비인간 영장류 췌장 췌도 산소 소비 분석

요약

이 프로토콜은 비인간 영장류 췌도에서 산소 소비의 정확하고 재현 가능한 측정을 보여줍니다. 마이크로플레이트의 아일렛 로딩 기술과 코팅은 다른 유형의 배양된 스페로이드에서 호흡을 효율적으로 측정할 수 있는 프레임워크를 제공합니다.

초록

전 생체 췌도와 같은 세포의 스페로이드 클러스터에서 산소 소비의 측정은 역사적으로 도전적이었습니다. 우리는 스페로이드의 산소 소비를 측정하기 위해 설계된 96 웰 마이크로 플레이트를 사용하여 아일렛 산소 소비의 측정을 보여줍니다. 이 분석에서, 스페로이드 마이크로 플레이트는 분석 전날 세포 및 조직 접착제로 코팅된다. 우리는 소량의 접착제 용액을 사용하여 우물의 바닥만에 대한 밑면 준수를 장려합니다. 분석 당일, 15개의 작은 섬은 최적의 섬 위치와 산소 소비의 정확한 측정을 보장하는 기술을 사용하여 각 우물의 기지에 직접 로드됩니다. 미토콘드리아 호흡의 다양한 측면은 ATP 의존호흡, 최대 호흡 및 양성자 누출을 포함한 비인간 영장류 아일에서 약리학적으로 조사됩니다. 이 방법을 사용하면 웰당 소수의 섬만 사용하여 일관되고 재현 가능한 결과를 볼 수 있습니다. 이론적으로 비슷한 크기의 배양 된 스페로이드에 적용 될 수 있습니다.

서문

정상적인 혈당 수준을 유지하기 위해 췌장 β 세포는 포도당의 고도를 감지하고 그에 따라 인슐린을 분비해야합니다. 포도 당 수준과 인슐린 분 비의 결합은 직접 포도 당 물질 대사와 미토 콘 드리 아 산화 인 산화를 통해 ATP의 생산에 연결. 따라서, 미토콘드리아는 자극 분비 커플링^1에서중요한 역할을 한다. β 세포 미토콘드리아 기능을 평가하는 것은 손상한 인슐린 분비로 이끌어 내는 결점을 드러낼 수 있습니다. 췌장 α 세포에 의한 글루카곤의 분비는 또한 미토콘드리아 기능^2와밀접하게 연관되어 있다. 불멸의 섬 세포주가 일부 유형의 분석에 유용하다는 것이 입증되었지만, 이들 세포의 생리학은 글루카곤^3,4에 의한 인슐린 분비의 전위및 인슐린/소마토스타틴^5,6에 의한 글루카곤 분비의 억제에 의해 예시된 바와 같이 전체 섬 기능을 정확하게 회귀하지 는 않는다. 이것은 전체, 그대로 섬을 사용하여 산소 소비를 측정할 필요성을 보여줍니다.

아일렛 세포 호흡측정기 의 측정 기술은 산소에 민감한 형광 염료^7의 사용에서 산소 소비를 직접 측정하는 고체 센서에 이르기까지 시간이 지남에 따라 진화해 왔으며^8. 처음에 단층, 부착 세포를 위해 설계, 일반적으로 사용되는 세포 배양 플레이트 시스템은 췌장 섬에 효과가 입증되었습니다. 작은 섬이 자연적으로 우물에 부착되지 않기 때문에, 그들은 잘 산소 소비의 부정확한 측정의 결과로 배양의 주변에 밀려되는 경향이^{있다 9.} 이 문제에 대처하기 위해, 섬을 포함 할 수있는 중앙 우울증과 전문 24 웰^{플레이트는 9}개발되었다 . 그러나, 24웰 플레이트 시스템은 필요한 많은 수의 섬들(웰당 50-80)과 동시에^10개까지시험될 수 있는 조건의 수에 의해 제한되었다. 최근 스페로이드의 세포외 플럭스 분석을 위해 특별히 설계된 96웰 마이크로플레이트의 개발은 이러한 장벽을 극복하여 웰^10당20개 이하의 섬으로 섬 호흡을 측정할 수 있게 되었습니다.

여기서, 우리는 일본 원숭이(마카카 fuscata),인간과유사한 섬 생물학을 가진 동물 모델에서 작은 섬에서 산소 소비를 측정하기 위해이 시스템의 사용을 보여줍니다^11,12. 이 프로토콜에서는 15개의 마카크 섬을 웰당 분석합니다. 우리의 손에, 잘 생산 당 15 작은 섬 적은 섬 보다 더 높은 기준선 산소 소비, 강력한 활성화 및 약리학 조작에 대 한 응답에 호흡의 억압. 우리는 분석, 각 우물의 중심에 작은 섬을 일관되게 로딩하기위한 효과적인 방법, 이 분석법을 수행 할 때 일반적인 도전을 준비하는 단계를 강조한다.

프로토콜

1. 분석기 실행 전날 마이크로 플레이트 및 센서 카트리지 준비

섬은 앞서 설명한 대로 3 살 짜리 일본 원숭이에서 격리 되었다^13. 이 방법은 시체 기증자로부터 인간의 섬을 분리하는 데 사용되는 것과 매우 유사하지만, 동물이 진정 상태에서 장기 제거 전에 췌장이 종종 콜라게나아제 용액으로 팽창되는 마우스와 다릅니다. 아일렛 검색은 오리건 국립 영장류 연구 센터 (ONPRC)와 오리건 보건 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행되었으며 ONPRC IACUC의 승인을 받았습니다. ONPRC는 미국 농무부(USDA)가 시행하는 동물 복지법 및 규정과 국립보건원이 발표한 실험실 동물 관리 및 사용에 관한 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책을 준수합니다.

1. 스페로이드 마이크로 플레이트의 준비
   1. 중탄산나트륨0.1M 용액 3 mL를 준비합니다. 필터는 용액을 살균합니다. 우리는 0.45 μm 필터(재료 표)를이용했습니다.
   2. 세포 배양 후드에서, 0.1M 중탄산나트륨의 2.8 mL에 세포 및 조직 접착제(재료 표)의200 μL을 추가합니다. 이어서, 이 용액의 20 μL을 96웰 스페로이드마이크로플레이트(재료표)의각 웰의 바닥에 추가한다. 파이펫 팁에서 기포를 제거하고 플레이트 바닥만 덮여 있는지 확인합니다. 마이크로 플레이트의 코팅은 분석 기간 동안 약물이 추가되고 우물에 혼합 될 때 작은 섬이 우물의 측면위로 이동하는 것을 방지합니다.
      참고: 분석이 실행될 때 섬에 사용되는 만큼많은 우물을 코팅하는 것이 필요합니다. 몇 개의 웰만 사용하면 셀 접착제 용액을 적절하게 축소할 수 있습니다. 분석법에 사용되는 세포 접착제는 해양 홍합에서 추출한 제형 단백질 용액이다. 또는 마이크로 플레이트 웰을 100 μg/mL 폴리-D-리신 의 20 μL로 코팅 할 수 있습니다.
   3. 플레이트를 37°C,_비CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 배양한다.
   4. 멸균 환경에서, 플레이트로부터 세포 접착제 용액을 흡인한다. 다중 채널 파이프를 사용하여 37 °C 멸균 수의 400 μL로 각 우물을 두 번 씻으소서. 공기건조시에 두십시오.
   5. 30-40분 후에 접시를 덮고 4°C에서 밤새 보관합니다.
2. 센서 카트리지의 수분 공급
   1. 멸균 환경에서 센서 카트리지패키지(재료 표)를열고 내용물을 제거합니다. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다.
   2. 유틸리티 플레이트의 각 우물을 200 μL 멸균수로 채우고 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 넣습니다. 조립된 센서 카트리지와 유틸리티 플레이트를 37°C,_비CO2 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다.
3. 교정의 준비
   1. 50 mL 원엽 튜브에 교정(재료표)의25 mL. 튜브를 37°C,_비CO2 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다.

2. 분석의 날에 미디어 준비, 섬 의적 로드 및 센서 카트리지 로딩을위한 프로토콜

1. 미디어 준비
   1. 48.5 mL의 베이스 매질(최소 DMEM, 재료 표참조)에 피루바트 나트륨 1mM 과 글루타민 2mM각각500 μL을 추가합니다. 또한, 추가 496 200 mg/ml 포도 당의 μL (미디어에 포도 당의 최종 농도는 5.5 mM).
      참고: 기준선 포도당 농도는 이러한 실험에 대해 일정하게 유지되었다. 그러나, 포도당은 또한 타격^10에기재된 약리학적 조작 이외에 호흡을 자극하는데 사용될 수 있다.
   2. pH가 7.4 +/- 0.1인지 확인하고 필요한 경우 조정합니다.
2. 센서 카트리지 준비
   1. 인큐베이터에서 센서 카트리지를 꺼내 센서 카트리지 뚜껑을 제거하고 우물에서 물을 버리십시오. 200 mL의 미리 온온 교정을 각 우물에 넣고 센서 카트리지 뚜껑을 교체하십시오.
   2. 센서 카트리지를 인큐베이터에 약 1시간(필요할 때까지) 다시 놓습니다.
3. 미토콘드리아 스트레스 분석법 약물 준비
   1. 응력 테스트키트(재료 표)를열고 내용물제거합니다. 올리고마이신, 카보닐 시안화물-4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP) 및 로테네/안티마이신 A(AA)에 대한 재고 및 작업 솔루션을 다음과 같이 구성합니다.
      1. 올리고마이신: 630 μL의 조립된 매체를 튜브에 추가하여 100 μM 스톡을 만듭니다. 이어서, 포트 농도를 얻기 위해 매체로 45 μM으로 희석 (주입 후 최종 웰 농도는 4.5 μM이 될 것이다)
      2. FCCP: 튜브에 720 μL의 조립 된 매체를 추가하여 100 μM 스톡을 만듭니다. 포트 농도를 얻기 위해 매체로 10 μM으로 희석 (최종 웰 농도는 1 μM이 될 것입니다)
         참고: BSA 및 / 또는 FBS는 미디어에 추가해서는 안됩니다.
      3. 로테네/AA: 조립된 용지 540 μL을 튜브에 추가하여 50 μM 스톡을 만듭니다. 포트 농도를 얻기 위해 매체로 25 μM으로 희석 (최종 유 농도는 2.5 μM이 될 것입니다)
         참고: 위의 농도는 우리의 손에 일관된 결과를 생산하고있다. 추가 FCCP는 호흡에 있는 더 이상 증가로 이끌어 냈습니다. 그러나, 약 농도는 작은 섬 크기에 따라 조정 될 필요가 있을 수 있습니다., 특히 다른 종 또는 비 섬 spheroids에서 섬. 참고로, 비인간 영장류 본도의 평균 직경은 약 150 μm^15이다.
4. 스페로이드 판의 준비 및 섬의 전송
   1. 60 mm x 15mm 세포 배양 접시에 췌도를 수작업으로 골라 조립 된 매체를 함유하여 100 % 순도에 가깝습니다.
      참고: 섬은 명확하게 정의 된 주변과 둥근 표시해야하며, 외분비 조직 오염 물질보다 조밀하게 나타납니다. 손상되거나 마모된 것처럼 보이는 섬을 피하십시오. 이 실험에서, 섬 크기는 직접 측정되지 않았습니다, 우리는 각 우물과 샘플에 대해 대략 동등한 크기의 섬을 선택하려고 시도했지만.
   2. 멀티채널 파이펫을 사용하여 175 μL의 조립된 용지로 스페로이드 마이크로플레이트의 각 웰을 적재합니다.
   3. P20 파이펫세트를 15 μL로 설정하여, 세포 배양 접시로부터 15개의 아일렛을 흡인한다. 작은 섬은 육안으로 파이펫 팁에 볼 수 있어야합니다.
   4. 섬을 스페로이드 마이크로 플레이트로 옮기려면, 하부 파이펫 팁을 우물 바닥으로 옮기고, 간신히 들어 올리고, 천천히 매우 작은 부피(~5 μL)를 피펫으로 내보푸세요. 모든 섬이 파이펫 팁을 남겼는지 확인합니다. 각 우물은 15 개의 섬을 받아야합니다. 때때로 현미경의 밑에 spheroid 마이크로 플레이트를 검사하여 섬이 측면에 달라붙지 않고 각 우물의 바닥에 있는지 확인합니다.
      참고: 섬으로 코너 우물을로드하지 마십시오. 플라스틱에서 산소와 pH 플럭스는 분석 중에 발생할 수 있으며, 이것은 네 개의 코너 웰에서 악화된다.
   5. 모든 섬이 스페로이드 마이크로플레이트로 옮겨지면, 아래 단계를 완료하면서 37°C,_비CO2 인큐베이터에서 마이크로플레이트를 배양한다.
5. 센서 카트리지 로드 및 분석 기 실행
   1. 인큐베이터에서 센서 카트리지를 분리합니다. 각 웰에 대한 포트 A-C는 약물 또는 미디어로 로드되어야 합니다. 섬과 네 개의 코너 웰을 포함하는 우물은 약물로로드해야합니다. 섬이없는 비 코너 우물은 미디어로로드해야합니다. 포트 D는 비워 두면 됩니다. 올리고마이신 또는 매폐의 20 μL로 로드 포트 A(각 센서의 왼쪽 상단). FCCP 또는 용지의 22 μL로 로드 포트 B(오른쪽 상단). 로테네/AA 또는 용지의 25 μL이 있는 로드 포트 C(왼쪽 아래).
   2. 30분 간의 기준선 호흡 주기(5사이클 3분 혼합, 3분 측정), 42분 올리고마이신 측정 주기(3분 혼합 7주기, 3분 측정), 30분 FCCP(3분 혼합 5주기, 3분 측정), 30분 로테노네/AA(3분 혼합 5회, 3분)에 대한 세포외 플럭스 분석기 분석기를 프로그래밍합니다.
   3. 분석기를 실행하고 센서를 교정하고 마이크로 플레이트를 삽입하기 위한 화면의 지침을 따릅니다.

결과

작은 섬을 마이크로 플레이트에 로드하려면 그림 1A와같이 15 μL의 용지로 15 개의 섬을 흡인해야합니다. 섬은 자연스럽게 몇 초 이내에 파이펫 팁의 바닥으로 정착합니다. 그런 다음, 파이펫 팁은 웰의 바닥으로 내린다. 팁은 매우 약간 들어 올려지고 작은 부피 (약 5 μL)가 섬과 함께 파이펫아웃됩니다. 이 기술은 정확한 산소 소비 측정을...

토론

섬 산소 소비의 연구는 이전에 작은 섬의 구형 모양에 의해 방해되었습니다, 배양 표면에 대한 준수의 부족, 그리고 잘 당 필요한 섬의 수. 이 프로토콜에서는 소수의 섬에 대한 섬 산소 소비를 측정하기 위한 96웰 스페로이드 마이크로플레이트의 효능을 강조하고 기술적으로 실현 가능하고 일관된 섬을 취급하고 적재하는 기술을 시연합니다. 결과.

작은 섬이 마이크로 플레이...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style	Corning	430166
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	354240
Conical tube, 50 mL	Falcon	352070
Dextrose anhydrous	Fisher Scientific	BP350-1	For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML	Vistalab	3054-1033	for loading multichannel pipet
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm	Foxx Life Sciences	371-3115-OEM
L-glutamine	Gibco	25030-081	200 mM (100x)
Multichannel pipette tips	ThermoFisher Scientific	94410810
Multichannel pipette, 15-1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672100BT	Recommended
P20, P200, and P1000 pipettes	Eppendorf	2231000602
pH Probe	Hanna Instruments	HI2210-01
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL	Olympus	24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media	Agilent	103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	S7800B	Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini	Agilent	102905-100	Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070	100 mM (100x)
Stereo Microscope	Olympus	SZX9
Syringe (sterile), 5 mL	BD	309603	For sterile filtration
Water (sterile)	Sigma	W3500-500mL