ניתוח של שאינם אנושיים הלבלב של איון צריכת החמצן

Summary

פרוטוקול זה מדגים את המדידה המדויקת והניתנת לכימות של צריכת החמצן באיונים שאינם אנושיים הלבלב. שיטות הטעינה של איון וציפוי המיקרופלטה מספקות מסגרת למדידת יעילות של נשימה בסוגים אחרים של הספרואידים מתורבתים.

Abstract

המדידה של צריכת החמצן באשכולות ספרואיד של תאים, כגון איולי לשעבר vivo הלבלב, היסטורית היה מאתגר. אנו להדגים את המדידה של צריכת חמצן של איון באמצעות 96-ובכן מיקרופלייט המיועדים למדידת צריכת החמצן ב spheroids. בתוך מעשה זה, מיקרולוחיות ספרואיד מצופות בדבק תא ורקמה ביום שלפני השיטת הפעולה. אנו מנצלים נפח קטן של הפתרון דבק כדי לעודד הדבקות איון רק בתחתית הבאר. ביום השימוש, 15 איונים נטענים ישירות לבסיס של כל הבאר באמצעות טכניקה המבטיחה מיקום אופטימלי של איונים ומדידה מדויקת של צריכת החמצן. היבטים שונים של נשימה מיטוכונדריאלי מאובטים באופן פרמקולוגית באיונים לא אנושיים, כולל נשימה תלוית ATP, נשימה מירבית ודליפת פרוטון. שיטה זו מאפשרת לתוצאות עקביות, הניתן לשימוש באמצעות מספר קטן של איונים לכל טוב. זה יכול תיאורטית להיות מיושם על כל הרוהרואידים תרבותי בגודל דומה.

Introduction

על מנת לשמור על רמות הגלוקוז בדם נורמלי, התא β הלבלב חייב לחוש את הגבהים בגלוקוז ולהפריש אינסולין בהתאם. צימוד הפרשת האינסולין עם רמות הגלוקוז קשור ישירות לחילוף החומרים של הגלוקוז ולייצור ATP דרך זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי. כך, המיטו, לשחק תפקיד קריטי הפרשות הגירוי צימוד¹. הערכת β-מיטוכונדריאלי-תא יכולה לחשוף פגמים המובילים לפגיעה באינסולין. הפרשה של גלוקגון על ידי תאים הלבלב α הוא גם קשור הדוק פונקציה מיטוכונדריאלי². למרות מונצח קווי התא הוכיחו שימושי עבור סוגים מסוימים של assays הפיזיולוגיה של תאים אלה אינה מדויקת באופן מדויק הפונקציה איון שלם, כפי שמודגם על ידי פוטנציאל של הפרשת אינסולין על ידי גלוקגון^3,4 ואת עיכוב הפרשת גלוקגון על ידי אינסולין/סומטוסטטין^5,6 ב איים שלמים. זה מדגים את הצורך מדידת צריכת החמצן באמצעות איים שלמים, שלם.

טכניקות עבור המדידה של תא מוריקה של התא איון התפתחו לאורך זמן, מהשימוש של צבעי פלורסנט רגישים חמצן⁷ כדי חיישנים במצב מוצק כי מדידת ישירות צריכת החמצן⁸. תוכנן בתחילה עבור monolayer, תאים חסיד, בדרך כלל מערכות השימוש בתרבות התא הוכיחו להיות לא יעילים עבור איולי הלבלב. כמו האיים לא לדבוק באופן טבעי הבארות, הם נוטים להיות נדחף לפריפריה של התרבות היטב וכתוצאה מכך מדידה לא מדויקת של צריכת החמצן⁹. כדי להילחם בבעיה זו, לוחיות 24-היטב מיוחדות עם דיכאון מרכזי שיכול להכיל איונים פותחו⁹. עם זאת, הצלחת 24-באר מערכת היה מוגבל על ידי מספר גדול של איונים נדרש (50-80 לכל טוב) ואת מספר התנאים שניתן היה לבדוק בו¹⁰. ההתפתחות האחרונה של 96-מיקרולוחיות היטב תוכנן במיוחד עבור ניתוח השטף החילוץ ב spheroids יש להתגבר על המחסומים האלה, המאפשר את המדידה של איון הגז מוריקה עם 20 או פחות איים לכל טוב¹⁰.

כאן, אנו להדגים את השימוש במערכת זו כדי למדוד צריכת חמצן באיים מ מקוק יפני (macaca פאסכאטה), מודל בעל חיים עם ביולוגיה איון דומה לבני אדם^11,12. , בפרוטוקול זה. מנתחים 15 מקוק בבאר בידינו, 15 איונים לכל התוצרת הגבוהה בסיסית צריכת החמצן הבסיסית מאשר פחות איונים, עם הפעלה חזקה ודיכוי של נשימה בתגובה טיפול תרופתי. אנו מדגישים את הצעדים להכנה לצורך התמדה, שיטה אפקטיבית להעלאת האיונים העקביים במרכז הבאר, ואתגרים משותפים בעת ביצוע הצורך.

Protocol

1. הכנת מחסנית מיקרופלייט וסנסור ביום הקודם להפעלת השיטת המחשב

איונים היו מבודדים מקופי-התוכי היפני בן השלוש, כפי שתיאר בעבר¹³. שיטה זו דומה מאוד לזה ששימש לבידוד איונים אנושיים מתורמים של גופה, אבל שונה מעכברים, שבו pancreata מנופחים לעתים קרובות עם פתרון הקולגן בעוד החיה נמצאת תחת הרגעה לפני הסרת איברים. אחזור איון נערך בהתאם להנחיות של הוועדה לטיפול בעלי חיים מוסדיים (IACUC) של המרכז לחקר הפרימטים הלאומית של אורגון (ONPRC) ואורגון בריאות ומדע האוניברסיטה ואושרו על ידי ה-ONPRC IACUC. ה-ONPRC מבוסס על חוק הרווחה והתקנות הנתמכות על-ידי מחלקת החקלאות של ארצות הברית ומדיניות שירות בריאות הציבור על טיפול הומאני ושימוש בבעלי חיים מעבדתיים בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים שפורסמו על ידי המכון הלאומי לבריאות.

1. הכנת מיקרולוחית ספרואיד
   1. הכינו 3 מ ל של תמיסה של 0.1 מ' מביקרבונט נתרן. המסנן מעקר את הפתרון. אנו משתמשים במסנן 0.45 יקרומטר (טבלת חומרים).
   2. במכסה של תרבות התא, הוסף 200 μL של הדבקה של תא ורקמה (טבלת חומרים) עד 2.8 מ ל של 0.1 מ' נתרן ביקרבונט. לאחר מכן, להוסיף 20 μL של פתרון זה לחלק התחתון של כל טוב של 96-היטב מיקרולוחית ספרואיד (טבלת חומרים). ודא כי בועות האוויר יוסרו מקצה pipet ורק את החלק התחתון של הצלחת מכוסה. ציפוי המיקרולוח מונע איונים מלהתקדם בצידי הבארות כאשר התרופות מתווספות ומעורבות בבאר במהלך התהליך.
      הערה: יש צורך לשים מעיל כמו בארות רבות כפי שישמשו עבור איונים כאשר הצורך מופעל. אם רק מספר בארות ישמשו, ניתן לשנות את הפתרון הדביק את התאים למטה בהתאם. הדבק התאי המשמש בתוך השימוש הוא פתרון חלבון מגובש שהופק מהמוסזל הימי. לחילופין, אימונולוגיה בארות יכול להיות מצופה עם 20 μl של 100 μg/mL פולי-D-ליזין.
   3. מודקת את הצלחת ב 37 ° c, החממה לא שיתוף₂ למשך שעה אחת.
   4. , בסביבה סטרילית. מחצי את התמיסה של דבק התא מלוחית הרישוי לשטוף כל היטב פעמיים עם 400 μL של 37 ° צ' מים סטרילי באמצעות pipet רב-ערוצי. . הרשו לאוויר להתייבש
   5. לאחר 30-40 דקות, יש לכסות את הצלחת ולאחסן לילה ב -4 ° c.
2. הידרציה של מחסנית החיישן
   1. בסביבה סטרילית, פתח את חבילת מחסנית החיישן (טבלת חומרים) והסר את התוכן. מניחים את מחסנית חיישן הפוך ליד לוחית השירות.
   2. למלא כל היטב את צלחת השירות עם 200 μL המים סטרילי ולהקטין את מחסנית החיישן בחזרה לתוך צלחת השירות. המקום מורכב מחסנית חיישן ולוחית כלי השירות ב 37 ° c, חממה שאינה CO₂ בלילה.
3. הכנת כהנמלה
   1. מחלקים 25 מ ל של כלינמלה (שולחן חומרים) לתוך צינורית חרוט 50 mL. מניחים את הצינור ב-37 ° c, חממה שאינה בעלת₂ לילה.

2. פרוטוקול הכנה למדיה, טעינת איונים והעמסת מחסנית החיישן ביום העריכה

1. הכנת מדיה
   1. כדי 48.5 mL של מדיה בסיס (DMEM מינימלי, ראה טבלה של חומרים), להוסיף 500 μl כל אחד של נתרן פירובט 1 מ"מ ו 2 מילימטר גלוטמין. בנוסף, להוסיף 496 μL של 200 mg/ml גלוקוז (הריכוז הסופי של גלוקוז במדיה הוא 5.5 mM).
      הערה: הריכוז גלוקוז בסיסית נשמר קבוע עבור ניסויים אלה. עם זאת, גלוקוז יכול לשמש גם כדי לעורר נשימה בנוסף המניפולציות הפרמקולוגית תיאר מכה¹⁰.
   2. ודא כי ה-pH הוא 7.4 +/-0.1, התאמה במידת הצורך.
2. הכנת מחסנית חיישן
   1. לקחת מחסנית חיישן מתוך החממה, להסיר מכסה מחסנית חיישן, ולרוקן את המים מבארות. מקום 200 mL של מחמם טרום מחומם לתוך כל טוב להחליף מכסה מחסנית חיישן.
   2. הניחו את מחסנית החיישן בחממה במשך כשעה אחת (עד לצורך).
3. הכנת תרופות לצורך שיטת מצוקה מיטוכונדריאלי
   1. פתח את ערכת בדיקת הלחץ (טבלת חומרים) ולהסיר את התוכן. להפוך את המלאי ואת פתרונות העבודה עבור Oligomycin, פחמן ציאניד-4-(trifluoromethoxy) פנילהידרלזון (FCCP), ו Rotenone/Antimycin A (AA) כדלקמן.
      1. Oligomycin: להוסיף 630 μL של מדיה התאספו לצינור כדי להפוך 100 מניות μM. אז, לדלל 45 μM עם מדיה כדי להשיג ריכוז היציאה (הסוף היטב ריכוז לאחר ההזרקה יהיה 4.5 μM)
      2. FCCP: להוסיף 720 μL של הרכבה מדיה לצינור כדי להפוך 100 μM מניות. לדלל עד 10 μM עם מדיה כדי להשיג ריכוז היציאה (הריכוז האחרון היטב יהיה 1 μM)
         הערה: bsa ו/או fbs אין להוסיף למדיה, כמו זה יכול להשפיע על הפעולה של מיטוכונדריאלי uncouplers¹⁴.
      3. Rotenone/AA: להוסיף 540 μL של הרכבה מדיה לצינור כדי להפוך 50 μM מניות. לדלל עד 25 μM עם מדיה כדי להשיג ריכוז הנמל (ריכוז היטב הסופי יהיה 2.5 μM)
         הערה: הריכוזים הנ ל יצרו תוצאות עקביות בידינו. FCCP נוספים הובילו לעלייה נוספת בנשימה. עם זאת, ריכוזי התרופה עשוי להיות צורך להתאים בהתאם לגודל איון, ובמיוחד עם איונים ממינים שונים או שאינם מסוג spheroids. להתייחסות, הקוטר הממוצע של איון הפרימטים שאינם אנושיים הוא כ 150 יקרומטר¹⁵.
4. הכנת לוחית ספרואיד והעברה של איונים
   1. יד לבחור איונים הלבלב לתוך 60 מ"מ x 15 מ"מ ממנה תרבות תא המכיל מדיה התאספו כדי להשיג ליד 100% טוהר.
      הערה: איואיי צריכים להופיע מעוגלים, עם פריפריה מוגדרת בבירור, ולהופיע צפוף יותר מאשר מזהמים רקמות אקסוקרינית. להימנע מאיונים שנראים פגומים או בלויים. בניסוי זה, גודל איון לא נמדד ישירות, למרות שניסינו לבחור איים של בגודל שווה ערך עבור כל טוב ומדגם.
   2. לטעון כל באר של אימונולוגיה מיקרולוחית עם 175 μl של הרכבה מדיה באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
   3. באמצעות P20 מערכת הצינורות מוגדר 15 μL, משחים 15 איים ממנה לתרבות התא. איונים צריכים להיות גלויים. בעצת הפיפטה לעין העירומה
   4. כדי להעביר איים למיקרואיד microplate, מתיחת צנרת נמוכה יותר לתחתית הבאר, בקושי להרים, והפיפטה לאט החוצה נפח קטן מאוד (~ 5 μL). תאשר שכל האיונים. הותירו את קצה הצינורות כל טוב צריך לקבל 15 איים. מדי פעם לבדוק מיקרואיד מיקרו מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא כי איונים הם בתחתית של כל הבאר ולא תקוע לצדדים.
      הערה: להימנע מטעינת בארות הפינה עם איונים. חמצן ו-pH השטף מתוך פלסטיק יכול להתרחש במהלך התהליך, וזה מחמיר את ארבע בארות הפינה.
   5. לאחר כל האיים הועברו המיקרואיד אימונולוגיה, הדגירה המיקרוצלחת ב 37 ° c, לא שיתוף₂ בחממה תוך השלמת השלבים הבאים.
5. טעינת מחסנית החיישן והפעלת המנה
   1. הסר מחסנית חיישן מהאינקובטור. יציאות A-C עבור כל טוב חייב להיות טעון עם סמים או מדיה. בארות המכילות איונים וארבע הבארות הפינתיות צריכות להיות עמוסות בסמים. אין לטעון בארות שאינן פינתיות ללא איונים במדיה. ניתן להשאיר את Port D ריק. טען יציאה A (למעלה משמאל של כל חיישן) עם 20 μL של oligomycin או מדיה. טען יציאה B (מימין למעלה) עם 22 μL של FCCP או מדיה. טען יציאה C (למטה משמאל) עם 25 μL של Rotenone/AA או מדיה.
   2. תוכנית שיטת מנתח השטף בלתי מ, עבור 30 דקות הבסיסית הנשימה זמן (5 מחזורים של 3 דקות ערבוב, 3 דקות מידה), 42 דקות מדידה תקופת המדידה (7 מחזורים של 3 דקות ערבוב, 3 דקות מידה), 30 דקות FCCP (5 מחזורים של 3 דקות ערבוב, 3 דקות מדידה), ו 30 דקות Rotenone/AA (5 מחזורים של 3 דקות ערבוב, 3 דקות מידה).
   3. הפעל את הטיפול ועקוב אחר ההוראות על המסך עבור כיול החיישן והוספת המיקרו-לוחית.

תוצאות

כדי לטעון איים לתוך microplate, 15 איונים צריכים להיות משופחת ב 15 μL של מדיה, כפי שמוצג באיור 1א. איונים באופן טבעי להתיישב לקראת החלק התחתון של הטיפ pipet בתוך כמה שניות. לאחר מכן, הקצה התחתון מופחת לתחתית הבאר. הטיפ הוא מוסר מעט מאוד, וכמות קטנה (כ 5 μL) הוא ממ...

Discussion

המחקר של צריכת חמצן של איון כבר הושפע בעבר על ידי הצורה כדורית של איונים, חוסר הדבקות שלהם משטחי התרבות, ואת מספר איונים נדרש לכל טוב. בפרוטוקול זה, אנו להדגיש את היעילות של 96-היטב מיקרו-לוחית ספרואיד עבור מדידת צריכת החמצן של איון על מספר קטן של איונים ולהדגים טכניקה לטיפול וטעינת איונים שה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style	Corning	430166
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	354240
Conical tube, 50 mL	Falcon	352070
Dextrose anhydrous	Fisher Scientific	BP350-1	For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML	Vistalab	3054-1033	for loading multichannel pipet
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm	Foxx Life Sciences	371-3115-OEM
L-glutamine	Gibco	25030-081	200 mM (100x)
Multichannel pipette tips	ThermoFisher Scientific	94410810
Multichannel pipette, 15-1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672100BT	Recommended
P20, P200, and P1000 pipettes	Eppendorf	2231000602
pH Probe	Hanna Instruments	HI2210-01
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL	Olympus	24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media	Agilent	103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	S7800B	Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini	Agilent	102905-100	Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070	100 mM (100x)
Stereo Microscope	Olympus	SZX9
Syringe (sterile), 5 mL	BD	309603	For sterile filtration
Water (sterile)	Sigma	W3500-500mL