JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-קריואיפקס, בה חלבון ממברנה APEX2 מתויג יכול להיות מקומי על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ בתוך מבנה מיטבי משומר התא.

Abstract

מפתח אירועים סלולריים כמו התמרה אותות וסחר בקרום להסתמך על מיקום החלבון הנכון בתוך תאים סלולריים. ובכך חשוב לענות על שאלות ביולוגיות רבות באופן מדויק. החיפוש אחר תווית איתנה לזיהוי לוקליזציה של חלבון בשילוב עם שימור הסלולר נאותה וכתמים כבר מאתגרת היסטורית. ההתפתחויות האחרונות במיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) הובילו לפיתוח שיטות ואסטרטגיות רבות כדי להגביר את שימור הסלולר והתווית היעד חלבונים. Peroxidase חדש יחסית מבוסס על תג גנטי, APEX2, הוא מנהיג מבטיח בתגים EM-אקטיב cloneable. הכנה לדוגמה עבור שידור אלקטרון מיקרוסקופ (TEM) יש גם מתקדם בשנים האחרונות עם הופעתו של קריוקיבעון על ידי הקפאת לחץ גבוה (HPF) ו בטמפרטורות נמוכות התייבשות וכתמים באמצעות הקפאת החלפת (FS). Hpf ו-FS לספק שימור מעולה של מבנה האולטרסאונד הסלולרי עבור הדמיה TEM, השני רק ישיר-הדמיה ההקפאה של דגימות אינדקטור. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור שיטת ה-קריואיפקס, המשלבת את השימוש בתג APEX2 עם HPF ו-FS. בפרוטוקול זה, חלבון של עניין מתויג עם APEX2, ואחריו קיבעון כימי ואת התגובה peroxidase. במקום התייבשות כתמים ואלכוהול בטמפרטורת החדר, המדגם הוא קריוקבוע ועובר התייבשות וכתמים בטמפרטורה נמוכה באמצעות FS. באמצעות קריואיפקס, לא רק יכול להיות חלבון של עניין להיות מזוהה בתוך תאים subcellular, אבל גם מידע נוסף ניתן לפתור ביחס לטופולוגיה שלה בתוך קרום שנשמר מבחינה מבנית. אנו מראים כי שיטה זו יכולה לספק החלטה גבוהה מספיק כדי לפענח דפוסי הפצת חלבונים בתוך אורגל לומן, וכדי להבחין את מידור החלבון בתוך מאורגא אחד בסמיכות לאורגלים אחרים בלתי מסומנים. עוד, קריופיסגה היא תהליכים פשוטה וקלה לתאים גדל בתרבות הרקמה. היא אינה מאתגרת יותר מבחינה טכנית מאשר קריופיציה טיפוסית והקפאת שיטות החלפה. קריואיפקס היא ישימה באופן נרחב ניתוח TEM של כל חלבון ממברנה שניתן לתייג גנטית.

Introduction

מחקרים ביולוגיים כוללים לעתים קרובות שאלות לפתרון לוקליזציה של חלבון תת-תאי בתוך תאים ואורגלים. מיקרוסקופ immunofluorescence מספק תצוגה שימושית ברזולוציה נמוכה של לוקליזציה חלבון, וההתקדמות האחרונה בהדמיה סופר ברזולוציה דוחפים את גבולות הרזולוציה עבור מתויג פלואורוסקופים חלבונים1,2,3. עם זאת, מיקרוסקופ אלקטרוני (EM) נשאר תקן זהב עבור דימות ברזולוציה גבוהה הסלולר מבנה הנייד, למרות תיוג של חלבונים הוא אתגר.

מבחינה היסטורית, מספר שיטות EM שימשו לגישה לשאלות של לוקליזציה של חלבון ultraקונסטרוקטיבי. אחת השיטות הנפוצות ביותר היא מיקרוסקופ חיסוני (IEM), כאשר נוגדנים ספציפיים אנטיגן משמשים כדי לזהות את חלבון הריבית. האות EM מופק על ידי יישום של נוגדנים משני מצועם חלקיקי אלקטרון-צפוף, בדרך כלל הזהב4,5. לחילופין, יש להשתמש בנוגדנים עם אנזימים כגון הסוס צנון peroxidase (hrp) יכול לשמש כדי לייצר מזרז אלקטרון צפוף6,7,8. שתי גישות עיקריות קיימות עבור IEM, כינה הטבעה מראש ושלאחר הטבעה של תוויות. ב-הטבעה מראש של IEM, נוגדנים מוצגים ישירות לתוך תאים, אשר מחייבת קיבוע אור וחדירות של התאים9,10,11. שני השלבים עלולים לגרוםנזק. למבנההאולטרסאונד 12,13 פיתוח של נוגדנים קטנים באופן משמעותי המורכב של נוגדן קטע Fab מצועעם 1.4 ננומטר ננוגולד מאפשר התנאים החדירות עדין מאוד לשמש; עם זאת, ננוגולד קטן מדי להדמיה ישירה תחת TEM ומחייב שלבי שיפור נוספים להפוך לגלויים14,15,16. ב-IEM שלאחר ההטבעה, נוגדנים מוחלים על חלקים דקים של תאים אשר עובדו באופן מלא על ידי קיבוע, התייבשות, והטבעה שרף17. בעוד שגישה זו נמנעת משלב החדירות, שמירה על אפירופה של ריבית לאורך ההכנה לדוגמא היא אתגר של18,19,20. שיטת טויאסו של קיבוע האור ולאחריה הקפאה, הקפאת ההקפאה וזיהוי הנוגדן מספקים שימור אפיפי משופר של21,22. עם זאת, הדרישות הטכניות של כריתת המיקרו-בדיקת ההקפאה, כמו גם הניגודיות התת-אופטימלית שהושגה בתא, הן חסרונות23.

השימוש בתגים מקודדים גנטית מבטל רבים של הקשיים של IEM הקשורים לזיהוי של חלבון הריבית. מגוון של תגים זמינים, כולל hrp, ferritin, reash, minisog, ו מטטידור24,25,26,27,28,29,30,31,32. לכל אחד מהם יש יתרונות על פני שיטות קודמות, אך לכל אחד מהם יש חסרונות המונעים שימוש נרחב. החסרונות הללו נע בין חוסר פעילות של HRP ב ציטוסול לגודל גדול של תג ferritin, רגישות קלה של ReAsH, וגודל קטן וחוסר תאימות עם כתמים סלולריים של מטטימיום. לאחרונה, חלבון נגזר ascorbate peroxidase כבר מהונדסים כמו תג EM, בשם APEX233,34. כמו peroxidase, APEX2 יכול לזרז את החמצון של 3, 3 ' diaminobenzidine (בתוך), הפקת מזרז כי מגיב עם אוסמיום tetroxide כדי לספק ניגודיות EM המקומי עם דיפוזיה מינימלית מן החלבון של עניין (פחות מ 25 ננומטר)33,35. שלא כמו שיטות מבוססות HRP מסורתיות, APEX2 הוא יציב מאוד ונשאר פעיל בכל התאים הסלולריים33. דגימות ניתן לעבד עבור TEM באמצעות כתמים מסורתיים לדוגמה EM ושיטות המאפשרות ויזואליזציה טובה של המבנים שמסביב33,34,36. בשל גודלו הקטן, יציבותו, ו רב-תכליתיות, APEX2 התפתחה כתגית EM עם פוטנציאל גדול.

רבים מהגישות שנדונו לעיל אינן יכולות להיות או עדיין לא בשילוב עם המצב הנוכחי של האמנות בשימור בדיקת אולטרה מבנית, קריוקטיביות והקפאה בטמפרטורות נמוכות. כך, הם סובלים מחוסר שימור ממברנה ו/או כתמים תא כדי לקבוע לוקליזציה חלבון מדויק. הדבר מגביל בהכרח את הרזולוציה והפרשנות של הנתונים שניתן להשיג. קריוקיבעון על ידי הקפאת לחץ גבוה (hpf) כרוכה הקפאה מהירה של דגימות בחנקן נוזלי בלחץ גבוה (~ 2,100 bar), הגורם ויטריפיקציה ולא התגבשות של דגימות מימית, ובכך שמירה על תאים במצב קרוב-יליד37,38,39. Hpf אחריו הקפאת החלפת (FS), טמפרטורה נמוכה (-90 ° c) התייבשות אצטון בשילוב עם דגירה עם כתמי EM אופייני כגון אוסמיום tetroxide ו uranyl אצטט. HPF ו-FS יחד לספק יתרון ברור על גבי קיבעון כימי מסורתי (תהליך ארוך יותר אשר יכול להוביל חפצי אמנות) התייבשות אלכוהול בטמפרטורת החדר או על קרח (אשר יכול להוביל להפקת שומנים וסוכרים), ולכן רצוי לשלב עם תגי EM הטוב ביותר עבור זיהוי חלבון.

אחת הסיבות כי HPF/FS לא בשילוב עם תיוג APEX2 היא כי קיבעון כימי קל הוא תנאי מוקדם עבור התגובה peroxidase, הגבלת הדיפוזיה של המוצר התגובה מחיר. במחקרים APEX2 עד כה, קיבעון והתגובה peroxidase הם ואחריו שיטות EM מסורתיות לצביעת ואלכוהול התייבשות33,36. עם זאת, זה הוכח כי בעקבות קיבעון כימי עם HPF/FS מספק יתרון ברור בשימור על קיבעון כימי מסורתי התייבשות אלכוהול לבד40. הפסד של שלמות ultraקונסטרוקטיבית לראות בדוגמאות TEM מסורתיות נראה פחות מחובר קיבעון מאשר התייבשות, אשר נעשה בדרך כלל באמצעות אלכוהול בטמפרטורת החדר או על קרח, והוא יכול להוביל להפקת שומנים וסוכרים40,41. כדי לפתח את שיטת קריואיפקס, שיערו כי הקיבעון הכימי ואת התגובה peroxidase, ואחריו HPF ו-FS, היה לייצר תוצאה אופטימלית מבחינת שימור ultraקונסטרוקטיבי.

כאן אנו מציגים את פרוטוקול קריואיפקס, המשלב APEX2 תיוג עם קריוקיבוע והקפאת שיטות החלפת (איור 1). פרוטוקול פשוט זה מורכב מגלגול של חלבון APEX2 מתויג של עניין, קיבעון כימי של תאים, ואת התגובה peroxidase. HPF ו-FS מבוצעים לאחר מכן על ידי שתילת שרף אופייני והדקים. הדמיה TEM מגלה שימור מעולה של ultrastructure בנה באמצעות שיטה זו. בנוסף, לוקליזציה ברזולוציה גבוהה subcellular והפצה מרחבית של רשתית העין (ER) לומפלמיק חלבון נצפו. שיטה זו שימושית רבות לאיתור לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני. בידינו, השיטה עבדה בהצלחה עבור מגוון של קווי תאים שגדלו בתרבית רקמות, כולל HEK-293T (כליה עובריים האדם), הלה (סרטן צוואר הרחם האנושי), Cos7 (אפריקה ירוק כליות הקוף פיברוהפיצוץ), ו BHK (כליה אוגר התינוק). הוראות מפורטות מתוארות להלן באמצעות התאים HEK-293T.

Protocol

1. תרבית תאים והעברה

  1. זרעי HEK-293T תאים בקוטר 60 מ"מ או גדול יותר התרבות רקמות ולגדול ל 60% – 90% המפגש בחממה תרבות התא ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  2. תאי העברה עם הבעה מAPEX2-מתויגים באמצעות מגיב (ראו טבלת חומרים) בהתאם להנחיות היצרן.
  3. ב 12-15 h לאחר ההעברה, לשטוף את התאים פעם אחת עם מלוחים מאגור פוספט (PBS). להסיר תאים ממנה על ידי כביסה עדינה עם PBS. מגיב דיסוציאציה כגון טריפסין עשוי לשמש אם נדרש עבור סוג תא נתון. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות כדי ליצור גלולה.

2. קיבעון כימי ותגובת Peroxidase

  1. הסר בזהירות את הסופרנט והשהה מחדש את הגלולה ב 2 מ ל של 2% glutarאלדהיד (v/v) ב 0.1 M נתרן קאבאיחור במאגר, pH 7.4, בטמפרטורת החדר. לדגום את הקרח ואת הביצה במשך 30 דקות. גלולה המדגם ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. מנקודה זו עד שלב 2.3.3, לשמור על המדגם והפתרונות על קרח, ולבצע צנטריפוגה ב 4 ° c.
    התראה: הן הגלוטרלדהיד והן מאגר הנתרן הקשני (המכילים ארסן) רעילים. יש להשתמש בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי במהלך הטיפול. יש להיפטר מתמיסות המכילות גלוטרלדהיד ו/או מאגר הנתרן הכימי המכיל כפסולת כימית מסוכנת.
  2. לשטוף את הגלולה 3x עבור 5 דקות עם 2 מ ל של 0.1 M נתרן קא, המאגר המאוחר. עבור אלה, כמו גם שוטף הבאים, בעדינות מחדש את הגלולה התא בפתרון הנדרש, ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g ובזהירות להסיר ולמחוק את supernatant. יש לקחת את הטיפול באמצעות הפלטינג והשלבים החוזרים, על מנת למזער את ההפסד לדוגמה.
  3. לבצע את התגובה הperoxidase
    1. להכין פתרון טרי המכיל 1 מ"ג/mL של 3, 3 '-diaminobenzidine הטהידרוכלוריד (בתוספת) ב 0.1 M נתרן המאגר האחרון. לפזר את התוספת על ידי וורטקנג נמרץ עבור 5 – 10 דקות.
      התראה: הדבר רעיל ומסרטן פוטנציאלי, ויש לטפל בו עם נוהלי בטיחות נאותים וציוד הגנה אישי. יש להתייחס לפתרונות המכילים את הטיפול בחומר כפסולת כימית מסוכנת.
    2. לשטוף את הגלולה על ידי השעיית מחדש 3 מ ל של הפתרון לאחר מכן לאחר מכן לפלטטינג ב 500 x g עבור 5 דקות.
    3. השהה מחדש את הגלולה בתמיסת 3 מ ל שאליה מימן מי חמצן נוספה כדי להשיג ריכוז סופי של 5.88 מ"מ. מודקון עבור 30 דקות ב temp בחדר. הגלולה הופכת בצבע חום בעליל המציין את הנוכחות של המוצר מסיסים התגובה להטיפה.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב את זמן הדגירה עבור כל דוגמה. ניתן לפקח על שינוי הצבע במיקרוסקופ האור. מניסיוננו, הדגירה של 15 עד 45 דקות מספיקה עבור רוב החלבונים. תחמוצת מימן צריך להיות מושגת בקבוק נפתח טרי או אחד שנשמר היטב סגור לאחר פתיחת.
    4. גלולה את התאים, ולאחר מכן לשטוף 2x עבור 5 דקות עם 0.1 M נתרן מאגר באיחור של סודיום, ואחריו לשטוף אחד ב בינונית שונה של הנשר של דולבקה (DMEM) או תא מדיה של בחירה.
  4. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-500 μL של פתרון של הגנה על ההקפאה של DMEM (או מדיית תא אחרת של בחירה) המכילה 10% נסיוב בקר עוברי ו 15% סרום שפרה. גלולה שוב, הגדלת מעט את מהירות הצנטריפוגה מ 500 x g אם נדרש כדי להשיג גלולה בתמיסה עבה-הגנה ההקפאה. למחוק את רוב supernatant, להבטיח כי מספיק נוזל נשאר כך הגלולה לא להתייבש. להעביר את הגלולה הסלולרית. לכלי הקפאת הלחץ הגבוה

3. הקפאה בלחץ גבוה

  1. ממלאים את מאגר המקפיא בלחץ גבוה עם חנקן נוזלי (LN2) ולהתחיל את המשאבה כדי למלא את חדר המדגם עם LN2.
    התראה: השתמש בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי בעת עבודה עם חנקן נוזלי.
    הערה: צעדים אלה ספציפיים למקפיא EMPACT2 לחץ גבוה לייקה.
  2. הפתיל הרחק כל נוזל שנותר מתוך הגלולה התא באמצעות הפינה של ניגוב מעבדה או מגבת נייר. מספיק נוזל צריך להישאר כי הגלולה יוצרת הדבקה דומה בעקביות למשחת שיניים. זה צריך להיות דק מספיק כדי להיות. מואבקים לתוך התשר של 20 ליטר
  3. מנושף 2 – 3 μL של הגלולה תא ולהפקיד אותו על נושאת קרום. מלא את הבאר של נושאת הקרום לחלוטין, כך שהמתח של פני השטח יוצר כיפה קטנה למעלה, אך הנוזל אינו נשפך מתוך הבאר. אין לקיים בועות אוויר.
  4. החלק את מנשא הקרום לתוך המחסנית ואבטח. הצב את המחסנית במחשב HPF שהיה מוכן ומוכן ולחץ על התחל כדי להקפיא.
  5. בדוק את הטמפרטורה לעומת הזמן והלחץ לעומת גרפים זמן כדי לוודא כי הלחץ הגיע ל2100 בר והטמפרטורה הגיע-196 ° צ' בתוך 200 ms, ושני הפרמטרים נשארו יציבים עבור היקף 600 ms.
  6. חזור על שלבים 3.3 עד 3.5 עד שנעשה שימוש בגלולה הסלולרית או שהמספר הרצוי של הדגימות הוקפא.
  7. שמירה על מחסניות שקוע ב-LN2, להסיר כל נושאת ממברנה ממיכל הדיו שלה, מקום לתוך קפסולה פלסטיק, ולמקם את קפסולת פלסטיק לתוך בקבוקון המקפיא מלא של LN2.
    הערה: ייתכן שהפרוטוקול מושהה כאן. מבחנות ההקפאה עם דגימות ניתן לאחסן ב-LN2 דיואר במקלות ההקפאה או בקופסאות ההקפאה.

4. הקפאת ההחלפה

התראה: השתמש בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי בעת עבודה עם חנקן נוזלי. בנוסף, רבים של כימיקלים מנוצל בשלב 4 רעילים, כולל חומצה טאנית, אוסמיום tetroxide, ו uranyl אצטט. הכימיקלים הללו חייבים להיות מטופלים על פי נוהלי בטיחות נאותים ולהיפטר מפסולת כימית מסוכנת.

  1. מלא את יחידת החלפת ההקפאה האוטומטית עם LN2. העלה את הטמפרטורה ל-90 ° c.
  2. הכן את מיקס האלף והתחל ב-FS.
    1. בשכונה כימית, להכין פתרון של 0.2% חומצה טאנית (w/v) ו 5% די מים ב אצטון ו-1 mL לכל מדגם לתוך מבחנות ההקפאה. . מקום לחדרהשני כדי להקפיא
    2. מניחים את ה-FS Mix מבחנות 1 ומבחנות ההקפאה המכילות את כדורי התא הקפוא לחדר המדגם של יחידת FS. העבר את הקפסולה הפנימית המכילה את נושאת הקרום מבקבוקון LN2 לתוך הבקבוקון המתאים המכיל את FS Mix 1.
    3. התחל פרוטוקול FS עם הצעד הראשון שלו להיות 24 h ב-90 ° c. לאחר 24 h, להשהות את ה-FS, ולשטוף את דגימות 3x עבור 5 דקות עם אצטון כי כבר מקורר-90 ° c.
  3. הכנת מיקס FS 2 ו-FS שלם
    התראה: Osmium tetroxide הוא כימיקל רעיל ומחמצן מאוד כי צריך רק להיות מטופלים על ידי אנשים מאומנים על פי פרוטוקולי בטיחות הוקמה. יש לעקוב אחר הפרוטוקולים לאחסון ולסילוק הפתרונות המכילים אוסמיום, כמו גם לתיוג אזורי מעבדה שבהם אוסמיום tetroxide נמצא בשימוש. Tetroxide osmium צריך להיות מטופל בשכונה כימית עם ציוד הגנה אישית כולל הגנה על העין, מעיל מעבדה מתן הגנה מלאה בזרוע, כפפות ניטריל כפול, ו מסכת ההנשמה אופציונלי.
    1. בשכונה כימית, להכין פתרון של 1% אוסמיום tetroxide, 0.2% uranyl אצטט, ו 5% די מים ב אצטון. הפחתה 1 מ ל לכל מדגם לתוך מבחנות ההקפאה ומקום ב-LN2 להקפיא.
      הערה: פתרונות מניות של חומצה טאנית (10% w/v ב אצטון), אוסמיום tetroxide (10% w/v ב אצטון) ו uranyl אצטט (8% w/v ב מתנול) עשוי להיות מוכן ומאוחסן במבחנות in2 דיואר עבור קלות ההכנה של ה-FS Mixes.
    2. הניחו את מבחנות ההקפאה עם FS Mix 2 ליחידת ה-FS והעבירו את הקפסולות מתוך השטיפה השלישית של אצטון לתוך מבחנות ה-FS Mix 2. מודטה ב-FS Mix 2 עבור 72 h ב-90 ° c, ואחריו התחממות הדרגתית ל -0 ° c מעל 12-18 h.
  4. שמרו על טמפרטורה של 0 ° צ' ושטפו את 3x במשך 30 דקות עם אצטון מקורר מבקבוק שנפתח טרי.

5. שרף הסתננות והטבעה

התראה: השרף המשמש כאן (ראה שולחן החומרים) רעיל לפני הפילמור, ויש לטפל בו בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי. יש להיפטר משרף שאינו מסוכן. כפסולת כימית מסוכנת

  1. לחדור את הדגימות עם ריכוזים גוברת של שרף מומס של אצטון מבקבוק חדש נפתח. הכינו תערובת של מרכיבי שרף A, B, ו-D בגביע פלסטיק על פי כיווני היצרן, ודגימות דגירה בריכוזים הבאים שרף: 2%, 4%, ו 8% עבור 2 h כל אחד ב 0 ° c. מודטה ב 15%, 30%, 60%, 90%, ו 100% שרף עבור 4 h כל אחד בטמפרטורת החדר. מודטה עבור 4 שעות בתערובת של רכיבים A, B, C ו-D.
  2. מניחים את נושאות הקרום עם כדורית התא בצד לתוך תבניות הטבעה שטוח למלא עם שרף (A, B, C, D). תוויות נייר עבור הדגימות ניתן להוסיף לבארות בשלב זה.
  3. פולימל בתנור ב 60 ° c עבור 24-36 h.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר הפילמור.
  4. להסיר את גושי מהעובש ולתת מגניב. כדי להסיר את נושאת הקרום, במקום הראשון את המדגם את הצ האנכי של ultramicrotome שבו הוא יכול להיות מדמיין עם הגדלה. הפרד את נושאת הקרום מהבלוק על ידי שילוב של חנקן נוזלי על נושאת הקרום כדי להפריד את המתכת מן הפלסטיק, ושימוש להב גילוח כדי לשבב את שרף סביב נושאת הקרום. כאשר מופרדים, להסיר בעדינות את נושאת הקרום משאיר את כיפת הגלולה תא על פני הבלוק.
  5. מניחים את הבלוק עם הגלולה התא חשוף פונה כלפי מעלה בתבנית הטבעה שטוחה כי הוא מעט עמוק יותר העובש הראשון, ומילוי עם שרף. פולימל בגובה 60 ° צלזיוס בשביל 24 עד 36 שעות.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר הפילמור.

6. המשך המכירה

  1. חתוך את הבלוק סביב הגלולה התא באמצעות להב תער. ואז למקם את הבלוק במדגם צ'אק על הזרוע החוסמת של אולטרה מיקרוטום. באמצעות סכין זכוכית או יהלום, לחתוך את הבלוק לתוך הצורה טרפז מקרוב מסביב הגלולה התא.
  2. לקבל 90 ננומטר בעלי מקטעים של הגלולה תא באמצעות זכוכית או יהלום סכין.
  3. לאסוף רצועת הכלים של מקטעים על רשת TEM. Formvar-מצופה רשתות חריצי נחושת (1 x 2 מ"מ2 חריץ) שימושיים עבור מקטעים טוריים הדמיה. יבש את הרשת על ידי לחסום את הקצה על פיסת נייר סינון, ולאחסן בתיבת אחסון רשת TEM.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר הפרייתם.

7. TEM הדמיה

  1. הר את הרשת על המחזיק TEM ומקום לתוך המיקרוסקופ. אנו משתמשים באופן קבוע Tecnai T12 ב 80 kV לסינון דגימות קריואיפקס. לרכוש תמונות של תאים מבנים תת תאיים של עניין עם תיוג APEX2.
  2. אם רצונך בכך, השג ניגוד ממברנה נוסף על-ידי שימוש בהכתמים לאחר הפניה. ראו איור 2 להשוואת דגימות שאינן מוכתמות לאחר מכן (איור 2I-K) ודגימות לאחר הכתמים המובילים (איור 2א – ח).
    1. צפה רשתות יבשות מקטע-בצד למטה על טיפה של תמיסת נתרן כלוריד מדלל (~ 1.5 mM), 2x עבור 1 דקות כל אחד, ואז 1x עבור 10 דקות.
    2. הצפת רשתות על טיפת הפתרון המוביל של סאטו עבור 1 דקות. לשטוף על ידי צף על תמיסת נתרן כלוריד 3x עבור 1 דקות, לאחר מכן על המים די 3x עבור 1 דקות. כתמי נוזלים עודפים מרשתות ולאחסן בתיבת רשת.
      התראה: עופרת היא כימיה רעילה ויש לטפל בה בהליכי בטיחות נאותים ובציוד הגנה אישי. יש להיפטר מפתרונות המכילים עופרת כפסולת כימית מסוכנת.
  3. דגימות תמונה שלאחר הכתמים על TEM.
    הערה: בהכנה לדוגמה המסורתית עבור TEM, השלב המוביל מנוגדים מבוצע לפני הדמיה TEM. עם זאת, מומלץ כי עבור דגימות קריואיפקס, הדמיה מבוצעת תחילה על דגימות שאינן בניגוד. זה מבטיח כי האות מן התג ניתן למקם בקלות על ידי הניגוד החזק שלו עם מבנים סלולריים יותר מוכתם קלות. עבור דגימות רבות, לא יידרש כתמים נוספים; עם זאת, אם הניגודיות הנוספת של הממברנה רצויה, ניתן לבצע כתמים מובילים (Step 7.2) ולדגום את התמונה מחדש.

תוצאות

על מנת להשוות את שימור האולטרה-מבנית בשיטת הקריואיפקס עם קיבעון והתייבשות מסורתיים, הכנו דגימות שבהן קרום הרשתית האנדופלזמית (ה-אמ. סי; ממברנה ER) מתויג עם APEX2 ו העביר לתוך התאים HEK-293T. אה-APEX2 לאתר את הפנים cytoplasmic של er ו remodels מבנה er לתוך מבנים ברורים מורפולוגית המכונה מאורגנת חלקה ER (oser)

Discussion

פרוטוקול קריואיפקס המוצג כאן מספק שיטה איתנה לאפיון הלוקליזציה של חלבונים ממברנות בתוך הסביבה התאית. לא רק שימוש של תג APEX2 מקודד גנטית לספק לוקליזציה מדויק של חלבון של עניין, אבל השימוש קריוקיבעון בטמפרטורות נמוכות מספק שימור מעולה וכתמים של מבנה האולטרה הסלולרי המקיף. בשילוב, גישות אלה ה...

Disclosures

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

Acknowledgements

הפרוטוקול המתואר כאן נובע מפרסום על ידי Sengupta ואח ', היומן של מדע התא, 132 (6), jcs222315 (2019)48. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים R01GM10092 (כדי ס) ו AI081077 (R.V.S.) מן המכון הלאומי לבריאות, CTSI-106564 (ל ס) מתוך אינדיאנה מכון למדעי המחקר, ו PI4D-209263 (כדי ס) מהמכון האוניברסיטאי Purdue לדלקת, אימונולוגיה, ומחלות זיהומיות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrateSigma-AldrichD5637-1G
Acetone (Glass Distilled)Electron Microscopy Sciences10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 ccElectron Microscopy Sciences60952
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mLVWR82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resinSigma-Aldrich44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964Sigma-Aldrich44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)Sigma-Aldrich44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component DSigma-Aldrich44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mmElectron Microscopy Sciences70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mmElectron Microscopy Sciences70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium SupplementCorning355104
Glass Knife Boats, 6.4 mmElectron Microscopy Sciences71008
Glass KnifemakerLeica MicrosystemsEM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences16120
HEK 293 CellsATCCCRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer SystemLeica MicrosystemsEM PACT2Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% SolutionFisher Scientific50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mmMager Scientific16707898
Osmium Tetroxide, crystallineElectron Microscopy Sciences19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure GradeVWR97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mmMager Scientific16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support filmElectron Microscopy SciencesFF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4Electron Microscopy Sciences102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)Avantor Macron Fine Chemicals7708-10
Tannic AcidElectron Microscopy Sciences21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mmVWR25382-166
Ultra Glass Knife StripsElectron Microscopy Sciences71012
UltramicrotomeLeica MicrosystemsEM UC7
Uranyl Acetate DihydrateElectron Microscopy Sciences22400

References

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C., Oliver, C., Jamur, M. C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A., Mueller-Reichert, T., Verkade, P. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. 111, 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E., Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L., Hajibagheri, N. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. 117, 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156APEX2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved