Analyse de la consommation d'oxygène des primates non humains

Résumé

Ce protocole démontre la mesure précise et reproductible de la consommation d'oxygène dans les îlots pancréatiques non-humains de primate. Les techniques de chargement des îfles et le revêtement de la microplaque fournissent un cadre pour une mesure efficace de la respiration dans d'autres types de sphéroïdes cultivés.

Résumé

La mesure de la consommation d'oxygène dans les amas sphéroïdes des cellules, telles que les îlots pancréatiques ex vivo, a historiquement été difficile. Nous démontrons la mesure de la consommation d'oxygène d'îtte utilisant une microplaque de 96 puits conçue pour la mesure de la consommation d'oxygène dans les sphéroïdes. Dans cet analyse, les microplaques sphéroïdes sont recouvertes d'un adhésif cellulaire et tissulaire la veille de l'analyse. Nous utilisons un petit volume de solution adhésive pour encourager l'adhérence des îcles au fond du puits. Le jour de l'analyse, 15 îlots sont chargés directement dans la base de chaque puits à l'aide d'une technique qui assure un positionnement optimal des îlots et une mesure précise de la consommation d'oxygène. Divers aspects de la respiration mitochondriale sont sondés pharmacologiquement dans les îlots de primates non humains, y compris la respiration dépendante de l'ATP, la respiration maximale et la fuite de protons. Cette méthode permet des résultats cohérents et reproductibles en utilisant seulement un petit nombre d'îlots par puits. Il peut théoriquement être appliqué à tous les sphéroïdes cultivés de taille similaire.

Introduction

Afin de maintenir des niveaux normaux de glucose dans le sang, la cellule pancréatique doit sentir des élévations dans le glucose et sécrédre l'insuline en conséquence. Le couplage de la sécrétion d'insuline avec les niveaux de glucose est directement lié au métabolisme de glucose et à la production de l'ATP par la phosphorylation oxydative mitochondriale. Ainsi, les mitochondries jouent un rôle critique dans le couplage stimulus-sécrétion¹. L'évaluation de la fonction mitochondriale à cellules d'A peut révéler des défauts qui mènent à la sécrétion altérée d'insuline. La sécrétion de glucagon par les cellules pancréatiques est également étroitement liée à la fonction mitochondriale². Bien que les lignées cellulaires immortalisées d'îlots se soient avérées utiles pour certains types d'essais, la physiologie de ces cellules ne récapitule pas avec précision la fonction des îlots entiers, comme l'illustre la potentialisation de la sécrétion d'insuline par le glucagon^3,4 et l'inhibition de la sécrétion de glucagon par l'insuline/somatostatine^5,6 dans les îlots intacts. Cela démontre la nécessité de mesurer la consommation d'oxygène à l'aide d'îlots entiers intacts.

Les techniques de mesure de la réspirométrie des cellules des îtaux ont évolué au fil du temps, de l'utilisation de colorants fluorescents sensibles à l'oxygène⁷ à des capteurs à l'état solide qui mesurent directement la consommation d'oxygène⁸. Initialement conçus pour monolayer, les cellules adhérentes, les systèmes de plaque de culture cellulaire couramment utilisés se sont avérés inefficaces pour les îlots pancréatiques. Comme les îlots n'adhèrent pas naturellement aux puits, ils sont enclins à être poussés à la périphérie de la culture bien résultant en une mesure inexacte de la consommation d'oxygène⁹. Pour lutter contre ce problème, des plaques spécialisées de 24 puits avec une dépression centrale qui pourrait contenir des îlots ont été développées⁹. Cependant, le système de plaque de 24 puits a été limité par le grand nombre d'îlots requis (50-80 par puits) et le nombre de conditions qui pourraient être testées simultanément¹⁰. Le développement récent de microplates de 96 puits conçues spécifiquement pour l'analyse des flux extracellulaires chez les sphéroïdes a permis de surmonter ces obstacles, permettant de mesurer la réspirométrie des îlots avec 20 îlots ou moins par puits¹⁰.

Ici, nous démontrons l'utilisation de ce système pour mesurer la consommation d'oxygène dans les îlots du macaque japonais (Macaca fuscata), un modèle animal avec la biologie des îlots similaires à l'homme^11,12. Dans ce protocole, 15 îlots de macaque sont analysés par puits. Dans nos mains, 15 îlots par puits ont produit une consommation d'oxygène de base plus élevée que moins d'îlots, avec une activation robuste et la répression de la respiration en réponse à la manipulation pharmacologique. Nous soulignons les étapes pour préparer l'effort, une méthode efficace pour le chargement constant des îlots au centre de chaque puits, et des défis communs lors de l'exécution de cet effort.

Protocole

1. Préparation de microplaque et de cartridge de capteur le jour précédant l'exécution de l'essai

Les îlots ont été isolés des macaques japonais de trois ans comme précédemment décrit¹³. Cette méthode est très similaire à celle utilisée pour isoler les îlots humains des donneurs de cadavres, mais diffère des souris, dans lesquelles les pancréatas sont souvent gonflés avec une solution de collagène alors que l'animal est sous sédation et avant l'ablation des organes. La récupération des îpliers a été effectuée conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Centre national de recherche sur les primates de l'Oregon (ONPRC) et de l'Université de la santé et des sciences de l'Oregon et a été approuvée par l'ONPRC IACUC. L'ONPRC se conforme à la Loi sur le bien-être des animaux et aux règlements appliqués par le Département de l'agriculture des États-Unis (USDA) et à la Politique du Service de santé publique sur les soins humains et l'utilisation des animaux de laboratoire conformément au Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health.

1. Préparation de Spheroid Microplate
   1. Préparer 3 ml d'une solution de 0,1 Mde de bicarbonate de sodium. Filtrer stériliser la solution. Nous avons utilisé un filtre de 0,45 m (Tableau des matériaux).
   2. Dans une hotte de culture cellulaire, ajouter 200 l d'adhésif cellulaire et tissulaire (Tableau des matériaux) à 2,8 ml de bicarbonate de sodium de 0,1 m. Ensuite, ajoutez 20 L de cette solution au fond de chaque puits de la microplaque sphéroïde de 96 puits(Tableau des Matériaux). Assurez-vous que les bulles d'air sont retirées de la pointe du tuyau et que seul le fond de la plaque est recouvert. Le revêtement de la microplaque empêche les îlots de remonter les côtés des puits lorsque des médicaments sont ajoutés et mélangés dans le puits pendant l'analyse.
      REMARQUE: Il n'est nécessaire d'enrober que le plus grand nombre de puits que pour les îlots lorsque l'essai est exécuté. Si seulement quelques puits sont utilisés, la solution adhésive cellulaire peut être mise à l'échelle de manière appropriée. L'adhésif cellulaire utilisé dans l'assay est une solution de protéines formulée extraite de la moule marine. Alternativement, les puits microplaques peuvent être enduits de 20 l de 100 g/mL de poly-lysine.
   3. Incuber la plaque dans un incubateur de 37 oC, non-CO₂ pendant une heure.
   4. Dans un environnement stérile, aspirez la solution adhésive de cellules de la plaque. Laver chaque puits deux fois à l'aide d'une canalisation multicanal de 400 oL de 37 oC d'eau stérile. Laisser sécher à l'air.
   5. Après 30-40 minutes, couvrir l'assiette et le conserver toute la nuit à 4 oC.
2. Hydratation de la cartouche de capteur
   1. Dans un environnement stérile, ouvrez le paquet de cartouches de capteur(Tableau des matériaux) et retirez le contenu. Placez la cartouche du capteur à l'envers à côté de la plaque d'utilité.
   2. Remplissez chaque puits de la plaque d'utilité avec de l'eau stérile de 200 l et abaissez la cartouche du capteur dans la plaque d'utilité. Placez la cartouche de capteur assemblée et la plaque d'utilité dans un incubateur de 37 oC et non CO₂ pendant la nuit.
3. Préparation de Calibrant
   1. Aliquot 25 ml de calibrant (Table of Materials) dans un tube conique de 50 ml. Placer le tube dans un incubateur de 37 oC et non CO₂ pendant la nuit.

2. Protocole pour la préparation des médias, le chargement des îlots et le chargement de la cartouche de capteur le jour de l'essai

1. Préparation des médias
   1. À 48,5 ml de support de base (dMEM minimal, voir Tableau des matériaux),ajoutez 500 l chacun de 1 mM de pyruvate de sodium et 2 mM de glutamine. De plus, ajoutez 496 l de glucose de 200 mg/ml (la concentration finale de glucose dans les médias est de 5,5 mM).
      REMARQUE: La concentration de glucose de base a été maintenue constante pour ces expériences. Cependant, le glucose peut également être employé pour stimuler la respiration en plus des manipulations pharmacologiques décrites coup^10.
   2. Confirmez que le pH est de 7,4 euros/- 0,1, en ajustant si nécessaire.
2. Préparation de la cartouche de capteur
   1. Sortez la cartouche du capteur de l'incubateur, retirez le couvercle de la cartouche du capteur et jetez l'eau des puits. Placer 200 ml de calibrant préréchauffé dans chaque puits et remplacer le couvercle de la cartouche du capteur.
   2. Remettre la cartouche du capteur dans l'incubateur pendant environ 1 heure (jusqu'à ce que nécessaire).
3. Préparation de médicaments pour l'analyse du stress mitochondrial
   1. Ouvrez le kitdetest de résistance ( Table of Materials ) et retirez le contenu. Maquillage de stock et de solutions de travail pour Oligomycin, Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), et Rotenone/Antimycin A (AA) comme suit.
      1. Oligomycine : ajouter 630 l de supports assemblés au tube pour faire 100 millions de stock. Ensuite, diluer à 45 M avec des supports pour obtenir la concentration du port (la concentration finale du puits après l'injection sera de 4,5 M)
      2. FCCP : ajouter 720 l de supports assemblés au tube pour faire 100 millions de stock. Diluer à 10 M avec des supports pour obtenir la concentration du port (la concentration finale du puits sera de 1 M)
         REMARQUE: BSA et/ou FBS ne doivent pas être ajoutés aux médias, car cela peut affecter l'action des découpleurs mitochondriaux¹⁴.
      3. Rotenone/AA : ajouter 540 l de supports assemblés au tube pour faire 50 m de stock. Diluer à 25 M avec des supports pour obtenir la concentration du port (la concentration finale du puits sera de 2,5 M)
         REMARQUE: Les concentrations ci-dessus ont produit des résultats cohérents dans nos mains. Le FCCP additionnel n'a mené à aucune autre augmentation de la respiration. Cependant, les concentrations de médicaments peuvent devoir être ajustées en fonction de la taille des îlots, et en particulier des îlots de différentes espèces ou des sphéroïdes non-îlots. À titre de référence, le diamètre moyen d'un îf-îb de primate non humain est d'environ 150 m^15.
4. Préparation de la plaque sphéroïde et transfert d'îlots
   1. Choisissez à la main des îlots pancréatiques dans un plat de culture cellulaire de 60 mm x 15 mm contenant des supports assemblés pour obtenir une pureté de près de 100 %.
      REMARQUE: Les îlots doivent apparaître arrondis, avec une périphérie clairement définie, et semblent plus denses que les contaminants des tissus exocrines. Évitez les îlots qui semblent endommagés ou effilochés. Dans cette expérience, la taille des îlots n'a pas été mesurée directement, bien que nous ayons tenté de cueillir des îlots de taille approximativement équivalente pour chaque puits et échantillon.
   2. Chargez chaque puits de microplaque sphéroïde avec 175 l de supports assemblés à l'aide d'une pipette multicanal.
   3. À l'aide d'une pipette P20 fixée à 15 l, aspirez 15 îlots à partir d'un plat de culture cellulaire. Les îlots doivent être visibles à l'œil nu dans la pipette.
   4. Pour transférer les îlots à la microplaque sphérique, la pointe de pipette inférieure au fond du puits, à peine soulever, et lentement pipette sur un très petit volume (5 l). Confirmez que tous les îlots ont quitté la pointe de la pipette. Chaque puits devrait recevoir 15 îlots. Vérifier occasionnellement la microplaque sphéroïde sous le microscope pour vérifier que les îlots sont au fond de chaque puits plutôt que collés sur les côtés.
      REMARQUE: Évitez de charger les puits d'angle avec des îlots. L'oxygène et le pH flux hors du plastique peut se produire pendant l'analyse, et cela est exacerbé dans les quatre puits d'angle.
   5. Une fois que tous les îlots ont été transférés sur la microplaque sphéroïde, incuber la microplaque dans un incubateur de 37 oC, non-CO_2, tout en complétant les étapes ci-dessous.
5. Chargement de la cartouche du capteur et exécution de l'assay
   1. Retirez la cartouche du capteur de l'incubateur. Les ports A-C pour chaque puits doivent être chargés de drogue ou de médias. Les puits contenant des îlots et les quatre puits d'angle doivent être chargés de drogue. Les puits sans coin sans îlots doivent être chargés de supports. Port D peut être laissé vide. Chargez le port A (en haut à gauche de chaque capteur) avec 20 l d'oligomycine ou de support. Chargez le port B (en haut à droite) avec 22 L de FCCP ou de médias. Chargez le port C (en bas à gauche) avec 25 oL de Rotenone/AA ou de médias.
   2. Programmez un analyseur de flux extracellulaire pour une période de respiration de ligne de 30 minutes (5 cycles de mélange de 3 minutes, mesure de 3 minutes), période de mesure de 42 minutes d'oligomycine (7 cycles de mélange de 3 minutes, mesure de 3 minutes), 30 minutes FCCP (5 cycles de mélange de 3 minutes, mesure de 3 minutes), et 30 minutes Rotenone/AA (5 cycles de mélange de 3 minutes, mesure de 3 minutes).
   3. Exécutez l'essai et suivez les instructions à l'écran pour étalonner le capteur et insérer la microplaque.

Résultats

Pour charger les îlots en microplaque, 15 îlots doivent être aspirés dans 15 ll de support, comme le montre la figure 1A. Les îlots se déposent naturellement vers le fond de la pointe de la tuyauterie en quelques secondes. Ensuite, la pointe de pipet est abaissée au fond du puits. La pointe est très légèrement soulevée, et un petit volume (environ 5 l) est pipetted avec les îlots. Cette technique permet de placer de façon cohére...

Discussion

L'étude de la consommation d'oxygène des îlots a déjà été entravée par la forme sphérique des îlots, leur manque d'adhérence aux surfaces de culture et le nombre d'îlots requis par puits. Dans ce protocole, nous soulignons l'efficacité de la microplaque sphéroïde de 96 puits pour mesurer la consommation d'oxygène d'îlots sur un petit nombre d'îlots et démontrons une technique pour la manipulation et le chargement des îlots qui est techniquement faisable et produit cohérente Résultats.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style	Corning	430166
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	354240
Conical tube, 50 mL	Falcon	352070
Dextrose anhydrous	Fisher Scientific	BP350-1	For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML	Vistalab	3054-1033	for loading multichannel pipet
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm	Foxx Life Sciences	371-3115-OEM
L-glutamine	Gibco	25030-081	200 mM (100x)
Multichannel pipette tips	ThermoFisher Scientific	94410810
Multichannel pipette, 15-1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672100BT	Recommended
P20, P200, and P1000 pipettes	Eppendorf	2231000602
pH Probe	Hanna Instruments	HI2210-01
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL	Olympus	24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media	Agilent	103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	S7800B	Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini	Agilent	102905-100	Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070	100 mM (100x)
Stereo Microscope	Olympus	SZX9
Syringe (sterile), 5 mL	BD	309603	For sterile filtration
Water (sterile)	Sigma	W3500-500mL