JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, apex2 etiketli membran proteininin en iyi korunmuş hücre ultrayapısı içinde iletim elektron mikroskobu ile lokalize edilebildiği kriyoAPEX yöntemini açıklar.

Özet

Sinyal iletimi ve membran ticareti gibi önemli hücresel olaylar hücre kompartmanları içinde uygun protein konumuna dayanır. Proteinlerin kesin hücre altı lokalizasyonunu anlamak birçok biyolojik sorunun yanıtlanması için önemlidir. Yeterli hücresel koruma ve boyama ile birlikte protein lokalizasyonunu belirlemek için sağlam bir etiket arayışı tarihsel olarak zor olmuştur. Elektron mikroskobu (EM) görüntülemedeki son gelişmeler, hücresel koruma ve etiket hedef proteinlerini artırmak için birçok yöntem ve stratejinin geliştirilmesine yol açmıştır. Nispeten yeni peroksidaz bazlı genetik etiket, APEX2, klonlanabilir EM-aktif etiketleri umut verici bir liderdir. İletim elektron mikroskobu (TEM) için örnek hazırlama da son yıllarda yüksek basınç donma (HPF) ve düşük sıcaklık dehidratasyon ve donma ikamesi (FS) ile boyama ile cryofixation gelişiyle gelişmiştir. HPF ve FS, TEM görüntüleme için hücresel ultrayapının mükemmel korunmasını sağlar, vitreus örneklerinin doğrudan kriyo-görüntülemesi için ikinci sıradadır. Burada HPF ve FS ile APEX2 etiketinin kullanımını birleştiren cryoAPEX yöntemi için bir protokol salıyoruz. Bu protokolde, ilgi bir protein APEX2 ile etiketlenir, ardından kimyasal fiksasyon ve peroksidaz reaksiyonu. Oda sıcaklığında geleneksel boyama ve alkol dehidratasyon yerine, örnek kriyofixed ve FS ile düşük sıcaklıkta dehidratasyon ve boyama uğrar. CryoAPEX kullanılarak, sadece ilgi bir protein hücre altı bölmeleri içinde tespit edilebilir, ama aynı zamanda ek bilgi yapısal olarak korunmuş bir membran içinde topolojisi ile ilgili olarak çözülebilir. Bu yöntemin, bir organel lümen içindeki protein dağılım modellerini deşifre edecek ve bir organel içindeki proteinin diğer etiketlenmemiş organellere yakın bir şekilde bölümlere ayrılmasını ayırt edecek kadar yüksek çözünürlük sağlayabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, cryoAPEX usulen basit ve doku kültüründe yetişen hücreleriçin münasip. Bu teknik olarak tipik cryofixation ve dondurma ikame yöntemleri daha zor. CryoAPEX, genetik olarak etiketlenebilen herhangi bir membran proteininin TEM analizi için yaygın olarak uygulanabilir.

Giriş

Biyolojik çalışmalar genellikle hücre ve organeller içinde subsellüler protein lokalizasyonu çözme sorularını içerir. İmmünofloresan mikroskopisi protein lokalizasyonu yararlı bir düşük çözünürlüklü görünüm sağlar, ve süper çözünürlüklü görüntüleme son gelişmeler floresan etiketli proteinler için çözünürlük sınırlarını zorluyor1,2,3. Ancak, elektron mikroskobu (EM) yüksek çözünürlüklü hücresel ultrayapı görüntüleme için altın standart kalır, proteinlerin etiketleme bir sorun olmasına rağmen.

Tarihsel olarak, ultrastrüktürel protein lokalizasyonu sorularını n için çeşitli EM yöntemleri kullanılmıştır. En sık kullanılan yöntemlerden biri immünelektron mikroskobu (IEM), antijene özgü primer antikorlar ilgi proteintespit etmek için kullanılır. EM sinyali elektron yoğun parçacıklar ile konjuge sekonder antikorların uygulanması ile oluşturulur, en sık kolloidal altın4,5. Alternatif olarak, at turp peroksidaz (HRP) gibi enzimler ile konjuge antikorlar bir elektron yoğun çökelti üretmek için kullanılabilir6,7,8. IEM için ön katıştırma ve katıştırma sonrası etiketleme olarak adlandırılan iki ana yaklaşım vardır. Ön gömme IEM'de antikorlar doğrudan hücrelere tanıtılır, bu da9,10,11. Her iki adım da ultrayapıya zarar verebilir12,13. 1.4 nm nanogold ile konjuge bir antikor Fab parçası oluşan önemli ölçüde daha küçük antikorların geliştirilmesi çok nazik permeabilizasyon koşulları kullanılmasını sağlar; ancak, nanogold TEM altında doğrudan görselleştirme için çok küçük ve görünür olmak için ek geliştirme adımları gerektirir14,15,16. Katıştırma sonrası IEM'de, fiksasyon, dehidratasyon ve reşin17'yekatıştırma ile tam olarak işlenmiş hücrelerin ince kısımlarına antikorlar uygulanır. Bu yaklaşım permeabilizasyon adımı önler iken, örnek hazırlanması boyunca ilgi epitopkorunması zor18,19,20. Işık fiksasyon Tokuyasu yöntemi donma takip, kriyo-kesit, ve antikor tespiti gelişmiş epitop koruma sağlar21,22. Ancak, kriyo-ultramikrotomi teknik gereksinimleri, hem de hücrede elde edilen alt-optimal kontrast, dezavantajlarıvardır 23.

Genetik olarak kodlanmış etiketlerin kullanımı, iEM'nin ilgi proteininin saptanmasıyla ilgili birçok zorluklarını ortadan kaldırır. HrP, ferritin, ReAsH, miniSOG ve metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32dahil olmak üzere etiketleri çeşitli mevcuttur. Bunların her biri önceki yöntemlere göre avantajları vardır, ancak her biri de yaygın kullanımı engelleyen dezavantajları vardır. Bu sakıncaları ferritin etiketinin büyük boyutu sitosol HRP hareketsizlik arasında değişir, ReAsH ışık hassasiyeti, ve küçük boyutu ve metallothionein hücresel boyama ile uyumluluk eksikliği. Son zamanlarda, askorbat peroksidaz türetilen bir protein APEX233,34adlı bir EM etiketi olarak mühendislik olmuştur. Bir peroksidaz olarak, APEX2 3,3 'diaminobenzidin oksidasyon katalize edebilirsiniz,DAB),ilgi protein (az 25 nm)33,35 minimum difüzyon ile lokal EM kontrast sağlamak için osmiyum tetroksit ile reaksiyona bir çökelti üreten . Geleneksel HRP tabanlı yöntemlerin aksine, APEX2 son derece kararlıdır ve tüm hücresel bölmelerde aktif kalır33. Geleneksel EM örnek boyama ve çevredeki yapıların iyi görüntülenmesiiçin yöntemler kullanılarak TEM için numuneler işlenebilir33,34,36. Küçük boyutu, stabilitesi ve çok yönlülüğü nedeniyle APEX2 büyük potansiyele sahip bir EM etiketi olarak ortaya çıkmıştır.

Yukarıda tartışılan yaklaşımların çoğu, ultrastrüktürel koruma, cryofixation ve düşük sıcaklıklı donma-ikame sanatın mevcut durumu ile birleştirilemez veya henüz birleştirilmiştir. Böylece, doğru protein lokalizasyonunu belirlemek için membran koruma ve/veya hücre boyama eksikliğinden muzdarip olurlar. Bu, elde edilebilen verilerin çözümünü ve yorumlanmasını zorunlu olarak sınırlar. Yüksek basınç donma tarafından Cryofixation (HPF) yüksek basınçta sıvı azot örneklerinin hızlı donma içerir (~ 2,100 bar), hangi vitrifikasyon yerine sulu örneklerin kristalizasyonu neden, böylece yakın yerli devlet hücreleri koruyarak37,38,39. HPF'yi, osmiyum tetroksit ve uranyl asetat gibi tipik EM lekeleri ile birlikte asetonda düşük sıcaklık (-90 °C) dehidratasyon olan donma ikamesi (FS) takip eder. HPF ve FS birlikte geleneksel kimyasal fiksasyon üzerinde ayrı bir avantaj sağlar (eserler yol açabilir daha uzun bir süreç) ve oda sıcaklığında veya buz üzerinde alkol dehidratasyon (lipidler ve şekerlerin çıkarılmasına yol açabilir), ve böylece protein tespiti için en iyi EM etiketleri ile birleştirmek için arzu edilir.

HPF/FS'nin APEX2 etiketlemesi ile birleştirilememesinin bir nedeni, hafif kimyasal fiksasyonun dab reaksiyon uyrmacı ürününün difüzyonunu sınırlayan peroksidaz reaksiyonu için bir ön koşul olmasıdır. APEX2 çalışmalarında şimdiye kadar, fiksasyon ve peroksidaz reaksiyonu boyama ve alkol dehidratasyon için geleneksel EM yöntemleri tarafından takip edilmektedir33,36. Ancak, HPF / FS ile kimyasal fiksasyon aşağıdaki geleneksel kimyasal fiksasyon ve alkol dehidratasyon tek başına40üzerinde koruma ayrı bir avantaj sağladığı gösterilmiştir. Geleneksel TEM örneklerinde görülen ultrastrüktürel bütünlük kaybı genellikle oda sıcaklığında veya buz üzerinde alkol kullanılarak yapılır dehidratasyon daha fiksasyon daha az bağlı görünür, ve lipidler ve şekerlerin çıkarılmasına yol açabilir40,41. CryoAPEX yöntemini geliştirmek için, kimyasal fiksasyon ve peroksidaz reaksiyonunun, ardından HPF ve FS'nin, ultrayapısal koruma açısından optimum sonuç vereceğini varsaydık.

Burada, APEX2 etiketlemesini cryofixation ve freeze ikame yöntemleriyle birleştiren cryoAPEX protokolünü sıyoruz (Şekil 1). Bu basit protokol ilgi apex2 etiketli protein transfeksiyon oluşur, hücrelerin kimyasal fiksasyon, ve peroksidaz reaksiyonu. HPF ve FS daha sonra tipik reşin katıştırma ve ince kesit ler yapılır. TEM görüntüleme, bu yöntemle ultrayapının mükemmel bir şekilde korunmasını ortaya koymaktadır. Ayrıca, yüksek çözünürlüklü subsellüler lokalizasyon ve bir endoplazmik retikulum (ER) lümenal proteinin mekansal dağılımı gözlendi. Bu yöntem elektron mikroskobu analizi için hücreler de membran protein lokalizasyonu nun saptanmasında yaygın olarak yararlıdır. Elimizde, yöntem hek-293T (insan embriyonik böbrek), HeLa (insan rahim ağzı kanseri), Cos7 (Afrika yeşil maymun böbrek fibroblast) ve BHK (bebek hamster böbrek) dahil olmak üzere doku kültüründe yetiştirilen hücre hatları çeşitli için başarıyla çalıştı. Ayrıntılı talimatlar hek-293T hücreleri kullanılarak aşağıda açıklanmıştır.

Protokol

1. Hücre Kültürü ve Transfeksiyon

  1. 60 mm çapında veya daha büyük bir doku kültürü çanak üzerinde tohum HEK-293T hücreleri ve 37 °C ve% 5 CO2bir hücre kültürü kuluçka içinde% 60-90 birleştiğinde büyür.
  2. Apex2 etiketli memeli ekspresyonu ile transfect hücreleri transfeksiyon reaktifi kullanarak (Bkz. Malzemeler Tablosu)üreticinin talimatlarına göre.
  3. Transfeksiyon sonrası 12-15 h'de hücreleri bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. PBS ile hafifçe yıkayarak hücreleri bulaşıktan çıkarın. Belirli bir hücre tipi için gerekirse tripsin gibi bir dissosinasyon reaktifi kullanılabilir. Santrifüj 500 x g 5 dk bir pelet oluşturmak için.

2. Kimyasal Fiksasyon ve Peroksidaz Reaksiyonu

  1. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve oda sıcaklığında 0,1 M sodyum kacodylate tamponu olan pH 7.4'te %2 glutaraldehit (v/v) 2 mL'lik peleti yeniden askıya alın. Numuneyi buz üzerine yerleştirin ve 30 dk. Pelet için numuneyi 500 x g'de 4 °C'de 5 dk'ya yerleştirin. Bu noktadan 2.3.3 adıma kadar numune ve çözümleri buzüzerinde tutun ve 4 °C'de santrifüj gerçekleştirin.
    DİkKAT: Hem glutaraldehit hem de sodyum kacodylate tampon (arsenik içeren) toksiktir. Kullanım sırasında uygun güvenlik prosedürleri ve kişisel koruyucu ekipmanlar kullanılmalıdır. Glutaraldehit ve/veya sodyum kacodylate tampon içeren çözeltiler tehlikeli kimyasal atık olarak atılmalıdır.
  2. Pelet 3x'i 5 dk boyunca 0,1 M sodyum kacodylate tampon2 mL ile yıkayın. Bunlar ve sonraki yıkarlar için, gerekli çözeltide hücre peletini hafifçe yeniden askıya alın, 500 x g'de 5 dakika santrifüj ve supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve atın. Numune kaybını en aza indirmek için tekrarlanan peletleme ve yeniden süspansiyon adımlarıyla dikkat edilmelidir.
  3. Peroksidaz reaksiyonu yürütmek
    1. 0,1 M sodyum kacodylate tampon içinde 3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB) 1 mg/mL içeren yeni bir çözelti hazırlayın. 5-10 dakika boyunca güçlü girdap tarafından DAB çözün.
      DİkKAT: DAB toksik ve potansiyel bir karsinojendir ve uygun güvenlik prosedürleri ve kişisel koruyucu ekipmanlarla kullanılmalıdır. DAB içeren çözeltiler tehlikeli kimyasal atık olarak ele alınmalıdır.
    2. 3 mL DAB çözeltisi içinde tekrar susutarak peletyı yıkayın ve ardından 5 000 x g'da 5 dk peletleme.
    3. 5,88 mM'lik son konsantrasyonu elde etmek için hidrojen peroksit eklendiği 3 mL DAB çözeltisindeki peleti yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. Pelet çözünmez DAB reaksiyon ürün varlığını gösteren gözle görülür kahverengi renkli olur.
      NOT: DAB kuluçka süresi her örnek için optimize edilmesi gerekebilir. Renk değişimi ışık mikroskobunda izlenebilir. Deneyimlerimize göre, 15-45 dk kuluçka çoğu protein için yeterlidir. Hidrojen peroksit, yeni açılmış bir şişeden veya açıldıktan sonra iyice mühürlenmiş bir şişeden alınmalıdır.
    4. Pelet hücreleri, daha sonra 0,1 M sodyum kacodylate tampon ile 5 dakika için 2x yıkayın, Dulbecco değiştirilmiş Eagle's orta (DMEM) veya tercih edilen hücre medya bir yıkama izledi.
  4. %10 fetal sığır serumu ve %15 büyükbaş hayvan serumu içeren DMEM 'in (veya tercih edilen diğer hücre medyasının) kriyo-koruyucu çözeltisinin 500 μL'lik hücre pelletini yeniden askıya alın. Pelet tekrar, kalın kriyo-koruyucu çözeltibir pelet elde etmek için gerekirse 500 x g santrifüj hızını biraz artırarak. Peletin kuruması için yeterli sıvının kalmasını sağlayarak supernatantın çoğunluğunu atın. Hücre peletini yüksek basınç dondurma aletine taşıyın.

3. Yüksek Basınç Dondurma

  1. Yüksek basınçlı dondurucu haznesini sıvı nitrojen (LN2)ile doldurun ve numune haznesini LN2ile doldurmak için pompayı çalıştırın.
    DİkKAT: Sıvı nitrojenle çalışırken uygun güvenlik prosedürlerini ve kişisel koruyucu ekipmanı kullanın.
    NOT: Bu adımlar Leica EMPACT2 yüksek basınçlı dondurucuya özgüdir.
  2. Wick uzak bir laboratuvar silme veya kağıt havlu köşesini kullanarak hücre pelet kalan sıvı. Yeterli sıvı pelet diş macunu tutarlılık benzer bir hamur formları kalmalıdır. 20 μL'lik pipet ucuna aspire edilecek kadar ince olmalıdır.
  3. Hücre peletinin 2-3 μL'lik aspire edin ve bir membran taşıyıcısına yatırın. Membran taşıyıcısının kuyuyu tamamen doldurun, böylece yüzey gerilimi üstte hafif bir kubbe oluşturur, ancak sıvı kuyudan dökülmez. Hava kabarcıkları bulunmamalıdır.
  4. Membran taşıyıcısını kartuşa doğru kaydırın ve emniyete alanın. Kartuşun hazırve astarlanmış HPF makinesine yerleştirin ve donmak için Başlat'a basın.
  5. Basıncın 2100 bar'a ulaştığını ve sıcaklığın 200 ms içinde -196 °C'ye ulaştığını ve her iki parametrenin de 600 ms ölçüm için sabit kaldığını doğrulamak için sıcaklık ve zaman ve basınç karşılaştırması ile sıcaklık ve zaman grafikleri inceleyin.
  6. Hücre peleti kullanılana veya istenilen sayıda numune dondurulana kadar 3,3 ile 3,5 adımlarını tekrarlayın.
  7. Kartuşları LN2'yedaldırılmış tutmak, her membran taşıyıcısını kartuşundan çıkarın, plastik bir kapsüle yerleştirin ve plastik kapsülü LN2ile dolu bir kriyo-şişeye yerleştirin.
    NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Örnekleri ile kriyo-şişeler kriyo-canes veya kriyo-kutuları bir LN2 dewar saklanabilir.

4. Değiştirme dondurun

DİkKAT: Sıvı nitrojenle çalışırken uygun güvenlik prosedürlerini ve kişisel koruyucu ekipmanı kullanın. Ayrıca, adım 4 kullanılan kimyasalların çoğu toksik, tannik asit dahil, osmiyum tetroksit, ve uranyl asetat. Bu kimyasallar uygun güvenlik prosedürlerine göre işlenmeli ve tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edilmelidir.

  1. Otomatik dondurma ikame ünitesini LN2ile doldurun. Sıcaklığı -90 °C'ye getirin.
  2. FS Mix 1'i hazırlayın ve FS'yi başlatın.
    1. Kimyasal bir başlıkta, %0,2 tannik asit (w/v) ve aseton da %5 DI su ve numune başına 1 mL'lik bir çözelti hazırlayın. Donmak için LN2'ye yerleştirin.
    2. FS Mix 1 şişelerini ve donmuş hücre peletlerini içeren kriyo-şişeleri FS ünitesinin numune odasına yerleştirin. Membran taşıyıcısını içeren iç kapsülü LN2 şişesinden FS Mix 1 içeren ilgili şişeye aktarın.
    3. -90°C'de 24 saat olmak için ilk adımı 24 saat olan bir FS protokolü başlatın. 24 saat sonra FS'yi duraklatın ve -90 °C'ye soğutulmuş aseton ile numuneleri 5 dk boyunca 3 x yıkayın.
  3. FS Mix 2'yi hazırlayın ve FS'yi tamamlayın
    DİkKAT: Osmiyum tetroksit, sadece eğitimli kişiler tarafından belirlenen güvenlik protokollerine göre ele alınması gereken son derece zehirli ve oksitleyici bir kimyasaldır. Osmiyum içeren çözeltilerin depolanması ve bertaraf edilmesine yönelik protokollerin yanı sıra osmiyum tetroksitin kullanıldığı laboratuvar alanlarının etiketlenmesi de izlenmelidir. Osmiyum tetroksit göz koruması, tam kol koruması sağlayan bir laboratuvar önlüğü, çift Nitril eldiven ve isteğe bağlı solunum cihazı dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman ile kimyasal bir başlık ele alınmalıdır.
    1. Kimyasal bir başlık, % 1 osmiyum tetroksit, % 0.2 uranyl asetat ve aseton% 5 DI su çözeltisi hazırlamak. Aliquot 1 mL kriyo-şişeler içine örnek başına mL ve donmak için LN2 yer.
      NOT: Tannik asit stok çözeltileri (%10 w/v aseton), osmiyum tetroksit (%10 w/v aseton) ve uranyal asetat (%8 w/v in metanol) hazırlanabilir ve FS Karışımlarının hazırlanmasıkolaylığı için bir LN2 dewar içinde kriyo-şişelerde saklanabilir.
    2. FS Mix 2 ile kriyo-şişeleri FS ünitesine yerleştirin ve kapsülleri üçüncü aseton yıkamadan FS Mix 2 şişelerine aktarın. -90 °C'de 72 saat fs mix 2'de kuluçka, ardından 12-18 saat üzerinden 0 °C'ye kademeli ısınma.
  4. Sıcaklığı 0 °C'de tutun ve 30 dakika boyunca 3x yıkayın ve önceden soğutulmuş aseton ile yeni açılmış bir şişeden.

5. Reşin Sızma ve Katıştırma

DİkKAT: Burada kullanılan reçine (bkz. Malzemeler Tablosu)polimerizasyondan önce zehirlidir ve uygun güvenlik prosedürleri ve kişisel koruyucu ekipmanlarla kullanılmalıdır. Polimerize edilmemiş reçin tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edilmelidir.

  1. Yeni açılan bir şişeden aseton içinde çözünmüş reçin konsantrasyonları artan örnekleri sızmak. Üreticinin talimatlarına göre plastik bir kabın içinde a, b ve D reçin bileşenlerinin karışımını hazırlayın ve aşağıdaki reçin konsantrasyonlarında numuneleri kuluçkaya yatırın: 0 °C'de 2 saat için %2, %4 ve %8. Oda sıcaklığında her biri için %15, %30, %60, %90 ve %100 reçine kuluçka. A, B, C ve D bileşenlerinin karışımında 4 saat kuluçka.
  2. Hücre pelet tarafı ile membran taşıyıcıları düz gömme kalıplara yerleştirin ve rezorin (A, B, C ve D) ile doldurun. Örnekler için kağıt etiketler şu anda kuyulara eklenebilir.
  3. 24-36 saat için 60 °C'de bir fırında polimerize.
    NOT: Protokol polimerizasyondan sonra duraklatılabilir.
  4. Kalıp blokları çıkarın ve soğumaya bırakın. Membran taşıyıcısını çıkarmak için, numuneyi önce büyütme ile görüntülenebilen ultramikrotomun dikey aynasına yerleştirin. Membran taşıyıcısını, metali plastikten ayırmak için membran taşıyıcısında sıvı nitrojen inip bir kombinasyon oluşturarak ve membran taşıyıcısının etrafındaki resenin yongasını parçalamak için bir jilet kullanarak bloktan ayırın. Ayrıldığınızda, hücre pelet kubbesini bloğun yüzünde bırakarak membran taşıyıcıyı yavaşça kaldırın.
  5. İlk kalıp biraz daha derin düz bir gömme kalıp yukarı bakacak şekilde maruz hücre pelet ile blok yerleştirin ve rezorile doldurun. 24-36 saat boyunca 60 °C'de polimerize edin.
    NOT: Protokol polimerizasyondan sonra duraklatılabilir.

6. Kesitleme

  1. Bir jilet kullanarak hücre pelet etrafında blok kırpın. Daha sonra bir ultramicrotome kesit kolu na örnek chuck blok yerleştirin. Bir cam veya elmas bıçak kullanarak, hücre pelet çevreleyen bir yamuk şeklinde blok kırpın.
  2. Bir cam veya elmas bıçak kullanarak hücre pelet 90 nm ultrathin bölümleri elde edin.
  3. TEM şebekesindeki bölümlerden oluşan bir şerit seçin. Formvar kaplı bakır yuva ızgaraları (1 x 2 mm2 yuva) seri bölümlerin görüntülenmesi nde yararlıdır. Kenarı bir filtre kağıdı üzerinde lekeleyerek ızgarayı kurutun ve TEM ızgara depolama kutusunda saklayın.
    NOT: Protokol kesitten sonra duraklatılabilir.

7. TEM Görüntüleme

  1. TEM tutucusu üzerinde ızgara monte ve mikroskop içine yerleştirin. KriyoAPEX numuneleri tatmak için 80 kV'da rutin olarak Tecnai T12 kullanıyoruz. APEX2 etiketleme ile hücrelerin ve hücre altı yapıların görüntülerini edinin.
  2. İstenirse, kurşun boyama sonrası kullanarak ek membran kontrastı elde edin. Lekeli olmayan örneklerin(Şekil 2I-K) ve kurşun lekeli örneklerin karşılaştırılması için Şekil 2'yebakınız ( Şekil 2A-H).
    1. Seyreltik sodyum klorür çözeltisi (~1,5 mM), 1 dk her biri için 2x, sonra 10 dakika için 1x bir damla üzerinde float kuru ızgaraları bölüm tarafı aşağı.
    2. 1 dk. 1 dk. 1 dk için Sato kurşun çözeltisi bir damla Float ızgaraları 1 dk için sodyum klorür çözeltisi üzerinde yüzen tarafından, daha sonra DI su 3x üzerinde 1 dk. Lekeler fazla sıvı ızgaraları ve bir ızgara kutusunda saklamak.
      DİkKAT: Kurşun toksik bir kimyasaldır ve uygun güvenlik prosedürleri ve kişisel koruyucu ekipmanlar la birlikte kullanılmalıdır. Kurşun içeren çözeltiler tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edilmelidir.
  3. TEM'deki lekeli örnekler.
    NOT: TEM için geleneksel numune hazırlığında, öncü kontrast adım TEM görüntüleme öncesinde gerçekleştirilir. Ancak, kriyoAPEX örnekleri için önce kontrastsız örneklerde görüntüleme nin yapılması önerilir. Bu, etiketten gelen sinyalin daha hafif lekeli hücresel yapılarla güçlü kontrastı ile kolayca bulunabilmesini sağlar. Birçok örnek için, başka bir boyama gerekli olacaktır; ancak ek membran kontrastı isteniyorsa kurşun sonrası boyama yapılabilir (Adım 7.2) ve numune yeniden görüntülenebilir.

Sonuçlar

KriyoAPEX yöntemini kullanarak ultrayapısal korumayı geleneksel fiksasyon ve dehidratasyonla karşılaştırmak için endoplazmik retikulum membranının (ERM; ER membran) peptid APEX2 ile etiketlendi ve HEK-293T hücrelerine transfected. ERM-APEX2 ER'nin sitoplazmik yüzüne lokalize olur ve ER yapısını organize pürüzsüz ER (OSER)34,42,43olarak bilinen morfolojik olarak farklı yapılara dönüştürür. OSER morfoloji...

Tartışmalar

Burada sunulan kriyoAPEX protokolü, hücreli ortamda membran proteinlerinin lokalizasyonunu karakterize etmek için sağlam bir yöntem sağlar. Genetik olarak kodlanmış APEX2 etiketinin kullanımı sadece ilgi çekici bir proteinin kesin lokalizasyonunu sağlamakla kalmıyor, cryofixation ve düşük sıcaklıklı dehidratasyon kullanımı çevredeki hücresel ultrayapının mükemmel korunmasını ve boyanması sağlar. Bu yaklaşımlar, hücre altı bağlamında yüksek hassasiyetle bir proteini yerelleştirmek iç...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

Teşekkürler

Burada açıklanan protokol Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48tarafından yayınlanan bir yayın kaynaklanmaktadır. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden R01GM10092 (S.M.'ye) ve AI081077 (R.V.S.) hibeleri ile desteklenir. Ctsi-106564 (S.M.) Indiana Klinik ve Çeviri Bilimleri Enstitüsü ve PI4D-209263 (S.M.) Purdue Üniversitesi Enstitüsü Inflamasyon, İmmünoloji ve Bulaşıcı Hastalık için.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrateSigma-AldrichD5637-1G
Acetone (Glass Distilled)Electron Microscopy Sciences10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 ccElectron Microscopy Sciences60952
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mLVWR82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resinSigma-Aldrich44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964Sigma-Aldrich44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)Sigma-Aldrich44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component DSigma-Aldrich44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mmElectron Microscopy Sciences70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mmElectron Microscopy Sciences70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium SupplementCorning355104
Glass Knife Boats, 6.4 mmElectron Microscopy Sciences71008
Glass KnifemakerLeica MicrosystemsEM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences16120
HEK 293 CellsATCCCRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer SystemLeica MicrosystemsEM PACT2Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% SolutionFisher Scientific50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mmMager Scientific16707898
Osmium Tetroxide, crystallineElectron Microscopy Sciences19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure GradeVWR97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mmMager Scientific16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support filmElectron Microscopy SciencesFF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4Electron Microscopy Sciences102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)Avantor Macron Fine Chemicals7708-10
Tannic AcidElectron Microscopy Sciences21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mmVWR25382-166
Ultra Glass Knife StripsElectron Microscopy Sciences71012
UltramicrotomeLeica MicrosystemsEM UC7
Uranyl Acetate DihydrateElectron Microscopy Sciences22400

Referanslar

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C., Oliver, C., Jamur, M. C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A., Mueller-Reichert, T., Verkade, P. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. 111, 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E., Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L., Hajibagheri, N. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. 117, 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 156CryoAPEXmembran proteinAPEX2iletim elektron mikroskobucryofixationy ksek bas n dondurmadondurma ikamesi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır