تحليل الرئيسيات غير البشرية جزيرة البنكرياس استهلاك الأكسجين

Joseph  M. Elsakr; Charles Deeter; Valerie Ricciardi; Maureen Gannon

doi:10.3791/60696

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يوضح هذا البروتوكول القياس الدقيق والقابل للتكرار لاستهلاك الأكسجين في جزر البنكرياس الرئيسية غير البشرية. وتوفر تقنيات تحميل الجزيرة وطلاء الصفيحة المجهرية اطارا لقياس كفاءه التنفس في أنواع أخرى من الخزان المستزرعة.

Abstract

قياس استهلاك الأكسجين في مجموعات كرويه من الخلايا ، مثل الجزر السابقة البنكرياس الجسم الآخر ، تاريخيا كانت صعبه. ونحن نظهر قياس استهلاك جزيرة الأكسجين باستخدام ميكروبلايت 96-بئر مصممه لقياس استهلاك الأكسجين في خزان. في هذا الفحص ، يتم تغليف ألواح المجهرية كروي مع الخلية والانسجه لاصقه في اليوم السابق لفحص. نحن الاستفادة من حجم صغير من الحل لاصقه لتشجيع جزيرة الانضمام إلى الجزء السفلي من البئر فقط. في يوم الفحص, يتم تحميل 15 الجزر مباشره في قاعده كل بئر باستخدام تقنيه التي تضمن الوضع الأمثل للجزر وقياس دقيق لاستهلاك الأكسجين. يتم البحث في جوانب مختلفه من التنفس الميتوكوندريا دوائيا في الجزر الرئيسية غير البشرية, بما في ذلك التنفس المعتمد علي ATP, التنفس القصوى, وتسرب البروتون. هذا الأسلوب يسمح لنتائج متسقة وقابله للتكرار باستخدام عدد قليل من الجزر الصغيرة لكل بئر. فانه يمكن نظريا ان تطبق علي اي خزان مثقف من حجم مماثل.

Introduction

من أجل الحفاظ علي مستويات الجلوكوز في الدم العادية ، يجب ان تستشعر الخلية β البنكرياس الارتفاعات في الجلوكوز وتفرز الانسولين وفقا لذلك. يرتبط اقتران إفراز الانسولين مع مستويات الجلوكوز مباشره باستقلاب الجلوكوز وإنتاج ATP من خلال فوسفولات الاكسده المتقدريه. وهكذا, الميتوكوندريا تلعب دورا حاسما في تحفيز إفراز اقتران¹. تقييم وظيفة الميتوكوندريا خليه β يمكن ان تكشف عن العيوب التي تؤدي إلى ضعف إفراز الانسولين. يتم أيضا ربط إفراز الجلوكاجون بخلايا α البنكرياس بشكل وثيق إلى وظيفة الميتوكوندريا². علي الرغم من ان خطوط الخلايا جزيرة الخلد قد ثبت مفيده لبعض أنواع الاختبارات ، وعلم وظائف الخلايا من هذه الخلية لا تلخص بدقه وظيفة جزيرة كامله ، كما يتضح من التحفيز من إفراز الانسولين بواسطة جلوكاجون³^،⁴ وتثبيط إفراز جلوخون بالانسولين/سوماتوستاتين⁵^،⁶ في الجزر الجزيرة سليمه. وهذا يدل علي الحاجة إلى قياس استهلاك الأكسجين باستخدام الجزر كامله وسليمه.

وقد تطورت تقنيات قياس التنفس الخلوي للخلايا الجزيرة بمرور الوقت ، من استخدام الاصباغ الفلورية الحساسة للأكسجين⁷ إلى أجهزه الاستشعار الصلبة التي تقيس مباشره استهلاك الأكسجين⁸. صممت في البداية لأحاديه الطبقة ، والخلايا الملتصقة ، والتي يشيع استخدامها أنظمه لوحه ثقافة الخلايا أثبتت انها غير فعاله لجزر البنكرياس. وبما ان الجزر لا تلتزم بشكل طبيعي بالآبار ، فهي عرضه لان يتم دفعها إلى محيط الثقافة مما يؤدي إلى قياس غير دقيق لاستهلاك الأكسجين⁹. ان يكافح هذا مشكله, يختص [24-ول] لوحات مع هبوط مركزيه ان استطاع احتويت جزائر كان طورت⁹. ومع ذلك ، فان نظام اللوحات التي تبلغ 24 بئرا كان محدودا بالعدد الكبير من الجزر المطلوبة (50-80 لكل بئر) وعدد الحالات التي يمكن اختبارها في وقت واحد¹⁰. وقد تغلبت التطورات الاخيره من الصفائح الدقيقة 96 المصممة خصيصا لتحليل تدفق خارج الخلية في خزان هذه الحواجز ، مما يتيح قياس التنفس جزيرة مع 20 أو اقل من الجزر الصغيرة لكل¹⁰جيدا.

هنا ، ونحن نظهر استخدام هذا النظام لقياس استهلاك الأكسجين في الجزر من المكاك اليابانية (المكاك تهيمن) ، وهو نموذج الحيوانية مع البيولوجيا جزيرة مماثله للبشر¹¹^،¹². في هذا البروتوكول ، يتم تحليل 15 الجزر المكاك لكل بئر. في ايدينا ، 15 الجزر لكل بئر تنتج ارتفاع استهلاك الأكسجين خط الأساس من عدد اقل من الجزر ، مع تنشيط قويه وقمع التنفس استجابه للتلاعب الدوائي. ونحن نسلط الضوء علي الخطوات اللازمة للتحضير لفحص ، وسيله فعاله لتحميل متسقة من الجزر في وسط كل بئر ، والتحديات المشتركة عند تنفيذ هذا الفحص.

Protocol

1. اعداد ميكروبلايت وخرطوشه الاستشعار في اليوم السابق لتشغيل الفحص

وكانت الجزر الكبيرة معزولة من macaques اليابانية البالغ من العمر ثلاث سنوات كما وصفت سابقا¹³. هذا الأسلوب هو مشابه جدا لتلك التي تستخدم لعزل الجزر البشرية من المتبرعين جثة ، ولكن يختلف عن الفئران ، والتي غالبا ما يتم تضخيم بانكريتا مع محلول كولاجيناز في حين ان الحيوانية تحت التخدير وقبل أزاله الجهاز. وأجريت استعاده جزيرة وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية للعناية بالماشية والاستخدام (IACUC) من مركز البحوث الرئيسية الوطنية اوريغون (ONPRC) وجامعه اوريغون الصحة والعلوم ووافقت عليها IACUC ONPRC. وتتقيد الهيئة بقانون رعاية الماشية واللوائح التي تطبقها وزاره الزراعة في الولايات المتحدة وسياسة خدمه الصحة العامة المتعلقة بالرعاية الانسانيه واستخدام المختبرات وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبرات التي تنشرها المعاهد الوطنية للصحة.

اعداد ميكروبلايت كروي
1. اعداد 3 مل من محلول 0.1 M من بيكربونات الصوديوم. تصفيه تعقيم الحل. استخدمنا فلتر 0.45 μm (جدول المواد).
2. في خليه الثقافة هود ، أضافه 200 μL من الخلايا والانسجه لاصقه (جدول المواد) إلى 2.8 مل من بيكربونات الصوديوم 0.1 m. ثم ، أضافه 20 μL من هذا الحل إلى الجزء السفلي من كل بئر من 96 كروي microplate (جدول المواد). تاكد من أزاله فقاعات الهواء من طرف ماصه pipet-x ويتم تغطيه الجزء السفلي فقط من اللوحة. ويمنع طلاء الصفيحة الصغيرة الجزر من تحريك جوانب الآبار عند أضافه الادويه ومزجها في البئر اثناء الفحص.
  ملاحظه: من الضروري فقط لمعطف العديد من الآبار كما سيتم استخدامها لجزر عندما يتم تشغيل الفحص. إذا كان سيتم استخدام عدد قليل من الآبار ، يمكن تحجيم حل لاصقه الخلية بشكل مناسب. لاصقه الخلية المستخدمة في الفحص هي محلول بروتين مركب مستخرج من بلح البحر البحري. بدلا من ذلك ، يمكن ان تكون مغلفه الآبار ميكروبلايت مع 20 μL من 100 ميكروغرام/مل بولي-د-يسين.
3. احتضان لوحه في 37 درجه مئوية ، غير CO₂ حاضنه لمده ساعة واحده.
4. في بيئة معقمه ، يستنشق محلول لاصق الخلية من اللوحة. يغسل كل بئر مرتين مع 400 μL من 37 درجه مئوية المياه المعقمة باستخدام pipet متعددة القناات. السماح للهواء الجاف.
5. بعد 30-40 دقيقه ، غط الصفيحة وخزنها بين عشيه وضحيها عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
ترطيب خرطوشه المستشعر
1. في بيئة معقمه ، افتح حزمه خرطوشه المستشعر (جدول المواد) وقم بازاله المحتويات. ضع خرطوشه المستشعر راسا علي عقب بجانب لوحه الاداه المساعدة.
2. ملء كل بئر من لوحه الاداه المساعدة مع المياه المعقمة 200 μL وخفض خرطوشه الاستشعار مره أخرى إلى لوحه الاداه المساعدة. مكان تجميعها خرطوشه الاستشعار ولوحه الاداه المساعدة في 37 درجه مئوية ، غير CO₂ حاضنه بين عشيه وضحيها.
اعداد معايره
1. Aliquot 25 مل من معايره (جدول المواد) إلى أنبوب مخروطي 50 ml. وضع أنبوب في 37 درجه مئوية ، غير CO₂ حاضنه بين عشيه وضحيها.

2. بروتوكول لاعداد وسائل الاعلام ، وتحميل الجزر ، وتحميل خرطوشه الاستشعار في يوم الفحص

اعداد وسائل الاعلام
1. إلى 48.5 mL من وسائل الاعلام الاساسيه (الحد الأدنى dmem ، انظر جدول المواد) ، أضافه 500 μl كل من بيروفات الصوديوم 1 مم و 2 مم الجلوتامين. بالاضافه إلى ذلك ، أضافه 496 μL من 200 ملغ/مل الجلوكوز (التركيز النهائي من الجلوكوز في وسائل الاعلام هو 5.5 mM).
  ملاحظه: ظل تركيز الجلوكوز الأساسي ثابتا لهذه التجارب. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام الجلوكوز لتحفيز التنفس بالاضافه إلى التلاعبات الدوائية وصفت ضربه¹⁰.
2. تاكد من ان الأس الهيدروجيني هو 7.4 +/-0.1 ، وتعديل إذا لزم الأمر.
اعداد خرطوشه الاستشعار
1. خذ خرطوشه الاستشعار من الحاضنة ، وأزاله غطاء خرطوشه الاستشعار ، وتفريغ المياه من الآبار. ضع 200 مل من المعايرة قبل درجه حرارة في كل بئر واستبدال غطاء خرطوشه الاستشعار.
2. وضع خرطوشه الاستشعار مره أخرى في حاضنه لمده 1 ساعة (حتى الحاجة).
اعداد الادويه لفحص الإجهاد المتقدريه
1. افتح مجموعه اختبار الضغط (جدول المواد) وقم بازاله المحتويات. تشكل الأوراق المالية وحلول العمل للاوليغميسين ، سيانيد الكربونيل-4-(ثلاثي فلوروميثيثوكسي) فينيلهيدرازون (FCCP) ، وروتينون/انتيمايسين A (AA) علي النحو التالي.
  1. اوليغميسين: أضافه 630 μL من الوسائط المجمعة لأنبوب لجعل 100 μM الأسهم. ثم ، تمييع إلى 45 μM مع وسائل الاعلام للحصول علي تركيز الميناء (تركيز البئر النهائي بعد الحقن سيكون 4.5 μM)
  2. FCCP: أضافه 720 μL من الوسائط المجمعة إلى أنبوب لجعل 100 μM الأسهم. تمييع إلى 10 μM مع وسائل الاعلام للحصول علي تركيز الميناء (تركيز البئر النهائي سيكون 1 μM)
    ملاحظه: لا ينبغي ان يضاف الجيش الصربي البوسني و/أو المنفذ إلى وسائط الاعلام ، لان هذا يمكن ان يؤثر علي عمل المقرنات المتقدريه¹⁴.
  3. Rotenone/AA: أضافه 540 μL من الوسائط المجمعة لأنبوب لجعل 50 μM الأسهم. تمييع إلى 25 μM مع وسائل الاعلام للحصول علي تركيز الميناء (تركيز البئر النهائي سيكون 2.5 μM)
    ملاحظه: التركيزات المذكورة أعلاه قد أسفرت عن نتائج متسقة في ايدينا. ولم يؤد المزيد من الزيادة في التنفس. ومع ذلك ، قد تحتاج إلى ضبط تركيزات المخدرات اعتمادا علي حجم جزيرة ، وخاصه مع الجزر من الأنواع المختلفة أو خزان غير جزيرة. للاشاره ، يبلغ متوسط قطر الرئيسية غير البشرية جزيرة حوالي 150 μm¹⁵.
اعداد لوحه كروي ونقل الجزر
1. اختيار اليد الجزر الجزيرة البنكرياس في 60 مم × 15 مم الخلية ثقافة الطبق الذي يحتوي علي وسائل الاعلام المجمعة للحصول علي القرب من النقاء 100 ٪.
  ملاحظه: يجب ان تظهر الجزر التي تم تقريبها ، مع محيط محدد بوضوح ، وتبدو أكثر كثافة من ملوثات الانسجه الإفرازات. تجنب الجزر التي تظهر التالفة أو المتوترة. في هذه التجربة ، لم يتم قياس حجم جزيرة مباشره ، علي الرغم من اننا حاولنا اختيار الجزر من حجم ما يعادل تقريبا لكل بئر وعينه.
2. تحميل كل بئر من كروي microplate مع 175 μL من الوسائط المجمعة باستخدام ماصه متعددة القناات.
3. باستخدام ماصه P20 مجموعه إلى 15 μL ، يستنشق 15 الجزر من طبق ثقافة الخلية. يجب ان تكون الجزر مرئية في طرف الماصة إلى العين المجردة.
4. لنقل الجزر الصغيرة إلى كروي ، وانخفاض غيض من الماصة إلى أسفل البئر ، بالبالكاد رفع ، وماصه ببطء من حجم صغير جدا (~ 5 μL). تاكد من ان جميع الجزر التي تركت طرف الماصة. كل بئر سوفت استلمت 15 جزائر. في بعض الأحيان تحقق كروي صفيحه تحت المجهر للتحقق من ان الجزر الصغيرة هي في الجزء السفلي من كل بئر بدلا من تمسك إلى الجانبين.
  ملاحظه: تجنب تحميل الآبار الزاوية مع الجزر. يمكن ان يحدث تدفق الأكسجين والحموضة من البلاستيك اثناء الفحص ، ويتفاقم هذا في الآبار الاربعه الزاوية.
5. مره واحده وقد تم نقل جميع الجزر الصغيرة إلى كروي صفيحه ، احتضان microplate في 37 درجه مئوية ، غير CO₂ حاضنه في حين استكمال الخطوات أدناه.
تحميل خرطوشه الاستشعار وتشغيل الفحص
1. أزاله خرطوشه الاستشعار من الحاضنة. يجب ان تكون المنافذ A-C لكل بئر محمله اما المخدرات أو وسائل الاعلام. وينبغي تحميل الآبار التي تحتوي علي الجزر والآبار الاربعه الزاوية بالمخدرات. وينبغي تحميل الآبار غير الزاوية بدون الجزر بوسائط الاعلام. يمكن ترك المنفذ D فارغا. تحميل المنفذ A (اعلي اليسار من كل جهاز استشعار) مع 20 μL من اوليموميسين أو وسائل الاعلام. تحميل المنفذ B (اعلي اليمين) مع 22 μL من FCCP أو وسائل الاعلام. تحميل المنفذ C (أسفل اليسار) مع 25 μL من Rotenone/AA أو وسائل الاعلام.
2. برنامج تحليل تدفق الخلايا خارج الخلية لمده 30 دقيقه التنفس خط الأساس (5 دورات من 3 دقائق مزيج ، 3 دقيقه القياس) ، 42 دقيقه فتره القياس اوليموميسين (7 دورات من 3 دقائق مزيج ، 3 دقيقه التدبير) ، 30 دقيقه FCCP (5 دورات من 3 دقائق مزيج ، 3 دقيقه التدبير) ، و 30 دقيقه Rotenone/AA (5 دورات من 3 دقائق مزيج ، 3 دقيقه التدبير).
3. تشغيل الفحص واتبع التعليمات علي الشاشة لمعايره جهاز الاستشعار وادراج ميكروبلايت.

النتائج

لتحميل الجزر الصغيرة إلى ميكروبلايت ، وينبغي ان يستنشق 15 الجزر في 15 μL من وسائل الاعلام ، كما هو مبين في الشكل 1ا. ستستقر الجزر بشكل طبيعي باتجاه الجزء السفلي من طرف ماصه pipet-x في غضون ثوان معدودة. ثم ، يتم خفض غيض ماصه pipet-x إلى الجزء السفلي من البئر. ا...

Discussion

وقد أعاقت الدراسة من استهلاك الأكسجين جزيرة في السابق من قبل شكل كروي من الجزر ، وعدم التزام بالأسطح الثقافية ، وعدد الجزر المطلوبة لكل بئر. في هذا البروتوكول ، ونحن تسليط الضوء علي فعاليه 96 كروي microplate لقياس استهلاك الأكسجين جزيرة علي عدد قليل من الجزر الصغيرة وإظهار تقنيه لمناوله وتحميل ?...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ويود المؤلفون ان يعترفوا بنواه الفحص العالي الانتاجيه لاستخدام مرافقهم ، والتكنولوجيات الحيوية Agilent ، والدكتور بول Kievit (جامعه اوريغون للصحة والعلوم) لعزل الرئيسيات غير البشرية ، واريك دوناهو (جامعه فانديربيلت) للحصول علي المساعدة في الشكل 1. وقد دعمت J.M.E. من قبل NIGMS من المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة T32GM007347. وقد دعمت M.G. من قبل المعاهد القومية للصحة/NIDDK (R24DK090964) وأداره شؤون قدامي المحاربين (BX003744).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style	Corning	430166
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	354240
Conical tube, 50 mL	Falcon	352070
Dextrose anhydrous	Fisher Scientific	BP350-1	For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML	Vistalab	3054-1033	for loading multichannel pipet
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm	Foxx Life Sciences	371-3115-OEM
L-glutamine	Gibco	25030-081	200 mM (100x)
Multichannel pipette tips	ThermoFisher Scientific	94410810
Multichannel pipette, 15-1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672100BT	Recommended
P20, P200, and P1000 pipettes	Eppendorf	2231000602
pH Probe	Hanna Instruments	HI2210-01
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL	Olympus	24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media	Agilent	103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	S7800B	Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini	Agilent	102905-100	Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070	100 mM (100x)
Stereo Microscope	Olympus	SZX9
Syringe (sterile), 5 mL	BD	309603	For sterile filtration
Water (sterile)	Sigma	W3500-500mL

References

Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
. Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide Available from: https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019)
Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

154

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: