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摘要

该协议描述了CryoAPEX方法，其中APEX2标记膜蛋白可以通过传输电子显微镜在最佳保存的细胞超结构内进行局部化。

摘要

信号转导和膜贩运等关键细胞事件依赖于细胞隔间内适当的蛋白质位置。因此，了解蛋白质的精确亚细胞定位对于回答许多生物学问题非常重要。寻求一个可靠的标签来识别蛋白质的定位，结合足够的细胞保存和染色，在历史上一直具有挑战性。电子显微镜（EM）成像的最新进展导致许多方法和策略的发展，以增加细胞保存和标签目标蛋白。一个相对较新的基于过氧化物酶的基因标记APEX2是可克隆的EM活性标签中一个有前途的领导者。近年来，随着高压冷冻（HPF）和低温脱水和通过冷冻替代（FS）染色的低温化的出现，传输电子显微镜（TEM）的样品制备也有所进步。HPF 和 FS 为 TEM 成像提供了出色的细胞超结构保存，仅次于对葡萄样品的直接低温成像。在这里，我们提出了一个用于cryoAPEX方法的协议，该方法将APEX2标签的使用与HPF和FS相结合。在此协议中，感兴趣的蛋白质被标记为APEX2，然后是化学固定和过氧化物酶反应。代替传统的染色和酒精脱水在室温下，样品是冷冻的，并通过FS在低温下进行脱水和染色。使用cryoAPEX，不仅可以在亚细胞腔内识别感兴趣的蛋白质，还可以解决结构保存膜内有关其拓扑的其他信息。我们表明，该方法可以提供足够高的分辨率，以破译细胞器流明内的蛋白质分布模式，并区分一个细胞器内蛋白质在靠近其他未标记的细胞器的分割。此外，低温APEX在程序上简单明了，适合在组织培养中生长的细胞。它在技术上没有比典型的低温和冷冻替代方法更具挑战性。CryoAPEX 广泛适用于任何可基因标记的膜蛋白的 TEM 分析。

引言

生物学研究通常包括解决细胞和细胞器内的亚细胞蛋白定位问题。免疫荧光显微镜提供了一个有用的低分辨率的蛋白质定位视图，和超分辨率成像的最新进展正在推动荧光标记蛋白质1，2，3的分辨率边界。然而，电子显微镜（EM）仍然是成像高分辨率细胞超结构的黄金标准，尽管蛋白质的标记是一个挑战。

从历史上看，一些EM方法被用来处理超结构蛋白质定位问题。最常用的方法之一是免疫电子显微镜（IEM），其中抗原特异性初级抗体用于检测感兴趣的蛋白质。EM信号是由与电子致密粒子结合的二级抗体产生的，最常见的是胶体金4，5。另外，与马萝卜过氧化物酶（HRP）等酶结合的抗体可用于产生电子致密的沉淀物6、7、8。IEM 有两种主要方法，称为预嵌入和嵌入后标记。在预嵌入IEM中，抗体被直接引入细胞，这需要光固定和渗透细胞9，10，11。两个步骤都可能损坏超结构12，13。开发明显更小的抗体，由与1.4nm纳米金结合的抗体Fab片段组成，允许使用非常温和的渗透条件;然而，纳米金太小，不能直接可视化在TEM下，需要额外的增强步骤，成为可见的14，15，16。在嵌入后IEM中，抗体被应用于通过固定、脱水和嵌入树脂17而完全处理的细胞的薄部分。虽然这种方法避免了渗透步骤，但在整个样品制备过程中保持感兴趣的表位是具有挑战性的18，19，20。Tokuyasu 的光固定方法，其次是冷冻、冷冻切片和抗体检测，可提供改进的表位保存21、22。然而，低温超微切除术的技术要求，以及细胞中实现的次优对比度，都是缺点23。

使用基因编码标签消除了IEM在检测感兴趣的蛋白质方面的许多困难。有多种标签可供选择，包括HRP，铁蛋白，ReAsH，miniSOG，和金属洛西宁24，25，26，27，28，29，30，31，32。与以前的方法相比，每个方法都有优点，但每种方法也有阻止广泛使用的缺点。这些缺点包括:在细胞醇中HRP的不活动性，到铁蛋白标签的较大尺寸，ReAsH的光敏性，以及体积小，与金属洛酮的细胞染色缺乏兼容性。最近，一种来自抗坏血素过氧化物酶的蛋白质被设计成EM标签，名为APEX233，34。作为过氧化物酶，APEX2可以催化3，3'二氨基苯甲酸（DAB）的氧化，产生一种沉淀物，与四氧化二铵发生反应，以最小的扩散方式从感兴趣的蛋白质（小于25纳米）33，35提供局部EM对比度。与传统的基于HRP的方法不同，APEX2非常稳定，在所有细胞隔间中保持活跃33。样品可以使用传统的EM样品染色和方法为TEM处理，使周围结构的良好可视化33，34，36。由于其体积小、稳定性和多功能性，APEX2 已成为具有巨大潜力的 EM 标签。

上文讨论的许多方法要么不能或尚未与目前超结构保存、低温冷冻替代的最先进的技术相结合。因此，他们遭受缺乏膜保存和/或细胞染色，以确定准确的蛋白质定位。这必然限制了对可获取数据的解析和解释。高压冷冻（HPF）的冷冻包括高压（±2，100bar）在液氮中快速冷冻样品，导致水性样品的结晶，而不是水样结晶，从而将细胞保留在近原生状态37、38、39。HPF 随后是冷冻替代 （FS），丙酮中的低温 （-90 °C） 脱水与典型的 EM 染色剂（如四氧化二氮和醋酸二铵）结合孵化。与传统的化学固定（一种较长的过程可能导致人工制品）和酒精脱水在室温或冰上（可导致脂质和糖的提取）相比，HPF 和 FS 具有明显的优势，因此最好与最佳 EM 标记相结合，用于蛋白质检测。

HPF/FS 未与 APEX2 标签结合的一个原因是，轻化学固定是过氧化物酶反应的先决条件，从而限制了 DAB 反应产物的扩散。在APEX2研究中，到目前为止，固定和过氧化物酶反应遵循传统的EM方法染色和酒精脱水33，36。然而，已经表明，使用HPF/FS进行化学固定后，在保存方面比传统的化学固定和酒精脱水仅40具有明显的优势。传统TEM样品中超结构完整性的丧失似乎与固定性联系较少，而脱水通常使用酒精在室温或冰上进行，并可能导致脂质和糖的提取40，41。为了开发CryoAPEX方法，我们假设化学固定和过氧化物酶反应，其次是HPF和FS，在超结构保存方面会产生最佳结果。

在这里，我们介绍的cryoAPEX协议，它结合了APEX2标记与低温和冻结替代方法（图1）。这种简单的协议包括APEX2标记的感兴趣蛋白的转染、细胞的化学固定和过氧化物酶反应。然后执行 HPF 和 FS，然后执行典型的树脂嵌入和薄切片。TEM成像显示，该方法对超结构的保存效果非常好。此外，还观察到内质性视网膜（ER）流明蛋白的高分辨率亚细胞定位和空间分布。该方法对于检测细胞内膜蛋白定位进行电子显微镜分析具有广泛应用能力。在我们的手中，该方法已经成功地适用于组织培养中生长的各种细胞系，包括HEK-293T（人类胚胎肾）、HeLa（人类宫颈癌）、Cos7（非洲绿猴肾成纤维细胞）和BHK（婴儿仓鼠肾）。详细说明如下，使用HEK-293T细胞。

研究方案

1. 细胞培养和转染

  1. 种子HEK-293T细胞在直径60毫米或更大的组织培养皿上，在37°C和5%CO2的细胞培养箱中生长到60%~90%的汇合。
  2. 根据制造商的指示，使用转染试剂（参见材料表）使用APEX2标记的哺乳动物表达质粒转染细胞。
  3. 在转染后12~15小时，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞一次。用PBS轻轻清洗，从盘子里去除细胞。如果需要给定的细胞类型，可以使用分离试剂，如胰蛋白酶。在500 x g下离心5分钟，形成颗粒。

2. 化学固定和过氧化物酶反应

  1. 小心地去除上清液，并在室温下将颗粒重新悬浮在2 mL的2%谷醛（v/v）中，在0.1M钠甲酸钠缓冲液中，pH 7.4。将样品放在冰上，孵育30分钟。在4°C下将样品在500 x g下孵育5分钟。从此时至步骤 2.3.3，将样品和溶液保持在冰上，并在 4°C 下进行离心。
    注意:谷醛和碳酸钠缓冲液（含砷）均有毒。在操作过程中，应使用适当的安全程序和个人防护设备。含有谷醛和/或甲酸钠缓冲液的溶液应作为危险化学品废物处理。
  2. 用 2 mL 的 0.1 M 钠卡科迪酸盐缓冲液将颗粒洗涤 3x 5 分钟。对于这些以及随后的施舍，轻轻将细胞颗粒重新悬浮在所需的溶液中，然后在500 x g下离心5分钟，并小心地取出并丢弃上清液。应小心重复的颗粒和重悬浮步骤，以尽量减少样品损失。
  3. 执行过氧化物酶反应
    1. 在0.1M钙化钠缓冲液中制备含有1mg/mL的3，3'-二氨基苯甲酸四氯化物（DAB）的新鲜溶液。通过剧烈涡旋溶解 DAB 5-10 分钟。
      注意:民建联有毒，是潜在的致癌物质，应采用适当的安全程序及个人防护设备处理。含有DAB的溶液应作为危险化学品废物处理。
    2. 在 3 mL 的 DAB 溶液中重新悬浮，然后以 500 x g的颗粒进行 5 分钟洗涤。
    3. 在 3 mL DAB 溶液中重新悬浮颗粒，其中添加了过氧化氢，最终浓度达到 5.88 mM。在室内温度孵育30分钟。颗粒变为明显的棕色，表示存在不溶性 DAB 反应产物。
      注:可能需要针对每个样本优化 DAB 孵育时间。颜色变化可以在光学显微镜上监测。根据我们的经验，15-45分钟的孵育对于大多数蛋白质来说已经足够了。过氧化氢应从刚打开的瓶子或开封后密封良好的瓶子中获取。
    4. 将细胞颗粒，然后用0.1M钠卡霉酸盐缓冲液洗2次5分钟，然后在Dulbeco的改性Eagle介质（DMEM）或选择的细胞介质中洗涤。
  4. 在含有10%胎儿牛血清和15%牛血清白蛋白的DMEM（或其他可选细胞培养基）的冷冻保护溶液中重新悬浮细胞颗粒。再次颗粒，如果需要在厚厚的冷冻保护溶液中达到颗粒，则稍微提高离心速度从 500 x g。丢弃大部分上清液，确保留下足够的液体，使颗粒不会干涸。将细胞颗粒输送到高压冷冻仪器。

3. 高压冻结

  1. 用液氮 （LN2）填充高压冷冻储液罐，然后启动泵以填充 LN2的样品室。
    注意:使用液氮时，请使用适当的安全程序和个人防护设备。
    注:这些步骤特定于 Leica EMPACT2 高压冰柜。
  2. 使用实验室抹布或纸巾的角落清除细胞颗粒中残留的任何液体。足够的液体应该保留，使颗粒形成与牙膏的稠度相似的糊状物。它应该足够薄，可以吸入 20 μL 移液头。
  3. 细胞颗粒的吸气2~3μL，并将其沉积在膜载体上。完全填充膜载体的井，使表面张力在顶部产生一个轻微的圆顶，但液体不会溢出井中。不应存在气泡。
  4. 将膜托架滑入墨盒并固定。将墨盒放入已准备和注底的 HPF 机器中，然后按"开始"进行冻结。
  5. 检查温度与时间和压力与时间图，以验证压力达到 2100 bar，温度在 200 ms 内达到 -196 °C，并且两个参数在 600 ms 测量中保持稳定。
  6. 重复步骤 3.3 至 3.5，直到使用细胞颗粒或冻结所需数量的样品。
  7. 保持墨盒浸入LN2，从墨盒中取出每个膜载体，放入塑料胶囊，并将塑料胶囊放入充满LN2的低温瓶中。
    注: 协议可能在此处暂停。带有样品的低温瓶可以储存在LN2 dewar的低温罐或冷冻箱中。

4. 冷冻替代

注意:使用液氮时，请使用适当的安全程序和个人防护设备。此外，步骤4中使用的许多化学品都是有毒的，包括单宁酸、四氧化二铵和醋酸铀。这些化学品必须按照适当的安全程序进行处理，并作为危险化学品废物进行处置。

  1. 用 LN2填充自动冷冻替换单元。使温度达到-90°C。
  2. 准备 FS 组合 1 并开始 FS。
    1. 在化学罩中，将0.2%的单宁酸（w/v）和5%DI水中的丙酮和等分1 mL的溶液制备成低温瓶。放入 LN2进行冻结。
    2. 将 FS 混合 1 小瓶和含有冷冻细胞颗粒的冷冻瓶放入 FS 单元的样品室中。将含有膜载体的内胶囊从 LN2小瓶转移到含有 FS Mix 1 的相应小瓶中。
    3. 启动 FS 协议，第一步是在 -90°C 时 24 小时。24小时后，暂停FS，用已冷却至-90°C的丙酮清洗样品3次5分钟。
  3. 准备 FS 组合 2 和完整的 FS
    注意:四氧化二氮是一种剧毒和氧化的化学品，只能由经过培训的人员根据既定的安全规程处理。必须遵守含有含二氧化硅溶液的储存和处置协议，以及使用三氧化二氮的实验室区域的标签。四氧化二氮应在化学罩中处理，配备个人防护设备，包括眼部保护、提供全臂保护的实验室涂层、双 Nitrile 手套和可选的呼吸器。
    1. 在化学罩中，在丙酮中制备1%的四氧化二氮、0.2%醋酸二铵和5%DI水溶液。将每个样品的1 mL等液放入低温瓶中，并置于LN2中进行冷冻。
      注: 可制备和储存单宁酸（丙酮中的 10% w/v）、四氧化二氮（丙酮中的 10% w/v）和乙酸乙酸乙烯（甲醇中的 8% w/v）的库存溶液，并将其储存在 LN2 dewar 中的低温瓶中，以方便 FS 混合料的制备。
    2. 将带有 FS 混合 2 的冷冻瓶放入 FS 单元中，并将胶囊从第三个丙酮洗涤液转移到 FS 混合 2 小瓶中。在FS Mix 2中孵育72小时，在-90°C下孵育，随后在12-18小时内逐渐变暖至0°C。
  4. 将温度保持在 0°C，用刚打开的瓶子中预冷却的丙酮洗 3 次 30 分钟。

5. 树脂渗透和嵌入

注意:此处使用的树脂（参见材料表）在聚合前是有毒的，应采用适当的安全程序和个人防护设备进行处理。任何未聚合的树脂都应作为危险化学品废物处理。

  1. 从新打开的瓶子中溶解在丙酮中的树脂浓度增加，潜入样品中。根据制造商的指示，在塑料烧杯中制备树脂组分 A、B 和 D 的混合物，并在 0°C 下孵育样品浓度:2%、4% 和 8%，每次 2 小时。在室温下，孵育15%、30%、60%、90%和100%树脂，每次4小时。在分量A、B、C和D的混合物中孵育4小时。
  2. 将带细胞颗粒面的膜载体向上放入扁平嵌入模具中，并填充树脂（A、B、C 和 D）。此时可以将样品的纸标签添加到井中。
  3. 在60°C的烤箱中聚合24-36小时。
    注: 聚合后可以暂停该协议。
  4. 从模具中取出方块，让冷却。要去除膜载体，首先将样品放在超微缩体的垂直夹头中，以便放大放大。通过在膜载体上涂抹液氮以将金属与塑料分离，并使用剃刀刀片将树脂切掉膜载体周围的树脂，从而将膜载体与块分离。分离后，轻轻提起膜载体，将细胞颗粒圆顶留在块表面。
  5. 将外露的细胞颗粒朝上放置在比第一个模具稍深的扁平嵌入模具中，然后填充树脂。在60°C下聚合24~36小时。
    注: 聚合后可以暂停该协议。

6. 分段

  1. 使用剃刀刀片修剪细胞颗粒周围的块。然后，将块放在超微缩体切片臂上的样品夹头中。使用玻璃或钻石刀，将方块修剪成与细胞颗粒密切相关的梯形形状。
  2. 使用玻璃或金刚石刀获取细胞颗粒的 90 nm 超薄部分。
  3. 在 TEM 网格上选取部分的带状。仿金属涂层铜槽栅格（1 x 2 mm2插槽）可用于成像串行部分。通过在一张滤纸上涂抹边缘来干燥网格，并存储在 TEM 网格存储盒中。
    注: 切片后可以暂停该协议。

7. TEM 成像

  1. 将网格安装在 TEM 支架上，然后放入显微镜中。我们通常使用 Tecnai T12 在 80 kV 下筛选低温APEX样品。使用 APEX2 标记获取感兴趣的细胞和亚细胞结构的图像。
  2. 如果需要，通过使用铅染色来获得额外的膜对比度。有关非后染色样本（图 2I+K）和铅染色后样本（图 2A+H）的比较，请参阅图 2。
    1. 在一滴稀氯化钠溶液（±1.5 mM）上浮动干燥网格部分，每次2次，每次1分钟，然后1倍10分钟。
    2. 在Sato的铅溶液上漂浮1分钟，在氯化钠溶液上漂浮1分钟，然后在DI水3次3次，1分钟。
      注意:铅是一种有毒化学品，应采用适当的安全程序和个人防护设备进行处理。含有铅的溶液应作为危险化学品废物处理。
  3. 图为 TEM 上的后染色样本。
    注:在 TEM 的传统样品制备中，铅对比步骤在 TEM 成像之前执行。但是，建议对低温APEX样品，首先对非对比样品进行成像。这确保了标签上的信号能够通过与较轻染色的细胞结构形成强对比度而轻松定位。对于许多样品，无需进一步染色;但是，如果需要额外的膜对比度，可以执行铅染色后（步骤 7.2）和样品重新成像。

结果

为了将使用cryoAPEX方法的超结构保存与传统固定和脱水进行比较，我们制备了样品，其中内质视网膜膜（ERM;ER膜）肽被APEX2标记并转染成HEK-293T细胞。ERM-APEX2 对 ER 的细胞质面进行本地化，并将 ER 结构重塑为形态上截然不同的结构，称为组织平滑 ER （OSER） 34、42、43 。OSER 形态包括光滑、平行、密集堆叠膜的区域，这些膜是比较...

讨论

此处介绍的 CryoAPEX 协议提供了一种可靠的方法来描述细胞环境中膜蛋白的定位。使用基因编码的APEX2标签不仅提供感兴趣的蛋白质的精确定位，而且使用低温和低温脱水为周围的细胞超结构提供了出色的保存和染色。综合起来，这些方法是一个强大的工具，用于在其亚细胞上下文中高精度地本地化蛋白质。

该方法的症结在于，传统TEM方法制备后超结构损失主要来自脱水步骤?...

披露声明

提交人声明没有利益冲突。

致谢

这里描述的协议源于森古普塔等人发表的《细胞科学杂志》，132 （6）， jcs222315 （2019）48。这项工作得到了国家卫生研究院的R01GM10092（至S.M.）和AI081077（R.V.S.）的资助，来自印第安纳州临床和转化科学研究所的CTSI-106564（至S.M.）和普渡大学炎症、免疫学和传染病研究所的PI4D-209263（至S.M.）。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrateSigma-AldrichD5637-1G
Acetone (Glass Distilled)Electron Microscopy Sciences10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 ccElectron Microscopy Sciences60952
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mLVWR82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resinSigma-Aldrich44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964Sigma-Aldrich44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)Sigma-Aldrich44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component DSigma-Aldrich44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mmElectron Microscopy Sciences70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mmElectron Microscopy Sciences70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium SupplementCorning355104
Glass Knife Boats, 6.4 mmElectron Microscopy Sciences71008
Glass KnifemakerLeica MicrosystemsEM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences16120
HEK 293 CellsATCCCRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer SystemLeica MicrosystemsEM PACT2Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% SolutionFisher Scientific50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mmMager Scientific16707898
Osmium Tetroxide, crystallineElectron Microscopy Sciences19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure GradeVWR97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mmMager Scientific16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support filmElectron Microscopy SciencesFF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4Electron Microscopy Sciences102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)Avantor Macron Fine Chemicals7708-10
Tannic AcidElectron Microscopy Sciences21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mmVWR25382-166
Ultra Glass Knife StripsElectron Microscopy Sciences71012
UltramicrotomeLeica MicrosystemsEM UC7
Uranyl Acetate DihydrateElectron Microscopy Sciences22400

参考文献

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