Cultura celular em membranas de nitreto de silício e criopreparação para a fluorescência de raios-X synchrotron Nano-análise

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para a cultura celular em membranas de nitreto de silício e congelamento de mergulho antes da imagem de fluorescência de raios-X com uma nanossonda de raios-X criogênico síncrotron. Quando apenas a temperatura ambiente nano-análise é fornecida, as amostras congeladas podem ser mais liofilizadas. Estes são passos críticos para obter informações sobre a composição elementar intracelular.

Resumo

Muito pouco se sabe sobre a distribuição de íons metálicos no nível subcelular. No entanto, esses elementos químicos têm funções regulatórias essenciais e sua homeostase perturbada está envolvida em várias doenças. Nanoprobes fluorescência de raios-X síncrotron síncrotron síncrotron de última geração fornecem a sensibilidade necessária e a resolução espacial para elucidar a distribuição e concentração bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D) de metais dentro de células inteiras nível organela. Isso abre novos campos científicos emocionantes de investigação sobre o papel dos metais na fisiopatologia da célula. A preparação celular é um procedimento fundamental e muitas vezes complexo, particularmente para análise básica. Embora as técnicas de fluorescência de raios-X sejam agora generalizadas e vários métodos de preparação tenham sido usados, muito poucos estudos investigaram a preservação do conteúdo elementar das células na melhor das hipóteses, e nenhum protocolo detalhado em termos intatermos para a criopreparação de células aderentes para nanossondas de fluorescência de raios-X foram liberadas até agora. Esta é uma descrição de um protocolo que fornece a preparação celular stepwise para a criofixação rápida para permitir a fluorescência do raio X do síncrotron nano-análise das pilhas em um estado hidratado congelado quando um ambiente e uma transferência criogenic estão disponíveis. Caso a nano-análise tenha que ser executada na temperatura ambiente, um procedimento adicional para congelar-secar a preparação celular adepto criofixada é fornecido. Os protocolos propostos têm sido utilizados com sucesso em trabalhos anteriores, mais recentemente no estudo da distribuição intracelular 2D e 3D de um composto organometálico em células de câncer de mama.

Introdução

As nanosprobes recentemente projetadas da fluorescência do raio X do síncrotron (SR-XRF) permitem a visualização da distribuição subcelular dos elementos em uma maneira inteiramente quantitativa. Como exemplo, essa capacidade analítica permite a investigação da captação de nanopartículas¹ ou moléculas organometálicas, como complexos à base de ópio^2,fornecendo informações sobre a captação intracelular de moléculas à base de metais com potentes propriedades anticanceríons. Como uma técnica multielement, SR-XRF³ com um nanoprobe fornece uma maneira de quantificar simultaneamente e localizar intracellularly os elementos os mais biologicamente importantes, incluindo o fósforo, o enxofre, o potássio, o cálcio, o ferro, o cobre, e o zinco. Na verdade, o uso de raios-X rígidos fornece grande profundidade de penetração para a imagem de células totalmente hidratadas de forma livre de rótulos. Além disso, fornecendo acesso ao K-edge da maioria dos elementos de interesse, a fluorescência de raios-X é animado de forma mais eficiente. O uso de abordagens criogênicas permite a redução dos danos causados pela radiação e otimização da preservação da estrutura celular e distribuição elementar.

A maioria das técnicas analíticas resolvidas espacialmente disponíveis para estudar metais nas células são técnicas de superfície que exigem seções muito finas e planas de células a serem produzidas. Isso abrange principalmente a microscopia eletrônica de transmissão de varredura com análise de raios-X dispersivo de energia (STEM-EDX), microscopia eletrônica de transmissão filtrada de energia (EF-TEM) e espectrometria de massa de íons secundários em nanoescala (nanoSIMS). Este último não pode ser realizado em seções de células congeladas e hidratadas, enquanto a crio-análise pode ser feita com microscopia eletrônica com resolução espacial insuperável, mas má sensibilidade elementar. A emissão de raios-X induzida por partículas (PIXE) permitiu o estudo das distribuições elementares em células inteiras. Ele tem a vantagem de ser totalmente quantitativo com uma sensibilidade elementar justa na escala de mícrons e até mesmo na resolução submicron^4,mas sofre de danos causados por radiação e falta de capacidades criogênicas para estudar células hidratadas congeladas. Todas essas técnicas analíticas se complementam na imagem elementar das células, mas para todas as técnicas o procedimento de preparação da amostra é um passo crucial. Deve ser mantido simples limitar a contaminação possível assim como a redistribuição elementar e/ou o escapamento para obter resultados significativos. Como demonstrado na microscopia eletrônica, um fluxo de trabalho criogênico, incluindo crio-imobilização da célula e criotransferência para uma fase de crioscada,permite uma preservação elementar ideal em níveis subcelulares o mais próximo possível do estado nativo^5,6,7,8,9,10. Esse entendimento foi implementado com sucesso no desenvolvimento da microscopia de raios X crio-soft síncrotron (por exemplo, microscópios de campo completo e microscópios de varredura) para produzir imagens ultra-estruturais de células totalmente hidratadas em 2D ou 3D. Vários fluxos de trabalho criogênicos foram desenvolvidos¹¹ para microscópios de raios-X macios em Beamline 2.1 (XM-2) da Fonte de Luz Avançada no Lawrence Berkeley National Laboratory¹², linha de luz U41-XM no anel de armazenamento de elétrons BESSY II (Alemanha)¹³, beamline MISTRAL da fonte de luz ALBA (Espanha)¹⁴, e no Beamline B24 da fonte de luz Diamond¹⁵, entre outros. Um fluxo de trabalho semelhante foi recentemente mostrado como o método de preparação e preservação mais confiável para análise elementar intracelular usando microssondas de raios-X^16,17.

Embora as técnicas de nanosonda de raios-X estejam começando a ser amplamente utilizadas para análise elementar celular, particularmente com o advento das capacidades criogênicas do SR-XRF, nenhum protocolo passo a passo foi divulgado até agora para a comunidade de pesquisa. Aqui, um procedimento detalhado é fornecido para preparar células aderentes criofixadas cultivadas como monocamadas nas membranas de nitreto de silício a serem analisadas condições criogênicas. Uma etapa da liofilização a ser aplicada após o protocolo caso que a análise do raio X deve ser executada na temperatura ambiente é fornecida igualmente. Enquanto o protocolo proposto tem sido usado com sucesso com células de câncer de mama humana MD-MB-231² e o congelamento de secagem foi demonstrado entre outros em neurônios do rato^18,20,21, pode ser facilmente estendido para vários tipos de células humanas ou animais.

Protocolo

Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo comitê de cuidados com animais da Divisão de Ciências da Vida (CETEA, A14-006) do CEA. Foram conduzidos em conformidade com a legislação francesa e com a Diretiva do Conselho Comunitário Europeu de 24 de Novembro de 1986 (86/609/CEE).

1. Nitreto de silício (Si₃N₄) preparação de suporte de membrana

NOTA: Porque a membrana é frágil e delicada, seu apoio (200 μm quadro de silício grosso) tem que ser tratado com cuidado, idealmente com uma pinça de carbono fina ou pinças Dumont #5, Straight Self-closing dicas finas. Este protocolo utilizou membranas de nitreto de silício com um quadro de 5 mm x 5 mm e um tamanho de membrana de 1,5 mm x 1,5 mm. A membrana deve ser preparada aproximadamente 12 h antes de iniciar o experimento (ou seja, semeadura celular). As membranas podem ser preparadas no final do dia e deixadas secando durante a noite um capô de fluxo laminar classe II para que eles estejam prontos para usar na manhã seguinte. Uma espessura do quadro do silicone de 200 μm é padrão para a maioria de companhias que vendem janelas do nitreto do silicone. Se o produto utilizado neste protocolo não estiver disponível, um tamanho de membrana na faixa de 0,5 a 1,5 mm pode ser usado com um tamanho de quadro padrão de 5 mm x 5 mm. O tamanho maior da membrana é preferido quando a tomografia de raios-X será usada. As janelas do nitreto do tipo da grade DE TEM com um tamanho da membrana de 0.5 milímetros e uma espessura de 50 nm podem igualmente ser usadas.

1. Abra a cápsula contendo o suporte de membrana Si₃N₄ (Figura 1). Esprema delicadamente a cápsula a fim afrouxar levemente a sustentação.
2. Segure um dos cantos do quadro de silício usando a pinça fina. Tenha cuidado para não tocar a membrana Si₃N₄ no centro. A membrana grossa de 200 ou 500 nm pode ser danificada facilmente.
3. Usando as pinças finas, coloque suavemente o suporte de membrana Si₃N₄ em uma placa de Petri de vidro estéril, superfície plana da janela de nitreto de silício voltada para cima (ou seja, a cavidade voltada para o fundo do prato).
4. Retire a tampa da placa de Petri e deixe as membranas luz UV por 25 a 30 min o armário de fluxo laminar.
   NOTA: A luz UVC (254 nm) é tipicamente fixada em 200 μW/cm².
5. Coloque 10 μL de poli-L-lisina na membrana. A queda deve cobrir o Si₃N₄ membrana bem e pode se espalhar um pouco sobre o quadro de silício. Deixe-o a 37 °C por 25 min na incubadora de cultura de tecido padrão a 100% umidade relativa e 95% de ar, 5% CO₂.
   NOTA: Neste caso, um revestimento de poli-l-lisina foi usado para as células de câncer de mama MDA-MB-231. Dependendo do tipo de linha celular, vários revestimentos podem ser usados, e esta etapa deve ser otimizada em conformidade.
6. Em uma placa estéril de 48 poços, preencha diferentes poços com 200 a 250 μL de água ultra-pura e ultra-trace filtrada através de um filtro estéril de 0,22 μm. Normalmente, cada poço pode ser usado para enxaguar até 2-3 membranas. Usando pinças finas, pegue o suporte de membrana em um canto de seu quadro de silício. Lave a membrana suavemente submergindo-a verticalmente 10 s em três poços sucessivos.
   NOTA: Os suportes da membrana são retirados da incubadora e podem ser processados à temperatura ambiente, com a temperatura e a umidade definidas por uma capa de fluxo laminar classe II.
7. Coloque a membrana de suporte verticalmente em um poço vazio de uma placa estéril de 96 poços, cubra-a e deixe secar durante a noite uma capa de fluxo laminar classe II.

2. Semeadura celular

1. Em uma placa estéril de 4 poços, coloque as membranas com seu lado plano voltadopara cima.
2. As células MDA-MB-231 são mantidas em uma cultura monocamada no DMEM com fenol vermelho/glutamamax I, complementadas com 10% de soro de vitela fetal e 1% penicilina e estreptomicina a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% DE CO_2.
3. Quando as células atingem 60-70% de confluência remover a mídia do prato ou frasco.
4. Lave 1x com 10 ml de soro soro para os soro de soro de fosfato dulbecco soro sem Ca²⁺ ou Mg^2+.
5. Adicione 3 mL/T75 frasco de 0,05% de solução de tripsina/EDTA e certifique-se de que toda a monocamada seja coberta com a solução de tripsina.
6. Incubar por 3-5 min a 37 °C até que as células começam a se separar. Deve ser tomado cuidado para não sobre-trypsinize as células e não forçar as células a separar prematuramente.
7. Adicione 8 ml de DMEM complementado com 10% de soro de vitela fetal e 1% de penicilina e estreptomicina ou mídia completa e coletar as células por pipetting. O soro na mídia neutralizará a trippsina.
8. Desça a 250 x g por 3 min à temperatura ambiente. Aspirar o supernatant.
9. Adicione 8 ml de mídia completa fresca para o tubo de 15 ml contendo a pelota celular, e pipet as células para cima e para baixo até que as células são dispersas em uma única suspensão celular.
10. Conte as células usando um hemocytometer e diluir a uma concentração de 5 x 10⁶ células por mL em mídia completa (DMEM com Fenol Red/1% de um dipeptídeo de 200 mM L-alanyl-L-glutamina em 0,85% solução NaCl complementada com 10% de soro de vitela fetal e 1% penicilina e estreptomicina).
11. Tome 10 μL da suspensão celular MDA-MB-231 e deposite-a na membrana. Isso corresponde a 50.000 células/10 μL para MDA-MB-231. A queda deve cobrir o Si₃N₄ membrana bem e pode se espalhar um pouco sobre o quadro de silício. Deve-se tomar cuidado para não tocar na membrana Si₃N₄ com a ponta da micropipette.
    NOTA: Dependendo do tipo de linha celular e experimentos ou medições, a densidade celular pode variar e deve ser testada em conformidade. Aqui, a densidade celular proposta para semeadura da membrana Si₃N₄ foi encontrada ideal para as condições experimentais e mais nano-análise sr-XRF das células MDA-MB-231².
12. Para os neurônios hipocampais (HN), retire o tecido cerebral hipocampo do dia embrionário 18,5 ratos e digeri-lo em 0,25% de trippsina em Hepes-HBSS (5,3 mM KCl, 0,44 mM KH₂PO₄, 137,9 mM NaCl, 0,34 mM NaH₂PO₄, 5,56 mM glicose) em 37 °C para 15 min^18,19.
13. Usando uma pipeta P1000 com uma ponta P1000 e uma ponta P200, execute a dissociação mecânica desenhando e liberando o conteúdo do cone com a pipeta várias vezes. Durante esta etapa, tome cuidado para não criar bolhas de ar no meio, porque as bolhas de ar são tóxicas para os neurônios.
14. Espere alguns minutos até que o agregado se instale na parte inferior do tubo.
15. Transfira o supernatant contendo as células dispersas para um tubo estéril de Eppendorf. Deixe ~ 25 μl de meio de cultura contendo o agregado.
16. Conte as células dissociadas usando um hemocytometer. Neurônios HN isolados são banhados a uma concentração de 7 x 10⁴ células cm^-2 na membrana de nitreto de silício revestida de poli-L-Ll (1 mg/mL poli-L-lisina) revestida de silicone.
17. Somente para membranas com HN, incubam os neurônios no primeiro DMEM suplementado com o soro bovino fetal de 10%. Um h após o revestimento de HN em DMEM, o meio é alterado para mídia de revestimento neurobasal (200 mM L-alanyl-L-glutamina dipeptídeo em 0,85% solução NaCl, e B27 suplemento d = 1/50 diluído em Neurobasal)^18,19.
18. Para as células MDA-MB-231, coloque a membrana suporta em 37 °C na incubadora (100% umidade relativa, 95% de ar e 5% CO₂₎para 25 min. Isso permite que as células se instalem e comecem a se ligar ao substrato. Isso pode ser adaptado dependendo da linha celular usada.
19. Adicionar 1 mL do meio de cultura completa necessária (DMEM com Fenol Red/1% de um dipeptídeo de 200 mM L-alanyl-L-glutamina em 0,85% solução NaCl complementada com 10% de panturrilha fetal soro e 1% penicilina e estreptomicina) em cada poço das células MDA-MB-231, colocando a ponta da pipeta contra a parede do poço de plástico e liberando o meio muito lentamente, enquanto ele cobre a membrana.
20. Coloque a membrana vertical contra a parede da placa de 4 poços, a fim de tirar todas as bolhas de ar preso na cavidade bem da membrana Si₃N₄ (Figura 2). Para fazer isso, use pinças finas e afaste a bolha com muito cuidado, movendo-se paralelamente ao quadro traseiro Si₃N₄ para evitar tocar e danificar a membrana.
21. Coloque a membrana de volta horizontalmente na parte inferior do poço e deixe a placa de 4 poços na incubadora para o tempo necessário, dependendo da taxa de crescimento da linha celular usada. As células MDA-MB-231 foram incubadas durante a noite.

3. Tratamento ou alteração média

1. Retire o meio da placa de 4 poços.
2. Enxágüe uma vez com 1 mL de solução PBS a 37 °C. Descarte o PBS e adicione 1 mL de médio fresco completo aquecido na presença ou na ausência (controles) do tratamento desejado usando uma ponta de pipeta de 1 mL, liberando o líquido muito lentamente contra a parede da placa de poço. A membrana Si₃N₄ deve ser lentamente submersa sem quaisquer distúrbios para evitar o movimento ou elevação da membrana.

4. Crio-imobilização da preparação celular por mergulho-congelamento

NOTA: Ao final do tempo de incubação necessário, na presença ou ausência de tratamento, as células têm de ser cuidadosamente lavadas e criofixadas. Cerca de 30 min antes de começar a enxaguar e borrar a preparação celular antes do congelamento de mergulho, primeiro set-up e esfriar a máquina de freezer de mergulho automático. Ao manipular criogênios, o uso de luvas criogênicas apropriadas, óculos de segurança, sapatos fechados e um casaco de laboratório são necessários. O nitrogênio líquido deve ser transportado em Dewars apropriado, e o local de funcionamento deve suficientemente ser ventilado com a presença de um monitor do oxigênio. Idealmente, um baixo nível de higrometria de 20 a 30% ajuda a limitar a contaminação do gelo dos materiais, Dewars e criogênios, que é prejudicial para a vitrificação das amostras (ou seja, uma camada de gelo amorfa). Idealmente, dependendo do nível de experiência do pesquisador, até 10 a 12 amostras para uma única sessão podem ser preparadas usando o mesmo copo de etano líquido criogênico secundário para vitrificação. Entre as sessões, o congelador automático de mergulho requer um procedimento automático de 1 h de bake-out. Idealmente, as amostras devem ser processadas com condições idênticas da incubação. Ainda assim, os controles podem ser processados primeiro, seguidos pelas amostras com uma determinada condição de tratamento.

NOTA: Para mergulhar-congelamento as seguintes etapas aplicam-se tanto para células MDA-MB-231 ou HN.

1. Configure o crioplunger para criofixação rápida das células.
   1. Ligue o congelador automático de mergulho.
   2. Digite os parâmetros (por exemplo, temperatura, umidade percentual, tempo de apagamento se a borração automática é usada, e posição para levantar a amostra para a superfície do criogênio para facilitar a transferência para um recipiente criogênico) diretamente do console e parâmetros menu de configurações. No presente caso, os parâmetros da câmara de umidade foram fixados em 37 °C e 80% de umidade.
      NOTA: Melhores resultados de vitrificação foram obtidos para este protocolo e imagens de raios-X com borrão manual rápido e cuidadoso. Assim, o protocolo não usa um programa automático de seqüência de borrão.
   3. Anexar a câmara umidificante e, a fim de preservar a umidade primeiro preenchê-lo usando uma seringa com 60 mL de água de destiladas duplas, e depois 20 mL como solicitado no console congelador de mergulho automático.
      NOTA: Evite usar água ultrapura porque pode danificar o sistema de vaporizador. Feche a válvula e deixe a tubulação unida na parte traseira do umidificador.
   4. Instale o copo preto do etano em seu suporte e cubra-o com os tampões plásticos.
   5. Encha o Dewar da câmara fria com LN_2,trazendo-o para o nível da rede dentro da área de trabalho.
   6. Coloque uma crio-caixa dedicada para armazenar as membranas após a criofixação no recipiente de transferência realizada no local dedicado na área de trabalho EM-GP e perto do suporte do copo de etano.
      NOTA: A crio-caixa dedicada é um desenvolvimento interno na linha de feixe id16A nanosonda da radiação síncrotron europeia em Grenoble. Desenhos com especificações estão disponíveis mediante solicitação(Figura 3). Eles podem ser armazenados quatro de cada vez em um tubo cônico de 50 mL para armazenamento a longo prazo em um LN2 Dewar. Uma possibilidade alternativa consiste em usar um pequeno tubo de parede fino PCR regular de 0,2 mL com tampas de cúpula para armazenar um único suporte de membrana Si₃N_4. Você precisará perfurar um buraco de ~ 2 mm na parte superior do tubo de parede usando uma agulha de seringa aquecida, a fim de permitir que o LN₂ para encher o tubo.
   7. Encha o recipiente de transferência com LN₂ e cubra-o com a tampa de alumínio dedicada. Continue a encher a câmara fria com LN₂ (normalmente ~ 2 L é necessário) mantendo em 100% o ln₂ monitor de nível de exibição no console. Espere até que a temperatura final necessária seja atingida.
   8. Retire a tampa de plástico e cubra o copo de etano com o liquefier conectado à garrafa de etano. Espere até que a temperatura do copo de etano equilibre-se ao setpoint da temperatura. Quando alcançado, comece a usar o criogênio secundário (ou seja, etano liquefeito).
      NOTA: O ponto de setpoint utilizado foi -180 °C, ligeiramente acima do ponto de fusão do etano (-182,8 °C). Você não precisa de precool o liquefier do etano porque pode ser uma fonte de formação da geada e de contaminação do copo do etano.
   9. Abra a válvula principal da garrafa de etano de alta pureza e abra muito lentamente o regulador de pressão até obter uma névoa lenta de etano. Mantenha este fluxo muito baixo até que o etano líquido se acumule. Encha o copo à sua borda superior. Feche o regulador de pressão e a válvula principal da garrafa de etano. Retire o liquefier Leica com cuidado e deixe-o de lado em um pequeno suporte de poliestireno o capô de fumaça. Mantenha a área de trabalho vagamente coberta com a tampa de poliestireno preto fornecida com a máquina para evitar a contaminação por geada da área de trabalho e recipiente de etano.
   10. Pouco antes da amostra manual, retire a tampa de poliestireno preto e do cardápio da prensa do console"Câmara Baixa",que traz a câmara ambiental em contato com a área de trabalho criogênica.
2. Prepare-se para apagar a amostra.
   1. Prepare o amortecedor adequado para remover traços de sais do meio da cultura. Para este protocolo, o amortecedor do acetato de amônio foi usado enxaguando as pilhas de MDA-MB-231.
      NOTA: Tampão de acetato de amônio é adequado para a maioria dos tipos de células, e não adiciona ao sinal de fluorescência de raios-X (considerando elementos com Z > 9). Algumas linhas celulares particulares, como células neuronais podem exigir o uso de um amortecedor dedicado. Por exemplo, para os neurônios corticais primários, uma solução sorino consiste em 1,8 volume de 0,5 M Na₂HPO₄ e 1,9 volume de 0,5 M NaH₂PO₄ pode ser usado¹⁵. Por outro lado, fósforo ou cloro contido no buffer contribuirão para o espectro xrf. Essa limitação de linhas de emissão de raios-X espúrias deve ser mantida em mente dependendo dos elementos de interesse a serem detectados.
   2. Prepare uma solução de acetato de amônio de 150 mM a partir da solução ultrapura de acetato de amônio e verifique se há pH (7,0-7,3) e osmolaridade (270-300 mOsm/kg)
      NOTA: A osmolaridade acima mencionada é equivalente à soro cinola tampão de fosfato de Dulbecco (D-PBS) sem cálcio e magnésio e pode ser verificada usando um micro-osmômetro.
   3. Preencha o número necessário de poços de uma placa de plástico de 12 poços com o tampão de acetato de amônio.
   4. Corte um quarto de papel de filtro para borrão, seja de papel de filtro nº 1 com um buraco pré-cortado, ou de papel de filtro perfurado manualmente de um diâmetro de 55 mm com um buraco central de 15 mm.
   5. Tire a amostra necessária armazenada na incubadora a 37 °C no último momento antes de enxaguar e mergulhar a membrana.
   6. Desbloqueie as pinças usando o anel de grampo preto das fórceps de liberação rápida (normalmente um anel de aperto Dumont pinças médicas de alta precisão) e pegue o suporte de membrana Si₃N₄ da cultura bem.
      NOTA: Pegue o meio do quadro de silício, mantendo a ponta das pinças perto da membrana. Mova o anel de grampo preto para baixo às primeiras listras para travar os pinças.
   7. Mergulhe o suporte de membrana Si₃N₄ verticalmente na solução tampão de acetato de amônio mantida em 37 °C para ~5 s.
      NOTA: O suporte deve permanecer vertical no buffer. Observe que a solução tampão em cada poço da placa pode ser usada para até três membranas para as mesmas condições de incubação.
   8. Borre manualmente com papel de filtro para drenar o buffer em excesso da solução de enxaguamento de membrana (Figura 4), a fim de deixar uma camada fina e homogênea de solução aquosa de acetato de amônio que cobre as células.
      NOTA: Para fazer isso, pressione primeiro a parte de trás da janela para o papel de filtro para remover quase todo o tampão aquoso permanecendo no poço e na parte de trás da membrana. Em segundo lugar, borrar o lado da frente, a partir de ambos os lados da pinça, em seguida, cada lado do quadro (Figura 4). Nunca toque na membrana. O excesso de tampão drenado pode ser monitorado com o aureole formado no papel de filtro.
   9. Abra a porta da câmara ambiental e monte rapidamente as pinças, deslizando-a para o bloqueio fórceps, e fechar a porta(Figura 5).
   10. Imprensa "Blot / Um mergulho". As pinças segurando a membrana Si₃N₄ serão rapidamente mergulhadas no criogênio.
   11. Retire a tampa do recipiente de transferência com fórceps pré-resfriados.
   12. Imprensa "Transferência". A membrana Si₃N₄ será ligeiramente movida acima do criogênio.
   13. Em um único movimento rápido, desligue as pinças deslizando-as para fora do bloqueio fórceps e ligeiramente inclinar para fora do bloqueio para trazer diretamente em um slot vazio da crio-caixa no recipiente de transferência cheio de LN₂. Libere o anel de braçadeira preto para libertar a membrana(Figura 5).
       NOTA: O recipiente de transferência deve ser sempre coberto com LN₂. Quando um refil é necessário, cubra o copo de etano com a tampa de plástico fornecida com a máquina para evitar misturar LN₂ e etano.
   14. Cubra o recipiente de transferência com uma tampa e use um pequeno copo de poliestireno branco cheio de LN₂ para transferi-lo para uma caixa de poliestireno cheia de LN₂.
       NOTA: A crio-caixa ou tubo contendo as membranas podem então ser armazenados em tubos cônicos de 50 mL cheios de LN₂ e transferidos para um armazenamento de longo prazo LN₂ Dewar. Antes de começar a mergulhar congelar a próxima amostra, aquecer todas as pinças frias e foscos com um secador de cabelo ou uma placa quente / secador de ferramentas criotools (45 °C) para evitar a contaminação com cristais de gelo.

5. Congelamento de células congeladas cultivadas em membranas de nitreto de silício

NOTA: Para lidelise- secando, as seguintes etapas aplicam-se às pilhas de MDA-MB-231 e de HN. Para esfriar o secador de gelo, você terá que esperar cerca de 40 min a 1 h.

1. Configure o secador de gelo
   1. Ligue a energia com o interruptor roqueiro localizado no painel traseiro do instrumento.
   2. Comece a digitar os parâmetros seguindo o menu LCD: Segmento 1 = 2 h a -120 °C; Segmento 2 = 2 h rampa de -120 °C para -80 °C; Segmento 3 = 2 h a -80 °C; Segmento 4 = 2 h rampa de -80 °C para 50 °C; Segmento 5 = 2 h a -50 °C; Segmento 6 = rampa de 6 h de -50 °C a 30 °C.
   3. No final da configuração do parâmetro, salve as configurações, feche a tampa da câmara e pressione "START".
   4. A unidade vai bombear para baixo a 1,10^-5 mbar. Quando essa pressão for alcançada, a linha de comando da tela mostrará " Comece aesfriar agora, comece a continuar".
   5. Encha o nitrogênio líquido Dewar regularmente para esfriar o palco abaixo da configuração de ponto triplo de temperatura.
      NOTA: A temperatura do ponto triplo do estágio é ajustada a -140 °C. Antes de carregar a amostra para este protocolo, é melhor esperar cerca de 1 h e uma fase de temperatura de -160 °C.
   6. A exibição mostrará "Press ENTER" quando estiver pronto para " Amostra decarga".
   7. Arrefecer até a temperatura líquida de nitrogênio dentro de um LN₂ cheio de poliestireno Dewar, o titular de transferência de amostra fornecido pelo fornecedor, e os dois suportes adicionais de latão cilíndrico Si₃N₄ membrana.
   8. Monte o suporte de bronze da membrana Si₃N₄ em cima do titular de transferência de amostras fornecido pelo fornecedor no dewar de poliestireno (Figura 6A). Mantenha o nível de LN₂ a cerca de 1 a 2 mm abaixo da borda superior da primeira peça de latão.
   9. Pegue um suporte de amostra de membrana Si₃N₄ da crio-caixa ou do tubo PCR usando pinças de auto-fechamento pré-resfriadas em inox ou revestidas de teflon.
   10. Deposite a membrana com as células amostra lado virado para cima na cavidade numerada suporte de bronze.
   11. Cubra a montagem com a segunda peça de bronze como uma tampa (Figura 6C).
       NOTA: Nós projetamos dois discos de bronze cada um com uma espessura de 5 mm, um diâmetro de 50 mm, e um buraco central de 11 mm de diâmetro. O primeiro disco de latão tem 14 locais retangulares (8 mm x 6 mm) para acomodar suportes (5 mm x 5 mm). Cada slot tem um poço plano e polido com uma profundidade de 2 mm. O segundo disco de bronze é plano para cobrir o suporte de bronze de membrana Si₃N₄ e atua como um recinto de armadilha fria.
   12. Pré-cool a haste de transferência no LN₂ caixa de espuma de poliestireno cheio e usá-lo para bloquear a montagem completa (Figura 6D,E).
   13. Imprensa "ENTER" no painel frontal do secador de gelo.
   14. As bombas turbo e rotativa vai parar e a câmara purgada com gás nitrogênio seco para permitir a abertura da tampa da câmara.
   15. Transfira imediatamente a montagem de transferência de amostras com a haste de transferência carregada de mola para a câmara de secador de gelo e grampeá-la no estágio frio ln₂ de cobre.
       NOTA: Deixe a montagem completa com a haste de transferência para a câmara.
   16. Feche imediatamente a tampa da câmara de secador de gelo e pressione "START" para continuar com o ciclo de congelamento de secagem.
   17. Encha o reservatório ln₂ do secador de congelamento manualmente a cada 2 h.
       NOTA: Um sistema automático de enchimento LN₂ pode ser conectado a este reservatório.
   18. No final do ciclo de congelamento de secagem, pressione"STOP"para desabafar a câmara, e remover a montagem completa para acessar as amostras liofilizadas.

Resultados

Uma visão típica do microscópio de vídeo óptico de células mda-MB-231 hidratadas congeladas que foram subcultivadas em um suporte de membrana Si₃N₄ revestido de poli-l-lisina é mostrada na Figura 7A. A visão óptica da amostra na câmara de vácuo foi obtida em modo de reflexão usando o microscópio de vídeo on-line dedicado da linha de viga ID16A da ESRF^22. Enquanto a microscopia de raios-X elétrons ou soft requer que a camada de gelo insera a célula seja o mais fina possível (tipicamente <0.5 μm), raios-X duros (>10 keV) têm a vantagem de uma profundidade de penetração muito maior e deposição de dose mais baixa. A espessura do gelo pode, portanto, ser maior, tipicamente <10 μm incluindo a célula para que o gelo que incorpora a célula é de alguns μm de espessura. Isso pode ser estimado através da intensidade medida de raios-X em transmissão em comparação com a intensidade sem a amostra, levando em conta a absorção da membrana Si₃N₄ de 500 nm de espessura. Esta espessura do gelo pode ser conseguida com a borração manual como descrito no protocolo atual. Na região dos anéis de Newton, a espessura do gelo pode ser ainda mais fina (não medida).

O mapeamento elementar de fluorescência de raios-X da célula hidratada congelada é mostrado na Figura 7B com as distribuições representativas de elementos fisiológicos como potássio (K), enxofre (S) e zinco (Zn). Esses mapas representam a massa elementar areal (ou seja, massa projetada elementar). Embora não seja feito no presente caso, tais mapas podem ser normalizados através de imagens de contraste de fase baseadas em propagação de raios-X que fornecem a estimativa da massa projetada pela amostra²³. Conforme relatado por muitos estudos, o íon K altamente difusável em células preservadas em seu estado quase nativo foi assumido como homogeneamente distribuído por toda a célula^23,24,16. Como mostrado nas imagens elementares de fluorescência de raios-X 2D na Figura 7B,o elemento bem encadernado S foi distribuído uniformemente dentro da célula, da mesma forma que K, e representa uma boa estimativa do perfil de massa celular. A distribuição de Zn tinha um sinal maior no núcleo do que no citosol e claramente delineou o núcleo. Note-se que pequenas regiões enriquecidas com Zn podem ser detectadas na resolução espacial (50 nm) na região nuclear.

As nanosprobes existentes do raio X ou as que estão a ser construídas não acomodam necessariamente capacidades criogénicas. Neste caso, a melhor alternativa para obter imagens de fluorescência de raios-X de células em resoluções espaciais sub-100 nm é realizar um procedimento de congelamento de secagem descrito neste protocolo após o congelamento da célula. A Figura 8A mostra uma visão típica de microscopia de campo brilhante dos neurônios hipocampais de camundongos primários liofilizados resultantes diretamente cultivados na membrana Si₃N_4. Neste caso, se armazenados em uma câmara limpa desidratada, as amostras podem ser preparadas com 1 a 2 semanas de antecedência e ser observadas com um microscópio óptico vertical comum para registro de regiões de interesse. Cuidados devem ser tomados para evitar a exposição à umidade ambiente, pois pode ser capturado pela amostra liofilizada e levar a danos o raio-X nanobeam. Este procedimento foi aplicado com sucesso a células muito sensíveis (ou seja, células neuronais) e resultados ainda melhores foram obtidos com outros tipos mais robustos de células, como células cancerosas. Quanto às células congeladas, as imagens de fluorescência de raios-X de K, S e Zn em toda a tela de células liofilizadas são semelhantes às descritas acima. Eles são representativos das distribuições elementares a serem encontradas em vários tipos de células liofilizadas em resolução espacial de 50 a 100 nm. Embora as células inteiras de congelamento sejam uma alternativa para preservar a integridade elementar, ela é à custa de uma preservação perfeita da morfologia celular^16,particularmente as membranas celulares.

Figura 1: Suporte típico da amostra para a nano-análise da fluorescência do raio X. Um suporte de membrana Si₃N₄ em sua cápsula protetora. Este tipo de substrato pode ser usado tanto para análise da temperatura ambiente (preparação celular de congelamento de mergulho seguido de baixa temperatura e baixo processo de congelamento de gelo a vácuo) ou para análise de fluorescência criogênica de raios-X. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Vista esquemática das janelas do nitreto do silicone após a semeadura da pilha. As células são cultivadas diretamente na superfície plana revestida de poli-L-lisina do suporte de membrana Si₃N_4. Às vezes, bolhas de ar podem ser presas na cavidade traseira do suporte de membrana Si₃N₄ e têm que ser removidas conforme descrito no protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: In-house desenvolveu 3D impresso crio-caixa para armazenamento a longo prazo de mergulho congelado Si₃N₄ membrana suporta em nitrogênio líquido Dewar. (A)Cryo-box desmontado com o recipiente e as tampas (parte inferior) e (B)a crio-caixa montada com tampas trancadas. As tampas podem ser manipuladas com as pinças, abrindo ou travando por rotação. Um plano detalhado para impressão 3D está disponível mediante solicitação da ESRF ID16A. O projeto foi feito para acomodar grades tem do nitreto do silicone. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 4: Borrão de células cultivadas em Si₃N_4. Antes de mergulhar-congelamento da célula monocamada cultivada em uma membrana Si₃N₄ precisa ser lavada em solução de acetato de amônio (A)e cuidadosamente borrada manualmente usando papel de filtro (B). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 5: Máquina EM-GP de congelamento automático de mergulhos. (A)O congelador automático do mergulho. (B) Câmara ambiental com as pinças trancadas em. (C) O copo de etano coberto com o liquefier Leica ligado a uma garrafa de etano. (D)O recinto de congelamento de mergulho mostrando o copo preto cheio de etano liquefeito e a crio-caixa para maior armazenamento em LN₂ das vitrificadas membranas Si₃N_4. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 6: Montagem de criotransferência de amostras para procedimento de congelamento. (A)O primeiro receptor de latão para membranas Si₃N₄ é montado em cima do suporte de transferência de amostras fornecido pelo fornecedor de secador de gelo. (B) e (C)mostram que o segundo disco de latão plano é usado como uma capa e atua como um recinto armadilha fria para ser inserido no gabinete de vácuo do secador de gelo. (D)A montagem completa com a haste de transferência de mola. (E)O suporte da amostra que carrega a preparação celular vitrificada cultivada na membrana Si₃N₄ deve ser inserido ainda mais no secador de congelamento resfriado ln_2. Todos os passos para montar a montagem são feitos em LN₂ em uma caixa de isopor. Para maior clareza, todas as imagens foram produzidas na ausência de LN₂. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 7: Imagens de fluorescência de raios-X crio-x de uma célula hidratada congelada usando nanossonda de raios-X rígido. (A)Visão on-line típica no modo de reflexão usando o microscópio de vídeo óptico dedicado da linha de feixe ESRF ID16A. Após a absão manual, foi alcançada uma espessura total de gelo de cerca de 5 a 10 μm que permite uma visão clara das células hidratadas congeladas. Uma região com anéis de Newton indicativo de gelo ainda muito mais fino é perceptível. (B) Recrio-Raios-X representativo fluorescência distribuições celulares de elementos fisiológicos potássio (K), enxofre (S) e zinco (Zn). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 8: Imagens de fluorescência de raios-X de uma célula neuronal liofilizada usando nanossonda de raios-X rígido. (A) Visão típica de microscopia de campo brilhante de células neuronais corticais primárias liofilizadas resultantes diretamente cultivadas na membrana Si₃N_4. Barra de escala = 200 μm (B)Imagens representativas de fluorescência de raios X de temperatura x de um único neurônio hipocampal liofilizado mostrando as distribuições de elementos fisiológicos potássio (K), enxofre (S) e zinco (Zn). Barra de escala = 2 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A microscopia crioeletrônica (crio-EM) ganhou o Prêmio Nobel de Química de 2017 e, como tal, o desenvolvimento feito por J. Dubochet na vitrificação de material biológico para a determinação da estrutura de alta resolução das biomoléculas na solução²⁵. Conforme relatado por Dubochet em sua palestra do Nobel "Saber como vitrificar uma gota de água é uma coisa, preparar uma amostra biológica para observação biológica é outra"²⁵. As etapas da criopreparação são consideradas agora a técnica padrão para abrandar dano da dose de radiação e para estudar pilhas perto de seu estado nativo. A preparação permanece tediosa, no entanto. Isso ocorre porque a microscopia eletrônica, devido à sua resolução espacial insuperável, é sensível a qualquer artefato ultraestrutural que ocorra durante a preparação da amostra. O síncrotron crionanoprobes agora estão se aproximando de dificuldades semelhantes indo para baixo para resoluções espaciais tão baixo quanto 13 nm na faixa de raios-X de alta energia²⁶. A microscopia de raios-X duro pode analisar células inteiras, enquanto a microscopia eletrônica sofre com a baixa profundidade de penetração dos elétrons, permitindo que apenas fatias celulares muito finas sejam observadas.

Monocamadas de células são finas o suficiente para que, ao mergulhar-congelamento no etano líquido, as taxas de resfriamento necessárias para vitrificação de água são alcançados. Em teoria, as taxas de resfriamento tão altas quanto 10⁸ K/s são possíveis usando congelamento de alta pressão^27, o que permite a vitrificação de espécimes muito grossos para congelamento de mergulho. Uma taxa de resfriamento de 10⁵ K/s, necessária para permitir a vitrificação completa da amostra com pressão ambiente^28,é alcançada reproduzidamente usando a máquina automática de congelamento de mergulho e parâmetros apresentados aqui. Isso permite que um pesquisador vitrify espécimes biológicos finos (<10 μm), como um monocamada de células^{12,13,14,15,29,30} por mergulho de congelamento no etano líquido.

Um desafio importante com este protocolo é preservar também tanto quanto possível a integridade química do índice intracelular para fornecer distribuições elementares de confiança dentro da pilha em 2D ou em 3D. Conforme publicadoem outros lugares^2,16,17,31,no caso de imagem elementar no nível subcelular, a análise de células hidratadas congeladas deve ser considerada. Caso contrário, a combinação de congelamento de mergulho e congelamento de células pode ser usada para análise de temperatura ambiente. Para este último, o gelo amorfo é removido através do processo de sublimação, enquanto as moléculas de água encadernadas são removidas através do processo de desorção. Este processo pode estar longe de ser ideal em comparação com amostras hidratadas congeladas devido à possível alteração das membranas celulares e à morfologia de algumas estruturas subcelulares^32. Além disso, para estudos de especiação, a extração de água pode levar a artefatos de especiação metálica. Ainda assim, tem sido bem sucedido e a melhor alternativa às amostras hidratadas congeladas para imagens elementares nos níveis sub-100 nm^{2,16,17,18,20,33,35,35,36}.

Como foi relatado^37,a qualidade das preparações celulares criopreservadas pode ser avaliada através da relação K/Na de potássio para sódio. Infelizmente, ainda não pode ser determinado com a nanossonda de raios-X dura usada aqui, devido ao corte de baixa energia do detector de deriva de silício usado para detectar os fótons de fluorescência de raios-X dos elementos (E ≥ 1,3 keV magnésio). Na verdade, uma alta relação K/Na (>10) que pode ser medida usando TOF-SIMS, EPMA ou microssonda nuclear PIXE^16,37 é indicativo da integridade química preservada da célula em comparação com o K/Na esperado de 25 em uma célula viva³⁷. Isso pode ser suportado por uma baixa relação Cl/K concomitante^38. Ainda assim, a vitrificação imperfeita, particularmente se a velocidade do resfriamento da amostra for muito baixa, pode levar à formação de grandes cristais de gelo que podem danificar as membranas celulares e organelas, alterando consequentemente a distribuição de elementos químicos. Embora não haja nenhum procedimento rotineiro para monitorar esse dano potencial e impacto na distribuição intracelular, as proporções elementares acima e a possibilidade de imagem da célula em alta resolução usando contraste de fase de raios-X ou microscopia crio-soft de raios-X podem ser as melhores abordagens para suportar a boa preservação de compartimentos intracelulares com preservação concomitante da integridade elementar. A combinação dessas técnicas e o uso de microscópios ópticos de fluorescência criocorrelativo recém-desenvolvidos ajudarão a avaliar até que ponto esse dano ocorre e afeta a distribuição elementar intracelular.

No geral, um protocolo detalhado e abrangente para preparar amostras celulares para a nanoanálise de fluorescência de raios X síncrotron é apresentado. É um bom ponto de partida para a comunidade de pesquisa, ajudando a resolver a difícil questão de como preparar amostras celulares apropriadas para imagens elementares 2D e 3D em nanoprobes de raios-X (crio) rígidos. Essas abordagens podem ser fundidas com capacidade óptica de fluorescência e microscopia eletrônica para imagens químicas e estruturais correlativas aprofundadas das células.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O	SIGMA	09691-250mL	One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway.
B27 supplement, 50x	Life Technologies, Invitrogen	17504-044	for hippocampal neuron culture
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)	GIBCO	14190-094	cell culture
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification)	GIBCO	21885025	cell culture
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies, Invitrogen	31966-02	for hippocampal neuron culture
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology	World Precision Instrument	501202
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer	Quorum Technology	EK3147
Ethane N45	Air Liquid	p0505s05r0a001	C2H6 > 99,995 %
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin	GIBCO	A31604-02	cell culture
HBSS 10x	Life Technologies, Invitrogen	14185-052	for hippocampal neuron culture
Leica GP quick-release forceps	Leica	16706435
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell	ATCC	ATCC HTB-26	cell culture
Neurobasal medium	Life Technologies, Invitrogen	21103-049	for hippocampal neuron culture
Nunc 4-Well Plate	Thermo Fisher	176740	cell culture
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer	Advanced Instruments	Osmo1	Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer)
Penicillin-Streptomycin	SIGMA	P4333	cell culture
poly-L-lysine	SIGMA	P4707	Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged).
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit	Leica	16706401	Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing.
Silicon nitride membrane (Si3N4)	Silson Ltd.	SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl	The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...
Trypan blue solution 0.4%	GIBCO	15250061	cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	GIBCO	25300-054	cell culture
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water	Fisher Chemicals	W9-1	MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis.
Whatman No. 1 filter paper with precut hole	Leica	16706440	Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used.