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Resumo

Este protocolo descreve o método crioAPEX, no qual uma proteína de membrana com etiqueta APEX2 pode ser localizada por microscopia eletrônica de transmissão dentro da ultraestrutura celular idealmente preservada.

Resumo

Eventos celulares-chave como transdução de sinal e tráfico de membrana dependem da localização adequada da proteína dentro dos compartimentos celulares. Compreender a localização subcelular precisa das proteínas é, portanto, importante para responder a muitas questões biológicas. A busca por um rótulo robusto para identificar a localização de proteínas combinada com a preservação e a coloração adequadas do celular tem sido historicamente desafiadora. Os recentes avanços nas imagens de microscopia eletrônica (EM) levaram ao desenvolvimento de muitos métodos e estratégias para aumentar a preservação celular e rotular proteínas alvo. Uma tag genética relativamente nova baseada em peroxidase, APEX2, é um líder promissor em etiquetas em ativas em clones. A preparação amostral para microscopia eletrônica de transmissão (TEM) também avançou nos últimos anos com o advento da criofixação por congelamento de alta pressão (FpE) e desidratação e coloração de baixa temperatura via substituição de congelamento (FS). O HPF e o FS proporcionam excelente preservação da ultraestrutura celular para imagens TEM, perdendo apenas para direcionar a crio-imagem de amostras vívidas. Aqui apresentamos um protocolo para o método crioAPEX, que combina o uso da tag APEX2 com HPF e FS. Neste protocolo, uma proteína de interesse é marcada com APEX2, seguida de fixação química e reação peroxidase. No lugar da tradicional coloração e desidratação alcoólica à temperatura ambiente, a amostra é criofixada e sofre desidratação e coloração em baixa temperatura via FS. Usando crioAPEX, não só uma proteína de interesse pode ser identificada dentro de compartimentos subcelulares, mas também informações adicionais podem ser resolvidas em relação à sua topologia dentro de uma membrana estruturalmente preservada. Mostramos que este método pode fornecer alta resolução suficiente para decifrar padrões de distribuição de proteínas dentro de um lumen organela, e distinguir a compartimentação de uma proteína dentro de uma organela próxima a outras organelas não rotuladas. Além disso, o crioAPEX é processualmente simples e incapacitado para células cultivadas na cultura tecidual. Não é mais tecnicamente desafiador do que métodos típicos de criofixação e congelamento de substituição. O CrioAPEX é amplamente aplicável para análise de TEM de qualquer proteína de membrana que possa ser geneticamente etiquetada.

Introdução

Estudos biológicos muitas vezes incluem questões de resolução de localização de proteínasubcelular dentro de células e organelas. A microscopia de imunofluorescência fornece uma visão útil de baixa resolução da localização de proteínas, e os recentes avanços na imagem de superresolução estão empurrando os limites de resolução para proteínas fluorescentesmarcadas 1,2,3. No entanto, a microscopia eletrônica (EM) continua sendo o padrão-ouro para a ultraestrutura celular de alta resolução por imagem, embora a rotulagem de proteínas seja um desafio.

Historicamente, vários métodos EM têm sido usados para abordar questões de localização de proteínas ultraestruturais. Um dos métodos mais utilizados é a microscopia imunoeletrônica (IEM), onde anticorpos primários específicos de antígeno são usados para detectar a proteína de interesse. O sinal EM é gerado pela aplicação de anticorpos secundários conjugados com partículas densas eletrônicas, mais comumente ouro coloidal4,5. Alternadamente, anticorpos conjugados com enzimas como peroxidase de rabanete de cavalo (HRP) podem ser usados para produzir um precipitado elétron-denso6,7,8. Existem duas abordagens principais para o IEM, denominada rotulagem pré-incorporação e post-incorporação. Na pré-incorporação do IEM, os anticorpos são introduzidos diretamente nas células, o que requer fixação de luz e permeabilização das células9,10,11. Ambas as etapas podem danificar a ultraestrutura12,13. O desenvolvimento de anticorpos significativamente menores que consistem em um fragmento fab anticorpo conjugado com nanogold de 1,4 nm permite que condições muito suaves de permeabilização sejam usadas; no entanto, o nanogold é muito pequeno para visualização direta TEM e requer passos adicionais de aprimoramento para se tornar visível14,15,16. No IEM pós-incorporação, os anticorpos são aplicados em finas seções de células que foram totalmente processadas por fixação, desidratação e incorporação em resina17. Embora essa abordagem evite a etapa de permeabilização, preservar o epítopo de interesse ao longo da preparação da amostra é desafiador18,19,20. O método tokuyasu de fixação de luz seguido de congelamento, seção crio-seccional e detecção de anticorpos fornece melhor preservação de epitope21,22. No entanto, os requisitos técnicos da crio-ultramicrotomia, bem como o contraste abaixo do ideal alcançado na célula, são desvantagens23.

O uso de tags geneticamente codificadas elimina muitas das dificuldades do IEM relacionadas à detecção da proteína de interesse. Estão disponíveis uma variedade de tags, incluindo HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG e metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Cada um deles tem vantagens em relação aos métodos anteriores, mas cada um também tem desvantagens impedindo o uso generalizado. Essas desvantagens vão desde a inatividade de HRP no citosol até o grande tamanho da tag de ferritina, sensibilidade à luz do ReAsH, e tamanho pequeno e falta de compatibilidade com a coloração celular de metallothioneina. Recentemente, uma proteína derivada da peroxidase ascorbate foi projetada como uma tag EM, chamada APEX233,34. Como peroxidase, o APEX2 pode catalisar a oxidação de 3,3' diaminobenzidina (DAB), produzindo um precipitado que reage com tetróxido de osmômio para fornecer contraste EM local com difusão mínima da proteína de interesse (menos de 25 nm)33,35. Ao contrário dos métodos tradicionais baseados em HRP, o APEX2 é extremamente estável e permanece ativo em todos os compartimentos celulares33. As amostras podem ser processadas para TEM usando a coloração tradicional da amostra EM e métodos que permitem uma boa visualização das estruturas circundantes33,34,36. Devido ao seu pequeno tamanho, estabilidade e versatilidade, a APEX2 emergiu como uma tag EM com grande potencial.

Muitas das abordagens discutidas acima não podem ser ou ainda não foram combinadas com o estado atual da arte em preservação ultraestrutural, criofixação e substituição de congelamento de baixa temperatura. Assim, sofrem com a falta de preservação da membrana e/ou coloração celular para determinar a localização precisa das proteínas. Isso limita necessariamente a resolução e interpretação dos dados que podem ser obtidos. A criofixação por congelamento de alta pressão (HPF) envolve o congelamento rápido de amostras em nitrogênio líquido a uma alta pressão (~2.100 bar), o que causa vitrificação em vez de cristalização de amostras aquosas, preservando assim células em um estado quase nativo37,38,39. O HPF é seguido por substituição de congelamento (FS), uma desidratação de baixa temperatura (-90 °C) em acetona combinada com incubação com manchas típicas em como tetróxido de osmó e acetato de uranyl. HPF e FS juntos fornecem uma vantagem distinta sobre a fixação química tradicional (um processo mais longo que pode levar a artefatos) e desidratação alcoólica à temperatura ambiente ou no gelo (o que pode levar à extração de lipídios e açúcares), e, portanto, são desejáveis para combinar com as melhores tags EM para detecção de proteínas.

Uma das razões pelas quais o HPF/FS não foi combinado com a rotulagem APEX2 é que a fixação química leve é um pré-requisito para a reação peroxidase, limitando a difusão do produto de reação DAB. Nos estudos da APEX2 até agora, a fixação e a reação peroxidase são seguidas pelos métodos tradicionais em para coloração e desidratação alcoólica33,36. No entanto, mostrou-se que após a fixação química com o HPF/FS fornece uma vantagem distinta na preservação sobre a fixação química tradicional e a desidratação do álcool sozinha40. A perda de integridade ultraestrutural vista em amostras tradicionais de TEM parece menos ligada à fixação do que à desidratação, que normalmente é feita usando álcool à temperatura ambiente ou no gelo, e pode levar à extração de lipídios e açúcares40,41. Para desenvolver o método crioAPEX, suporam que a fixação química e a reação peroxidase, seguida séfeio e FS, produziriam um resultado ideal em termos de preservação ultraestrutural.

Aqui apresentamos o protocolo crioAPEX, que combina marcação APEX2 com métodos de criofixação e congelamento de métodos de substituição(Figura 1). Este protocolo simples consiste na transfecção de uma proteína de interesse apex2 marcada, fixação química das células e reação peroxidase. HPF e FS são então realizados seguidos de incorporação típica de resina e secção fina. A imagem TEM revela excelente preservação da ultraestrutura usando esse método. Além disso, observou-se localização subcelular de alta resolução e distribuição espacial de uma proteína lumenal de retículo endoplasmático (ER). Este método é amplamente útil para detecção da localização da proteína da membrana dentro das células para análise de microscopia eletrônica. Em nossas mãos, o método tem trabalhado com sucesso para uma variedade de linhas celulares cultivadas na cultura tecidual, incluindo HEK-293T (rim embrionário humano), HeLa (câncer cervical humano), Cos7 (fibroblasto renal de macaco verde africano) e BHK (rim de hamster bebê). Instruções detalhadas são descritas abaixo usando células HEK-293T.

Protocolo

1. Cultura Celular e Transfecção

  1. As células HEK-293T de sementes em um prato de 60 mm de diâmetro ou cultura tecidual maior e crescem para 60% a 90% de confluência em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% de CO2.
  2. Células transfect com plasmídeos de expressão mamífero com apex2 com marca ção de forma ativa da transfecção usando reagente transfection (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Às 12 h e 15 h após a transfecção, lave células uma vez com soro lona tampão de fosfato (PBS). Remova as células do prato lavando suavemente com PBS. Um reagente dissociante, como a trippsina, pode ser usado se necessário para um determinado tipo de célula. Centrífuga a 500 x g por 5 min para formar uma pelota.

2. Fixação Química e Reação Peroxidase

  1. Remova cuidadosamente o supernatant e resuspenda a pelota em 2 mL de 2% glutaraldeído (v/v) em 0,1 M tampão cacodylate de sódio, pH 7.4, em temperatura ambiente. Coloque a amostra no gelo e incuba por 30 min. Pelota a amostra a 500 x g por 5 min a 4 °C. Deste ponto até a etapa 2.3.3, mantenha a amostra e as soluções no gelo e realize a centrífuga a 4°C.
    ATENÇÃO: Tanto o glutaraldeído quanto o tampão cacodylate de sódio (contendo arsênico) são tóxicos. Os procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual devem ser utilizados durante o manuseio. Soluções contendo glutaraldeído e/ou tampão cacodylate de sódio devem ser descartadas como resíduos químicos perigosos.
  2. Lave a pelota 3x por 5 min com 2 mL de 0,1 M tampão de cacodylate de sódio. Para estas, bem como lava-louças subsequentes, suspenda suavemente a pelota celular na solução necessária, em seguida, centrífuga por 5 min a 500 x g e remover cuidadosamente e descartar o supernatant. Deve-se tomar cuidado com as repetidas etapas de pelotização e resuspensão, a fim de minimizar a perda amostral.
  3. Realizar a reação peroxidase
    1. Prepare uma nova solução contendo 1 mg/mL de 3,3'-diaminobenzidina tetraclorato (DAB) em 0,1 M tampão de catequeiro de sódio. Dissolva o DAB por vórtice vigorosa por 5-10 min.
      ATENÇÃO: O DAB é tóxico e um potencial cancerígeno e deve ser tratado com procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual. As soluções que contenham da DAB devem ser tratadas como resíduos químicos perigosos.
    2. Lave pelotas resuspendendo em 3 mL de solução DAB seguida de pelotas a 500 x g por 5 min.
    3. Resuspender a pelota em solução DAB de 3 mL à qual o peróxido de hidrogênio foi adicionado para alcançar uma concentração final de 5,88 mM. Incubar por 30 min na temperatura do quarto. A pelota fica visivelmente de cor marrom indicando a presença do produto de reação insolúvel da DAB.
      NOTA: O tempo de incubação do DAB pode precisar ser otimizado para cada amostra. A mudança de cor pode ser monitorada no microscópio de luz. Em nossa experiência, uma incubação de 15 a 45 min é adequada para a maioria das proteínas. O peróxido de hidrogênio deve ser obtido a partir de uma garrafa recém-aberta ou uma que foi mantida bem lacrada após a abertura.
    4. Contine as células, depois lave 2x por 5 min com tampão de cacodylate de sódio de 0,1 M, seguido por uma lavagem no meio modificado da Águia de Dulbecco (DMEM) ou mídia celular de escolha.
  4. Resuspender a pelota celular em 500 μL de uma solução crio-protetora de DMEM (ou outra mídia celular escolhida) contendo 10% de soro bovino fetal e 15% de albumina de soro bovino 15%. Pelota novamente, aumentando ligeiramente a velocidade de centrífuga de 500 x g se necessário para alcançar uma pelota na espessa solução crio-protetora. Descarte a maioria do supernatante, garantindo que reste líquido suficiente para que a pelota não seque. Transporte a pelota celular para o instrumento de congelamento de alta pressão.

3. Congelamento de alta pressão

  1. Encha o reservatório congelador de alta pressão com nitrogênio líquido (LN2)e inicie a bomba para encher a câmara de amostra com LN2.
    ATENÇÃO: Use procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual ao trabalhar com nitrogênio líquido.
    NOTA: Estas etapas são específicas para o congelador de alta pressão Leica EMPACT2.
  2. Afaste qualquer líquido restante da pelota celular usando o canto de um lenço de laboratório ou toalha de papel. O líquido suficiente deve permanecer para que a pelota forme uma pasta semelhante na consistência à pasta de dente. Deve ser fino o suficiente para ser aspirado em uma ponta de tubo de 20 μL.
  3. Aspirar 2-3 μL da pelota celular e depositá-la em um portador de membrana. Encha completamente o poço do portador da membrana, para que a tensão superficial crie uma leve cúpula em cima, mas o líquido não derrama do poço. Nenhuma bolha de ar deve estar presente.
  4. Deslize o porta-membrana para dentro do cartucho e proteja. Coloque o cartucho na máquina HPF que foi preparado e preparado, e pressione comece a congelar.
  5. Inspecione a temperatura versus tempo e a pressão versus gráficos de tempo para verificar se a pressão atingiu 2100 barras e a temperatura chegou a -196 °C dentro de 200 ms, e ambos os parâmetros permaneceram estáveis para os 600 ms de medição.
  6. Repita as etapas de 3,3 a 3,5 até que a pelota celular tenha sido usada ou o número desejado de amostras tenha sido congelado.
  7. Mantendo os cartuchos imersos em LN2,remova cada porta-membrana de seu cartucho, coloque em uma cápsula de plástico e coloque a cápsula de plástico em um crio-frasco cheio de LN2.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os crio-frascos com amostras podem ser armazenados em uma deguerra LN2 em crio-canas ou crio-caixas.

4. Substituição de congelamento

ATENÇÃO: Use procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual ao trabalhar com nitrogênio líquido. Além disso, muitos dos produtos químicos utilizados na etapa 4 são tóxicos, incluindo ácido tânnico, tetróxido de osmio e acetato de uranyl. Esses produtos químicos devem ser manuseados de acordo com os procedimentos de segurança adequados e descartados como resíduos químicos perigosos.

  1. Preencha a unidade automatizada de substituição de congelamento com LN2. Leve a temperatura para -90 °C.
  2. Prepare o FS Mix 1 e comece a FS.
    1. Em uma capa química, prepare uma solução de 0,2% de ácido tânnico (w/v) e 5% de água DI em acetona e alíquota 1 mL por amostra em crio-frascos. Coloque em LN2 para congelar.
    2. Coloque os frascos FS Mix 1 e os crio-frascos contendo as pelotas de células congeladas na câmara amostral da unidade FS. Transfira a cápsula interna contendo o porta-membrana do frasco LN2 para o frasco correspondente contendo FS Mix 1.
    3. Inicie um protocolo de FS com seu primeiro passo sendo 24 h a -90°C. Após as 24 horas, pausa ras, e lave as amostras 3x por 5 min com acetona que foi resfriado para -90 °C.
  3. Prepare fs mix 2 e fs completo
    ATENÇÃO: O tetróxido de osmio é um produto químico altamente tóxico e oxidante que só deve ser manuseado por indivíduos treinados de acordo com protocolos de segurança estabelecidos. Devem ser seguidos protocolos para armazenamento e descarte de soluções contendo odômio, bem como rotulagem de áreas de laboratório onde o tetróxido de osmio está em uso. O tetróxido de osmio deve ser manuseado em uma capa química com equipamentos de proteção individual, incluindo proteção ocular, um jaleco que fornece proteção completa do braço, luvas de nitrile duplas e um respirador opcional.
    1. Em uma capa química, prepare uma solução de 1% de tetróxido de osmômio, acetato de uranyl de 0,2% e 5% de água DI em acetona. Aliquot 1 mL por amostra em crio-frascos e coloque em LN2 para congelar.
      NOTA: As soluções de estoque de ácido tânico (10% w/v na acetona), tetróxido de osmio (10% w/v na acetona) e acetato uranyl (8% w/v no metanol) podem ser preparadas e armazenadas em crio-frascos em uma guerra de LN2 para facilitar a preparação das FS Mixes.
    2. Coloque os crio-frascos com FS Mix 2 para a unidade FS e transfira as cápsulas da terceira lavagem acetona para os frascos FS Mix 2. Incubar no FS Mix 2 por 72 h a -90 °C, seguido pelo aquecimento gradual para 0 °C acima de 12-18 h.
  4. Mantenha a temperatura em 0 °C e lave 3x por 30 min com acetona pré-resfriada de uma garrafa recém-aberta.

5. Infiltração de Resin e Incorporação

ATENÇÃO: A resina utilizada aqui (ver Tabela de Materiais) é tóxica antes da polimerização, e deve ser tratada com procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual. Qualquer resina não polimerizada deve ser descartada como resíduos químicos perigosos.

  1. Infiltrar-se nas amostras com concentrações crescentes de resina dissolvidas em acetona de uma garrafa recém-aberta. Prepare uma mistura de componentes de resina A, B e D em um béquer plástico de acordo com as direções do fabricante, e incuba amostras nas seguintes concentrações de resina: 2%, 4% e 8% para 2h cada a 0°C. Incubar em 15%, 30%, 60%, 90%, e 100% de resina para 4h cada uma à temperatura ambiente. Incubar por 4 h em uma mistura de componentes A, B, C e D.
  2. Coloque os portadores de membrana com o lado da pelota celular em moldes de incorporação plana e encha com resina (A, B, C e D). Os rótulos de papel das amostras podem ser adicionados aos poços neste momento.
  3. Polimerize em um forno a 60 °C por 24-36 h.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado após a polimerização.
  4. Retire os blocos do molde e deixe esfriar. Para remover o porta-membrana, coloque primeiro a amostra no mchuck vertical do ultramicrotome onde pode ser visualizada com ampliação. Separe o porta-membrana do bloco por uma combinação de nitrogênio líquido no porta-membrana para separar o metal do plástico e usar uma lâmina de barbear para cortar a resina ao redor do porta-membrana. Quando separado, levante suavemente o porta-membrana deixando a cúpula da pelota celular na face do bloco.
  5. Coloque o bloco com a pelota de célula exposta voltada para cima em um molde de incorporação plana que é ligeiramente mais profundo que o primeiro molde, e encha com resina. Polimerize a 60 °C por 24-36 h.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado após a polimerização.

6. Seccional

  1. Corte o bloco ao redor da pelota celular usando uma lâmina de barbear. Em seguida, coloque o bloco no mandril de amostra no braço seccional de um ultramicrotome. Usando um vidro ou uma faca de diamante, corte o bloco em uma forma trapezoidal ao redor da pelota celular.
  2. Obtenha 90 nm seções ultrafinas da pelota celular usando um vidro ou faca de diamante.
  3. Pegue uma fita de seções em uma grade TEM. As grades de caça-níqueis revestidas de formvar (slot de 1 x 2 mm2) são úteis para seções de série de imagem. Seque a grade manchando a borda em um pedaço de papel filtro e armazene em uma caixa de armazenamento de grade TEM.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado após a secção.

7. Tem Imagem

  1. Monte a grade no suporte tem e coloque no microscópio. Usamos rotineiramente um Tecnai T12 a 80 kV para triagem de amostras crioAPEX. Adquirir imagens de células e estruturas subcelulares de interesse com rotulagem APEX2.
  2. Se desejar, obtenha contraste de membrana adicional pelo uso de chumbo pós-coloração. Consulte a Figura 2 para comparação de amostras não manchadas(Figura 2I-K) e leve amostras pós-manchadas(Figura 2A-H).
    1. Flutue grades secas de lado para baixo em uma gota de solução diluída de cloreto de sódio (~1,5 mM), 2x por 1 min cada, depois 1x por 10 min.
    2. Grades flutuantes em uma gota da solução de chumbo de Sato por 1 min. Lave flutuando na solução de cloreto de sódio 3x por 1 min, em seguida, na água DI 3x por 1 min. Blot excesso de líquido das grades e armazenar em uma caixa de grade.
      ATENÇÃO: O chumbo é um produto químico tóxico e deve ser tratado com procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual. Soluções contendo chumbo devem ser descartadas como resíduos químicos perigosos.
  3. Imagem amostras pós-manchadas no TEM.
    NOTA: Na preparação tradicional da amostra para TEM, o passo contrastante de chumbo é realizado antes da imagem TEM. No entanto, recomenda-se que para amostras crioAPEX, a imagem seja realizada primeiro em amostras não contrastadas. Isso garante que o sinal da tag possa ser facilmente localizado pelo seu forte contraste com as estruturas celulares mais levemente manchadas. Para muitas amostras, não será necessária mais manchas; no entanto, se for desejado contraste adicional de membrana, a pós-coloração do chumbo pode ser realizada (Passo 7.2) e a amostra re-imaged.

Resultados

Para comparar a preservação ultraestrutural utilizando o método crioAPEX com fixação e desidratação tradicionais, preparamos amostras em que uma membrana retícula endoplasmática (ERM; O peptídeo da membrana ER foi marcado com APEX2 e transfecdo em células HEK-293T. ERM-APEX2 localiza a face citoplasmática do PS e remodela a estrutura ER em estruturas morfologicamente distintas conhecidas como ER (OSER)34,42,43. A mor...

Discussão

O protocolo crioAPEX aqui apresentado fornece um método robusto para caracterizar a localização das proteínas da membrana dentro do ambiente celular. Não só o uso de uma tag APEX2 geneticamente codificada fornece localização precisa de uma proteína de interesse, mas o uso de criofixação e desidratação de baixa temperatura proporciona excelente preservação e coloração da ultraestrutura celular circundante. Combinados, essas abordagens são uma poderosa ferramenta para localizar uma proteína com alta prec...

Divulgações

Os autores não declaram conflito de interesses.

Agradecimentos

O protocolo aqui descrito decorre de uma publicação de Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs22315 (2019)48. Este trabalho é apoiado por subsídios R01GM10092 (para S.M.) e AI081077 (R.V.S.) dos Institutos Nacionais de Saúde, CTSI-106564 (para S.M.) do Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, e PI4D-209263 (to S.M.) do Instituto purdue university de inflamação, imunologia, imunologia e doença infecciosa.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrateSigma-AldrichD5637-1G
Acetone (Glass Distilled)Electron Microscopy Sciences10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 ccElectron Microscopy Sciences60952
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mLVWR82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resinSigma-Aldrich44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964Sigma-Aldrich44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)Sigma-Aldrich44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component DSigma-Aldrich44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mmElectron Microscopy Sciences70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mmElectron Microscopy Sciences70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium SupplementCorning355104
Glass Knife Boats, 6.4 mmElectron Microscopy Sciences71008
Glass KnifemakerLeica MicrosystemsEM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences16120
HEK 293 CellsATCCCRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer SystemLeica MicrosystemsEM PACT2Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% SolutionFisher Scientific50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mmMager Scientific16707898
Osmium Tetroxide, crystallineElectron Microscopy Sciences19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure GradeVWR97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mmMager Scientific16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support filmElectron Microscopy SciencesFF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4Electron Microscopy Sciences102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)Avantor Macron Fine Chemicals7708-10
Tannic AcidElectron Microscopy Sciences21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mmVWR25382-166
Ultra Glass Knife StripsElectron Microscopy Sciences71012
UltramicrotomeLeica MicrosystemsEM UC7
Uranyl Acetate DihydrateElectron Microscopy Sciences22400

Referências

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C., Oliver, C., Jamur, M. C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A., Mueller-Reichert, T., Verkade, P. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. 111, 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E., Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L., Hajibagheri, N. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. 117, 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

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