للخلية مقارنه بالمتوقع ك/نا من 25 في خليه حيه³⁷. ويمكن دعم ذلك بنسبه منخفضه من Cl/K المصاحبة³⁸. ومع ذلك ، فان التزجيج الناقص ، خاصه إذا كانت سرعه تبريد العينة منخفضه جدا ، يمكن ان تؤدي إلى تشكيل بلورات جليدية كبيره يمكن ان تتلف اغشيه الخلايا والأرغن ، التالي تغيير توزيع العناصر الكيميائية. علي الرغم من انه لا يوجد اجراء روتيني لمراقبه هذا الضرر المحتمل والتاثير علي التوزيع داخل الخلايا ، فان نسب العنصري المذكورة أعلاه وامكانيه تصوير الخلية بدقه عاليه باستخدام الاشعه السينية المتباينة أو المجهرية السينية بالاشعه السينية يمكن ان تكون أفضل الطرق لدعم الحفاظ علي سلامه المقصورات الجمع بين هذه التقنيات واستخدام المجاهر البصرية كريوكوريلاتيفي مضان المتقدمة حديثا سوف تساعد علي تقييم إلى اي مدي يحدث هذا الضرر ويؤثر علي توزيع عنصري داخل الخلايا.

وعموما ، يتم تقديم بروتوكول مفصل وشامل لاعداد عينات الخلوية لتحليل الاشعه السينية الشعاعية السنكروتروني. وهو نقطه انطلاق جيده للمجتمع البحثي ، مما يساعد علي حل القضية الصعبة لكيفيه اعداد عينات الخلوية المناسبة ل 2D و 3D التصوير العنصري في (البرد) الصلبة الاشعه السينية النانو. ويمكن دمج هذه النهج مع القدرات الضوئية البصرية والمجهرية الكترونيه للتصوير الكيميائي النسبي العميق والتصوير الهيكلي للخلايا.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O	SIGMA	09691-250mL	One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.
B27 supplement, 50x	Life Technologies, Invitrogen	17504-044	for hippocampal neuron culture
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)	GIBCO	14190-094	cell culture
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)	GIBCO	21885025	cell culture
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies, Invitrogen	31966-02	for hippocampal neuron culture
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology	World Precision Instrument	501202
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer	Quorum Technology	EK3147
Ethane N45	Air Liquid	p0505s05r0a001	C2H6 > 99,995 %
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin	GIBCO	A31604-02	cell culture
HBSS 10x	Life Technologies, Invitrogen	14185-052	for hippocampal neuron culture
Leica GP quick-release forceps	Leica	16706435
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell	ATCC	ATCC HTB-26	cell culture
Neurobasal medium	Life Technologies, Invitrogen	21103-049	for hippocampal neuron culture
Nunc 4-Well Plate	Thermo Fisher	176740	cell culture
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer	Advanced Instruments	Osmo1	Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer)
Penicillin-Streptomycin	SIGMA	P4333	cell culture
poly-L-lysine	SIGMA	P4707	Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit	Leica	16706401	Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.
Silicon nitride membrane (Si3N4)	Silson Ltd.	SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl	The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...
Trypan blue solution 0.4%	GIBCO	15250061	cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	GIBCO	25300-054	cell culture
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water	Fisher Chemicals	W9-1	MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.
Whatman No. 1 filter paper with precut hole	Leica	16706440	Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.