JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة cryoAPEX ، حيث يمكن ترجمة بروتين غشاء APEX2 الموسوم عن طريق المجهر الإلكتروني المنقول داخل بنية فائقة للخلايا محفوظة على النحو الأمثل.

Abstract

تعتمد الأحداث الخلوية الرئيسية مثل نقل الإشارات والاتجار بالأغشية على موقع البروتين المناسب داخل المقصورات الخلوية. وبالتالي فإن فهم التعريب الدقيق دون الخلوي للبروتينات مهم للإجابة على العديد من الأسئلة البيولوجية. كان السعي للحصول على تسمية قوية لتحديد توطين البروتين إلى جانب الحفاظ على الخلايا الكافية وتلطيخها تحديًا تاريخيًا. وقد أدت التطورات الأخيرة في التصوير المجهري الإلكتروني (EM) إلى تطوير العديد من الأساليب والاستراتيجيات لزيادة الحفاظ على الخلوية وتسمية البروتينات المستهدفة. علامة وراثية جديدة نسبيًا تعتمد على البيروكسيديز ، APEX2 ، هي شركة رائدة واعدة في العلامات النشطة EM القابلة للاستنساخ. كما تقدم إعداد العينة للمجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) في السنوات الأخيرة مع ظهور التثبيت بالتبريد عن طريق تجميد الضغط العالي (HPF) والجفاف المنخفض الحرارة وتلطيخها عن طريق استبدال التجميد (FS). يوفر HPF و FS الحفاظ الممتاز على البنية الفائقة الخلوية لتصوير TEM ، في المرتبة الثانية بعد التصوير بالتبريد المباشر للعينات الزجاجي. هنا نقدم بروتوكولا لطريقة cryoAPEX، الذي يجمع بين استخدام علامة APEX2 مع HPF و FS. في هذا البروتوكول ، يتم وضع علامة على بروتين الفائدة مع APEX2 ، يليه التثبيت الكيميائي ورد فعل بيروكسيديز. بدلا من تلطيخ التقليدية والجفاف الكحول في درجة حرارة الغرفة، يتم cryofixed العينة وتمر بالجفاف وتلطيخ في درجة حرارة منخفضة عن طريق FS. باستخدام cryoAPEX ، لا يمكن تحديد بروتين مهم داخل مقصورات دون الخلوية فحسب ، ولكن يمكن أيضًا حل معلومات إضافية فيما يتعلق طوبولوجياه داخل غشاء محفوظ هيكليًا. نحن نظهر أن هذه الطريقة يمكن أن توفر دقة عالية بما يكفي لفك أنماط توزيع البروتين داخل تجويف العضي ، والتمييز بين تجزئة البروتين داخل عضوواحد على مقربة من العضيات الأخرى غير المسماة. علاوة على ذلك ، cryoAPEX هو واضح من الناحية الإجرائية وقابلة للخلايا التي تزرع في زراعة الأنسجة. وهو ليس أكثر تحديا من الناحية الفنية من التبريد نموذجية وطرق استبدال التجميد. CryoAPEX ينطبق على نطاق واسع لتحليل TEM من أي بروتين غشاء التي يمكن أن تكون الموسومة وراثيا.

Introduction

غالبًا ما تتضمن الدراسات البيولوجية مسائل حل توطين البروتين دون الخلوي داخل الخلايا والعضيات. يوفر المجهر المناعي رؤية مفيدة منخفضة الدقة لتوطين البروتين ، وتدفع التطورات الأخيرة في التصوير فائقة الدقة حدود الدقة للبروتينات الموسومة بالفلورسنت1،2،3. ومع ذلك ، لا يزال المجهر الإلكتروني (EM) المعيار الذهبي لتصوير ultrastructure الخلوية عالية الدقة ، على الرغم من أن وضع العلامات على البروتينات يمثل تحديًا.

تاريخيا، وقد استخدمت العديد من أساليب م لنهج مسائل توطين البروتين فائقة الهيكلية. واحدة من الطرق الأكثر استخداما هو المجهر الإلكتروني المناعي (IEM)، حيث يتم استخدام الأجسام المضادة الأولية الخاصة بالمستضد للكشف عن البروتين ذات الفائدة. يتم إنشاء إشارة EM من خلال تطبيق الأجسام المضادة الثانوية مترافقة مع جزيئات كثيفة الإلكترون ، والذهب الأكثر شيوعا الغروية4،5. بالتناوب ، يمكن استخدام الأجسام المضادة المترافقة مع الإنزيمات مثل الفجل الحصان بيروكسيديز (HRP) لإنتاج رسب كثيف الإلكترون6،7،8. يوجد نهجان رئيسيان لـ IEM، يطلق عليهم التضمين المسبق وإعادة التضمين. في ما قبل تضمين IEM ، يتم إدخال الأجسام المضادة مباشرة إلى الخلايا ، مما يتطلب تثبيت الضوء ونفاذالخلايا9،10،11. يمكن أن تتلف كلتا الخطوتين البنية الفائقة12،13. تطوير أجسام مضادة أصغر بكثير تتكون من جزء Fab من الأجسام المضادة مترافق مع 1.4 نانومتر من الذهب النانوي يسمح بظروف نفاذية لطيفة للغاية لاستخدامها؛ ومع ذلك ، نانوغولد صغيرة جدا للتصور المباشر تحت TEM ويتطلب خطوات تعزيز إضافية لتصبح مرئية14،15،16. في ما بعد تضمين IEM ، يتم تطبيق الأجسام المضادة على أقسام رقيقة من الخلايا التي تمت معالجتها بالكامل عن طريق التثبيت والجفاف والتضمين في الراتنج17. في حين أن هذا النهج يتجنب خطوة permeabilization ، والحفاظ على epitope من الفائدة في جميع أنحاء إعداد العينة هو التحدي18،19،20. طريقة توكوياسو لتثبيت الضوء تليها تجميد، وأقسام التبريد، والكشف عن الأجسام المضادة يوفر تحسين حفظ epitope21،22. ومع ذلك ، فإن المتطلبات التقنية لاستئصال الموجات فوق البنفسجية ، وكذلك التباين دون الأمثل الذي تحقق في الخلية ، هي عيوب23.

استخدام العلامات المشفرة وراثيا يزيل العديد من الصعوبات التي تواجهها IEM المتعلقة بالكشف عن البروتين ذات الأهمية. تتوفر مجموعة متنوعة من العلامات ، بما في ذلك HRP ، ferritin ، ReAsH ، miniSOG ، وmetallothionein24،25،26،27،28،29،30،31،32. كل من هذه لها مزايا على الأساليب السابقة، ولكن كل أيضا عيوب منع الاستخدام على نطاق واسع. هذه العيوب تتراوح بين الخمول من HRP في السيتوسول إلى حجم كبير من علامة الفيريتين، وحساسية الضوء من ReAsH، وصغر الحجم وعدم التوافق مع تلطيخ الخلوية من metallothionein. في الآونة الأخيرة ، تم تصميم بروتين مشتق من البيروكسيديز الأسكوربات كعلامة EM ، اسمه APEX233،34. كما بيروكسيديز, APEX2 يمكن تحفيز أكسدة 3,3 'ديامينوبنزيدين (DAB), إنتاج راسب التي تتفاعل مع tetroxide osmium لتوفير التباين EM المحلية مع الحد الأدنى من الانتشار من البروتين الفائدة (أقل من 25 نانومتر)33,35. على عكس الأساليب التقليدية المستندة إلى HRP ، فإن APEX2 مستقر للغاية ويظل نشطًا في جميع المقصورات الخلوية33. يمكن معالجة العينات لTEM باستخدام تلطيخ عينة EM التقليدية والأساليب التي تسمح بالتصور الجيد للهياكل المحيطة33،34،36. بسبب صغر حجمها واستقرارها وتعدد استخداماتها ، برزت APEX2 كعلامة EM ذات إمكانات كبيرة.

ولا يمكن أو لم يتم الجمع بين العديد من النهج التي نوقشت أعلاه أو لم يتم الجمع بينها وبين الحالة الراهنة للفنون في الحفظ الفائق الهيكلي، والتثبيت بالتبريد، واستبدال التجميد المنخفض الحرارة. وبالتالي ، فإنها تعاني من عدم وجود الحفاظ على الغشاء و / أو تلطيخ الخلية لتحديد توطين البروتين دقيقة. وهذا يحد بالضرورة من دقة وتفسير البيانات التي يمكن الحصول عليها. التبريد عن طريق تجميد الضغط العالي (HPF) ينطوي على التجميد السريع للعينات في النيتروجين السائل عند ضغط عال (~ 2100 بار) ، مما يسبب التزجيج بدلا ً من تبلور العينات المائية ، وبالتالي الحفاظ على الخلايا في حالة شبه أصلية37،38،39. ويتبع HPF استبدال التجميد (FS) ، وهو جفاف منخفض في درجة حرارة (-90 درجة مئوية) في الأسيتون إلى جانب الحضانة مع بقع EM النموذجية مثل تيتروأكسيد الأوسيميوم وخلات الأورانال. يوفر HPF و FS معاً ميزة واضحة على التثبيت الكيميائي التقليدي (عملية أطول يمكن أن تؤدي إلى القطع الأثرية) وجفاف الكحول في درجة حرارة الغرفة أو على الجليد (مما يمكن أن يؤدي إلى استخراج الدهون والسكريات) ، وبالتالي فهي مرغوبة في الجمع مع أفضل علامات EM للكشف عن البروتين.

أحد الأسباب التي لم يتم الجمع بين HPF / FS مع وضع العلامات APEX2 هو أن التثبيت الكيميائي الخفيف هو شرط أساسي لرد فعل البيروكسيديز ، مما يحد من انتشار منتج تفاعل DAB. في دراسات APEX2 حتى الآن ، ويتبع التثبيت والتفاعل بيروكسيديز من قبل أساليب م التقليدية لتلطيخ وجفاف الكحول33،36. ومع ذلك ، فقد ثبت أن بعد التثبيت الكيميائي مع HPF / FS يوفر ميزة واضحة في الحفاظ على التثبيت الكيميائي التقليدي والجفاف الكحول وحده40. فقدان النزاهة الفائقة الهيكلية التي شوهدت في عينات TEM التقليدية يبدو أقل ارتباطا ً بالتثبيت من الجفاف ، والذي يتم عادة باستخدام الكحول في درجة حرارة الغرفة أو على الجليد ، ويمكن أن يؤدي إلى استخراج الدهون والسكريات40،41. لتطوير طريقة cryoAPEX ، افترضنا أن التثبيت الكيميائي وتفاعل البيروكسيديز ، يليه HPF و FS ، من شأنه أن ينتج نتيجة مثالية من حيث الحفاظ على البُرِك.

هنا نقدم بروتوكول cryoAPEX ، الذي يجمع بين وضع علامات APEX2 مع التثبيت اتّحاديّ وطرق استبدال التجميد(الشكل 1). يتكون هذا البروتوكول المباشر من نقل بروتين APEX2 الموسوم ة ذات الفائدة ، والتثبيت الكيميائي للخلايا ، ورد فعل بيروكسيديز. ثم يتم تنفيذ HPF و FS متبوعة بتضمين الراتنج النموذجي والمقطعة الرقيقة. يكشف التصوير TEM عن الحفاظ الممتاز على البنية الفائقة باستخدام هذه الطريقة. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ توطين عالي الدقة تحت الخلايا والتوزيع المكاني لبروتين الخلايا الانندوبلازمية (ER). هذه الطريقة مفيدة على نطاق واسع للكشف عن توطين بروتين الغشاء داخل الخلايا لتحليل المجهر الإلكتروني. في أيدينا، وقد عملت هذه الطريقة بنجاح لمجموعة متنوعة من خطوط الخلايا التي تزرع في زراعة الأنسجة، بما في ذلك HEK-293T (الكلى الجنينية البشرية)، HeLa (سرطان عنق الرحم البشري)، Cos7 (الأفريقي الأخضر القرد الليفية)، وBHK (الطفل الهامستر الكلى). يتم وصف التعليمات التفصيلية أدناه باستخدام خلايا HEK-293T.

Protocol

1. ثقافة الخلية وTransfection

  1. البذور HEK-293T الخلايا على قطر 60 ملم أو أكبر طبق زراعة الأنسجة وتنمو إلى 60٪ -90٪ التقاء في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  2. الخلايا Transfect مع APEX2 الموسومة الثدييات التعبير plasmids باستخدام كاشف transfection (انظر جدول المواد)وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة.
  3. في 12-15 ساعة بعد الترانزفان، اغسل الخلايا مرة واحدة مع الفوسفات المالحة العازلة (PBS). إزالة الخلايا من الطبق عن طريق الغسيل لطيف مع برنامج تلفزيوني. يمكن استخدام كاشف الانفصام مثل التربسين إذا لزم الأمر لنوع خلية معينة. جهاز طرد مركزي في 500 × ز لمدة 5 دقيقة لتشكيلبيليه.

2. التثبيت الكيميائي والتفاعل بيروكسيديز

  1. قم بإزالة supernatant بعناية وإعادة تعليق بيليه في 2 مل من 2٪ الجلوتارالدهيد (v/v) في 0.1 M الصوديوم cacodylate العازلة، ودرجة الحموضة 7.4، في درجة حرارة الغرفة. ضع عينة على الثلج واحتضان لمدة 30 دقيقة بيليه العينة في 500 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية. من هذه النقطة حتى الخطوة 2.3.3، والحفاظ على العينة والحلول على الجليد، وإجراء الطرد المركزي في 4 درجة مئوية.
    تنبيه: كل من الجلوتارالدهيد وعازل كاكوكات الصوديوم (الذي يحتوي على الزرنيخ) سامان. وينبغي استخدام إجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية أثناء المناولة. وينبغي التخلص من المحاليل التي تحتوي على الجلوتارالدهيد و/أو عازل كاكوديلات الصوديوم كنفايات كيميائية خطرة.
  2. غسل بيليه 3x لمدة 5 دقيقة مع 2 مل من 0.1 M الصوديوم cacodylate العازلة. لهذه وكذلك السُلة اللاحقة، وبلطف إعادة تعليق بيليه الخلية في الحل المطلوب، ثم الطرد المركزي لمدة 5 دقيقة في 500 × ز وإزالة بعناية والتخلص من supernatant. وينبغي توخي الحذر مع الخطوات المتكررة الكريات وإعادة التعليق، من أجل تقليل فقدان العينة.
  3. تنفيذ رد فعل بيروكسيديز
    1. إعداد محلول جديد يحتوي على 1 ملغ / مل من 3,3'-diaminobenzidine رباعي هيدروكلوريد (DAB) في 0.1 م الصوديوم كاكوكات العازلة. حل DAB عن طريق دوامة قوية لمدة 5-10 دقيقة.
      تنبيه: DAB هو مادة سامة ومسرطنة محتملة وينبغي التعامل معها مع إجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية. وينبغي التعامل مع الحلول التي تحتوي على داب كنفايات كيميائية خطرة.
    2. غسل بيليه عن طريق إعادة تعليق في 3 مل من الحل DAB تليها الكريات في 500 × ز لمدة 5 دقيقة.
    3. إعادة تعليق بيليه في 3 مل الداب الحل الذي تمت إضافة بيروكسيد الهيدروجين لتحقيق تركيز نهائي من 5.88 mm. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بيليه يصبح واضح البني اللون مما يدل على وجود منتج رد فعل DAB غير قابلة للذوبان.
      ملاحظة: قد تحتاج إلى تحسين وقت حضانة DAB لكل عينة. يمكن رصد تغيير اللون على المجهر الضوئي. في تجربتنا، و15-45 دقيقة حضانة كافية لمعظم البروتينات. يجب الحصول على بيروكسيد الهيدروجين من زجاجة مفتوحة حديثا أو واحدة التي تم الاحتفاظ بها مختومة جيدا بعد الافتتاح.
    4. بيليه الخلايا، ثم غسل 2x لمدة 5 دقيقة مع 0.1 M العازلة كاكوليتي الصوديوم، تليها غسل واحد في متوسط النسر تعديل Dulbecco (DMEM) أو وسائل الإعلام الخلية من الاختيار.
  4. إعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من محلول حماية التبريد من DMEM (أو غيرها من وسائل الإعلام الخلية من اختيار) التي تحتوي على 10٪ مصل الأبقار الجنين و 15٪ الزلال مصل البقر. بيليه مرة أخرى، زيادة طفيفة في سرعة الطرد المركزي من 500 × ز إذا لزم الأمر لتحقيق بيليه في محلول سميكة التبريد protectant. تجاهل غالبية supernatant، وضمان أن يتم ترك ما يكفي من السائل بحيث بيليه لن تجف. نقل بيليه الخلية إلى أداة تجميد الضغط العالي.

3. ارتفاع ضغط التجميد

  1. ملء خزان الفريزر عالي الضغط بالنيتروجين السائل (LN2)وبدء المضخة لملء غرفة العينة بـ LN2.
    تنبيه: استخدم إجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية عند العمل مع النيتروجين السائل.
    ملاحظة: هذه الخطوات خاصة بثلاجة الضغط العالي Leica EMPACT2.
  2. الفتيل بعيدا أي السائل المتبقية من بيليه الخلية باستخدام زاوية مسح المختبر أو منشفة ورقية. يجب أن يبقى ما يكفي من السائل أن بيليه يشكل عجينة مماثلة في الاتساق معجون الأسنان. وينبغي أن تكون رقيقة بما يكفي ليتم استنشاقها في تلميح أنابيب 20 ميكرولتر.
  3. استريد 2-3 ميكرولتر من بيليه الخلية وأودعها على حامل غشاء. ملء بئر الناقل غشاء تماما، بحيث التوتر السطحي يخلق قبة طفيفة على القمة، ولكن السائل لا ينسكب من البئر. لا ينبغي أن تكون فقاعات الهواء موجودة.
  4. حرك حامل الغشاء في الخرطوشة وآمنًا. ضع الخرطوشة في جهاز HPF الذي تم إعداده وإعداده، واضغط على ابدأ للتجميد.
  5. فحص درجة الحرارة مقابل الوقت والضغط مقابل الرسوم البيانية الوقت للتحقق من أن الضغط وصل إلى 2100 بار ووصلت درجة الحرارة إلى -196 درجة مئوية في غضون 200 مللي ثانية ، وظلت كل المعلمات ثابتة لقياس 600 مللي ثانية.
  6. كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.5 حتى يتم استخدام بيليه الخلية أو تم تجميد العدد المطلوب من العينات.
  7. الحفاظ على خراطيش مغمورة في LN2،وإزالة كل حامل غشاء من خرطوشة لها، ووضعها في كبسولة بلاستيكية، ووضع كبسولة بلاستيكية في قارورة التبريد الكامل من LN2.
    ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. يمكن تخزين القنينات الباردة مع العينات في dewar LN2 في قصب التبريد أو صناديق التبريد.

4- استبدال التجميد

تنبيه: استخدم إجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية عند العمل مع النيتروجين السائل. بالإضافة إلى ذلك، العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في الخطوة 4 سامة، بما في ذلك حمض التانيك، وtetroxide الأوزيميوم، وخلات أورانال. ويجب التعامل مع هذه المواد الكيميائية وفقاً لإجراءات السلامة السليمة والتخلص منها كنفايات كيميائية خطرة.

  1. ملء وحدة استبدال التجميد الآلي مع LN2. رفع درجة الحرارة إلى -90 درجة مئوية.
  2. إعداد FS ميكس 1 وتبدأ FS.
    1. في غطاء محرك السيارة الكيميائية، وإعداد محلول من 0.2٪ حمض التانيك (ث / v) و 5٪ DI المياه في الأسيتون وaliquot 1 مل لكل عينة في قنينات التبريد. ضع في LN2 لتجميد.
    2. ضع قارورة FS Mix 1 وقوارير التبريد التي تحتوي على كريات الخلايا المجمدة في غرفة عينة وحدة FS. نقل الكبسولة الداخلية التي تحتوي على حامل الغشاء من قارورة LN2 إلى القارورة المقابلة التي تحتوي على FS Mix 1.
    3. بدء بروتوكول FS مع الخطوة الأولى التي تكون 24 ساعة في -90 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، وقفة FS، وغسل العينات 3x لمدة 5 دقيقة مع الأسيتون التي تم تبريدها إلى -90 درجة مئوية.
  3. إعداد FS ميكس 2 وFS كاملة
    تنبيه: أوميوم تيتريأكسيد هو مادة كيميائية شديدة السمية ومؤكسدة يجب التعامل معها فقط من قبل الأفراد المدربين وفقًا لبروتوكولات السلامة المعمول بها. ويجب اتباع بروتوكولات لتخزين الحلول المحتوية على الأوميوم والتخلص منها، فضلاً عن وضع علامات على مناطق المختبر التي يستخدم فيها تسيد الأوميوم. يجب التعامل مع أشيميوم tetroxide في غطاء محرك السيارة الكيميائية مع معدات الحماية الشخصية بما في ذلك حماية العين، ومعطف مختبر توفير حماية الذراع الكامل، قفازات نيتريل مزدوجة، وجهاز التنفس الاختياري.
    1. في غطاء محرك السيارة الكيميائية، وإعداد حل من 1٪ أسيدوك الأوميوم، 0.2٪ خلات أورانال، و 5٪ DI المياه في الأسيتون. Aliquot 1 مل لكل عينة في قنينات التبريد ووضعها في LN2 لتجميد.
      ملاحظة: يمكن إعداد حلول المخزون من حمض التانيك (10٪ ث /v في الأسيتون)، وأوميوم tetroxide (10٪ ث / v في الأسيتون) وخلات أورانال (8٪ ث / v في الميثانول) وتخزينها في قوارير التبريد في dewar LN2 لسهولة إعداد ميكسات FS.
    2. ضع القنينات الباردة مع FS Mix 2 في وحدة FS ونقل الكبسولات من غسل الأسيتون الثالث في قارورة FS Mix 2. احتضان في FS ميكس 2 لمدة 72 ساعة في -90 درجة مئوية، تليها الاحترار التدريجي إلى 0 درجة مئوية على مدى 12-18 ساعة.
  4. الحفاظ على درجة الحرارة في 0 درجة مئوية وغسل 3x لمدة 30 دقيقة مع الأسيتون المبردة مسبقا من زجاجة مفتوحة حديثا.

5. تسلل الراتنج والتضمين

تنبيه: الراتنج المستخدم هنا (انظر جدول المواد)سام قبل البلمرة، وينبغي التعامل معه بإجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية. وينبغي التخلص من أي راتنج غير معمرة كنفايات كيميائية خطرة.

  1. التسلل العينات مع تركيزات متزايدة من الراتنج المذاب في الأسيتون من زجاجة فتحت حديثا. إعداد خليط من مكونات الراتنج A و B و D في كوب بلاستيكي وفقًا لتوجيهات الشركة المصنعة ، واحتضان العينات في تركيزات الراتنج التالية: 2٪ ، 4 ٪ ، و 8٪ لكل من 2 ساعة عند درجة حرارة 0 درجة مئوية. احتضان في 15٪، 30٪، 60٪، 90٪، و 100٪ الراتنج لمدة 4 ساعة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. احتضان لمدة 4 ساعة في خليط من المكونات A و B و C و D.
  2. ضع حاملات الغشاء مع جانب بيليه الخلية في قوالب تضمين مسطحة واملأ بالراتنج (A و B و C و D). يمكن إضافة ملصقات ورقية للعينات إلى الآبار في هذا الوقت.
  3. بلمرة في فرن في 60 درجة مئوية لمدة 24-36 ساعة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا بعد البلمرة.
  4. إزالة كتل من القالب والسماح لتبرد. لإزالة الناقل غشاء، في المقام الأول العينة في تشاك العمودي من ultramicrotome حيث يمكن تصور مع التكبير. فصل الناقل غشاء من كتلة عن طريق مزيج من النيتروجين السائل dabbing على الناقل غشاء لفصل المعدن من البلاستيك، واستخدام شفرة حلاقة لرقاقة بعيدا الراتنج حول الناقل الغشاء. عند فصلها، ورفع بلطف بعيدا الناقل غشاء ترك قبة بيليه الخلية على وجه الكتلة.
  5. ضع الكتلة مع بيليه الخلية المكشوفة التي تواجه إلى أعلى في قالب تضمين مسطح أعمق قليلاً من القالب الأول ، واملأ بالراتنج. بلمرة في 60 درجة مئوية لمدة 24-36 ساعة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا بعد البلمرة.

6- قسمة

  1. تقليم كتلة حول بيليه الخلية باستخدام شفرة حلاقة. ثم ضع الكتلة في عينة تشاك على ذراع قسمة من ultramicrotome. باستخدام سكين من الزجاج أو الماس، وتقليم كتلة في شكل شبه منحرف المحيطة عن كثب بيليه الخلية.
  2. الحصول على 90 نانومتر أقسام رقيقة من بيليه الخلية باستخدام الزجاج أو سكين الماس.
  3. التقاط شريط من المقاطع على شبكة TEM. شبكات فتحة النحاس المغلفة بـ Formvar (فتحة 1 × 2 مم2) مفيدة لتصوير المقاطع التسلسلية. جفف الشبكة عن طريق النشاف على الحافة على قطعة من ورق التصفية ، وخزنفي صندوق تخزين شبكة TEM.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً بعد المقطعة.

7. تيم التصوير

  1. قم بتركيب الشبكة على حامل TEM ووضعه في المجهر. نحن نستخدم بشكل روتيني Tecnai T12 بسرعة 80 كيلوفولت لفحص عينات cryoAPEX. الحصول على صور من الخلايا والهياكل دون الخلوية ذات الأهمية مع وضع العلامات APEX2.
  2. إذا رغبت في ذلك، والحصول على تباين غشاء إضافية من خلال استخدام الرصاص بعد تلطيخ. انظر الشكل 2 لمقارنة العينات غير الملطخة(الشكل 2I-K) وعينات الرصاص الملطخة(الشكل 2A-H).
    1. تعويم الشبكات الجافة الجانب أسفل على قطرة من محلول كلوريد الصوديوم المخفف (~ 1.5 mm)، 2x لمدة 1 دقيقة لكل منهما، ثم 1x لمدة 10 دقيقة.
    2. تعويم الشبكات على قطرة من محلول الرصاص Sato لمدة 1 دقيقة غسل عن طريق العائمة على محلول كلوريد الصوديوم 3x لمدة 1 دقيقة، ثم على المياه DI 3x لمدة 1 دقيقة. Blot السائل الزائد من الشبكات وتخزينها في مربع الشبكة.
      تنبيه: الرصاص مادة كيميائية سامة وينبغي التعامل معها مع إجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية. وينبغي التخلص من الحلول التي تحتوي على الرصاص كنفايات كيميائية خطرة.
  3. صورة عينات ما بعد الملطخة على TEM.
    ملاحظة: في إعداد العينة التقليدية لTEM، يتم تنفيذ الخطوة المتناقضة الرصاص قبل التصوير TEM. ومع ذلك، فمن المستحسن أن لعينات cryoAPEX، يتم إجراء التصوير أولاً على عينات غير متباين. وهذا يضمن أن الإشارة من العلامة يمكن أن تكون موجودة بسهولة من خلال تباينها القوي مع الهياكل الخلوية أكثر ملطخة طفيفة. بالنسبة للعديد من العينات، لن تكون هناك حاجة إلى مزيد من تلطيخ; ومع ذلك ، إذا كان تباين الغشاء الإضافي مطلوبًا ، يمكن إجراء تلطيخ الرصاص بعد الرصاص (الخطوة 7.2) وإعادة صورة العينة.

النتائج

من أجل مقارنة الحفاظ على ultrastructural باستخدام طريقة cryoAPEX مع التثبيت التقليدي والجفاف ، أعددنا عينات فيها غشاء البلتيكلوم الإنتوبلازمي (ERM ؛ ERM؛ ER غشاء) تم وضع علامة الببتيد مع APEX2 وتنتقل إلى خلايا HEK-293T. ERM-APEX2 توطينالوجه السيتوبلازمي للER ويعيد تشكيل هيكل ER إلى هياكل متميزة شكليا المعروفة باسم ت?...

Discussion

يوفر بروتوكول cryoAPEX المعروض هنا طريقة قوية لتوصيف توطين البروتينات الغشائية داخل البيئة الخلوية. لا يوفر استخدام علامة APEX2 المشفرة وراثيًا توطينًا دقيقًا لبروتين مهم فحسب ، بل يوفر استخدام التثبيت البارد والجفاف منخفض الحرارة الحفاظ الممتاز وتلطيخ البنية الخلوية المحيطة. مجتمعة، هذه الن...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

البروتوكول الموصوف هنا ينبع من منشور من قبل سينغوبتا وآخرون، مجلة علوم الخلايا، 132 (6)، jcs222315 (2019)48. ويدعم هذا العمل من المنح R01GM10092 (لS.M.) وAI081077 (R.V.S.) من المعاهد الوطنية للصحة، CTSI-106564 (إلى S.M.) من معهد إنديانا للعلوم السريرية والانتقالية، وPI4D-209263 (إلى S.M.) من معهد جامعة بوردو للالتهابات وعلم المناعة والأمراض المعدية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrateSigma-AldrichD5637-1G
Acetone (Glass Distilled)Electron Microscopy Sciences10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 ccElectron Microscopy Sciences60952
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mLVWR82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resinSigma-Aldrich44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964Sigma-Aldrich44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)Sigma-Aldrich44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component DSigma-Aldrich44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mmElectron Microscopy Sciences70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mmElectron Microscopy Sciences70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium SupplementCorning355104
Glass Knife Boats, 6.4 mmElectron Microscopy Sciences71008
Glass KnifemakerLeica MicrosystemsEM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences16120
HEK 293 CellsATCCCRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer SystemLeica MicrosystemsEM PACT2Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% SolutionFisher Scientific50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mmMager Scientific16707898
Osmium Tetroxide, crystallineElectron Microscopy Sciences19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure GradeVWR97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mmMager Scientific16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support filmElectron Microscopy SciencesFF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4Electron Microscopy Sciences102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)Avantor Macron Fine Chemicals7708-10
Tannic AcidElectron Microscopy Sciences21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mmVWR25382-166
Ultra Glass Knife StripsElectron Microscopy Sciences71012
UltramicrotomeLeica MicrosystemsEM UC7
Uranyl Acetate DihydrateElectron Microscopy Sciences22400

References

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C., Oliver, C., Jamur, M. C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A., Mueller-Reichert, T., Verkade, P. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. 111, 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E., Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L., Hajibagheri, N. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. 117, 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156 CryoAPEX APEX2 cryofixation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved