Analisi del consumo di ossigeno dell'isola pancreatica del primate non umano

Riepilogo

Questo protocollo dimostra la misurazione accurata e riproducibile del consumo di ossigeno nelle isole pancreatiche dei primati non umani. Le tecniche di caricamento dell'isolotto e il rivestimento della micropiastra forniscono un quadro per la misurazione efficiente della respirazione in altri tipi di sferoidi coltivati.

Abstract

La misurazione del consumo di ossigeno in gruppi di sferoidi di cellule, come le isole pancreatiche ex vivo, è stata storicamente impegnativa. Dimostriamo la misurazione del consumo di ossigeno alle irate utilizzando una micropiastra da 96 pozzetto progettata per la misurazione del consumo di ossigeno negli sferoidi. In questo analisi, le microplacche sferoidi sono rivestite con un adesivo per cellule e tessuti il giorno prima del saggio. Utilizziamo un piccolo volume di soluzione adesiva per incoraggiare l'aderenza alle alteienze solo sul fondo del pozzo. Il giorno del saggio, 15 isolotti vengono caricati direttamente nella base di ogni pozzo utilizzando una tecnica che garantisce un posizionamento ottimale delle isole e una misurazione accurata del consumo di ossigeno. Vari aspetti della respirazione mitocondriale sono sondati farmacologicamente in isolotti di primati non umani, tra cui la respirazione dipendente dall'ATP, la respirazione massima e la perdita di protoni. Questo metodo consente risultati coerenti e riproducibili utilizzando solo un piccolo numero di isolotti per pozzo. Teoricamente può essere applicato a qualsiasi sferoide coltivato di dimensioni simili.

Introduzione

Al fine di mantenere i normali livelli di glucosio nel sangue, la cellula pancreatica deve rilevare le elevazioni nel glucosio e secernere insulina di conseguenza. L'accoppiamento della secrezione di insulina con i livelli di glucosio è direttamente collegato al metabolismo del glucosio e alla produzione di ATP attraverso il fosforonte ossidativo mitocondriale. Così, i mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nell'accoppiamento stimolo-secrezione¹. La valutazione della funzione mitocondriale a cellule z può rivelare difetti che portano a una compromissione della secrezione di insulina. Anche la secrezione di cellule glucagoniche è strettamente legata alla funzione mitocondriale². Anche se le linee cellulari isolate immortalate si sono dimostrate utili per alcuni tipi di saggi, la fisiologia di queste cellule non riassume con precisione la funzione dell'isolotto intero, come dimostra la potenziazione della secrezione di insulina da glucagon^3,4 e l'inibizione della secrezione glucagona da parte di insulina / somatostatina^5,6 in isolotti intatti. Questo dimostra la necessità di misurare il consumo di ossigeno utilizzando isolotti interi e intatti.

Le tecniche per la misurazione della respirometria delle cellule isolli si sono evolute nel tempo, dall'uso di coloranti fluorescenti sensibili all'ossigeno⁷ ai sensori allo stato solido che misurano direttamente il consumo di ossigeno⁸. Inizialmente progettati per monostrato, cellule aderenti, sistemi di piastra di coltura cellulare comunemente utilizzati hanno dimostrato di essere inefficaci per le isole pancreatiche. Poiché le isolotti non aderiscono naturalmente ai pozzi, sono inclini ad essere spinti alla periferia della coltura e con conseguente misurazione imprecisa del consumo di ossigeno⁹. Per combattere questo problema, sono state sviluppate piastre specializzate a 24 pozzetti con una depressione centrale che potrebbe contenere isolotti⁹. Tuttavia, il sistema a piastre 24 pozzi era limitato dal gran numero di isolotti richiesti (50-80 per pozzo) e dal numero di condizioni che potevano essere testate contemporaneamente¹⁰. Il recente sviluppo di microplacche da 96 pozzetti progettate specificamente per l'analisi del flusso extracellulare negli sferoidi ha superato queste barriere, consentendo la misurazione dell'iletmetria con 20 o meno isolotti per pozzo¹⁰.

Qui, dimostriamo l'uso di questo sistema per misurare il consumo di ossigeno in isolotti dal macaco giapponese (Macaca fuscata), un modello animale con biologia simile isolotto agli esseri umani^11,12. In questo protocollo vengono analizzate 15 isole di macachi per pozzo. Nelle nostre mani, 15 isole per bene prodotto un maggiore consumo di ossigeno di base rispetto a meno isole, con robusta attivazione e repressione della respirazione in risposta alla manipolazione farmacologica. Mettiamo in evidenza i passaggi per preparare il saggio, un metodo efficace per un carico coerente di isolotti al centro di ogni pozzo e sfide comuni quando si esegue questo saggio.

Protocollo

1. Preparazione della cartuccia di micropiastra e sensore il giorno prima dell'esecuzione del saggio

Le isole sono state isolate dai macachi giapponesi di tre anni, come descritto in precedenza¹³. Questo metodo è molto simile a quello utilizzato per isolare le isole umane dai donatori di cadaveri, ma differisce dai topi, in cui la pancreata è spesso gonfiata con soluzione di collagenasi mentre l'animale è sotto sedazione e prima della rimozione dell'organo. Il recupero dell'Islet è stato condotto in conformità con le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Oregon National Primate Research Center (ONPRC) e dell'Oregon Health and Science University e sono stati approvati dall'ONPRC IACUC. L'ONPRC rispetta l'Animal Welfare Act e i regolamenti applicati dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) e dalla politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dai National Institutes of Health.

1. Preparazione della microplacca Spheroid
   1. Preparare 3 mL di una soluzione di 0,1 M di bicarbonato di sodio. Filtro sterilizzare la soluzione. Abbiamo utilizzato un filtro da 0,45 m (Tabella dei Materiali).
   2. In una cappa cellulare, aggiungere 200 - L di adesivo per cellule e tessuti (Tabella dei materiali) a 2,8 mL di bicarbonato di sodio 0,1M. Quindi, aggiungere 20 l di questa soluzione sul fondo di ogni pozzetto della micropiastra sferoide 96-well (Tabella dei materiali). Assicurarsi che le bolle d'aria vengano rimosse dalla punta del tubo e che solo il fondo della piastra sia coperto. Il rivestimento della micropiastra impedisce alle isole di spostarsi verso l'alto sui lati dei pozzetti quando i farmaci vengono aggiunti e mescolati nel pozzo durante il saggio.
      NOTA: È necessario rivestire solo come molti pozzi come verrà utilizzato per le isolotti quando il saggio è eseguito. Se verranno utilizzati solo pochi pozzi, la soluzione adesiva cellulare può essere ridimensionata in modo appropriato. L'adesivo cellulare utilizzato nel saggio è una soluzione proteica formulata estratta dalla cozza marina. In alternativa, i pozze a micropiastra possono essere rivestiti con 20 .L di 100 g/mL poli-D-lisina.
   3. Incubare la piastra in un'incubatrice di 37 gradi centigradi, non_CO2, per un'ora.
   4. In un ambiente sterile, la soluzione adesiva a cellule aspirati dalla piastra. Lavare ogni pozzo due volte con 400 gradi l di 37 gradi centigradi di acqua sterile utilizzando un pipet multicanale. Lasciare asciugare all'aria.
   5. Dopo 30-40 minuti, coprire la piastra e conservare pernottamento a 4 gradi centigradi.
2. Idratazione della cartuccia sensore
   1. In un ambiente sterile, aprire il pacchetto cartuccia sensore (Tabella dei materiali) e rimuovere il contenuto. Posizionare la cartuccia del sensore a testa in giù accanto alla piastra di utilità.
   2. Riempire ogni pozzetto della piastra di utilità con acqua sterile di 200 gradi e abbassare la cartuccia del sensore nella piastra di utilità. Posizionare la cartuccia e la piastra di utilità del sensore assemblate in un'incubatrice di 37 gradi centigradi e non CO₂ durante la notte.
3. Preparazione di Calibrant
   1. Aliquota 25 mL di calibro (Tabella dei Materiali) in un tubo conico da 50 mL. Mettere il tubo in un'incubatrice di 37 gradi centigradi, non CO₂ durante la notte.

2. Protocollo per la preparazione dei supporti, il caricamento delle isole e il caricamento della cartuccia sensore il giorno del saggio

1. Preparazione dei mezzi di comunicazione
   1. A 48,5 mL di supporti di base (DMEM minimo, vedere Tabella dei materiali),aggiungere 500 litri ciascuno di 1 mM di piradino di sodio e 2 mM di glutammina. Inoltre, aggiungere 496 l di 200 mg/ml di glucosio (concentrazione finale di glucosio nei media è 5,5 mM).
      NOTA: La concentrazione di glucosio al basale è stata mantenuta costante per questi esperimenti. Tuttavia, il glucosio può anche essere utilizzato per stimolare la respirazione in aggiunta alle manipolazioni farmacologiche descritte colpo¹⁰.
   2. Confermare che il pH è 7,4 s/- 0,1, regolando se necessario.
2. Preparazione della cartuccia del sensore
   1. Estrarre la cartuccia del sensore dall'incubatrice, rimuovere il coperchio della cartuccia del sensore e scaricare l'acqua dai pozzetti. Inserire 200 mL di calibro preriscaldato in ogni pozzo e sostituire il coperchio della cartuccia del sensore.
   2. Posizionare la cartuccia del sensore nell'incubatrice per circa 1 ora (fino a quando necessario).
3. Preparazione di farmaci per il saggio sullo stress mitocondriale
   1. Aprire il kit di stress test (Sommario dei materiali) e rimuovere il contenuto. Make up stock e soluzioni di lavoro per Oligomycin, Carboniyl cianide-4(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), e Rotenone/Antimycin A (AA) come segue.
      1. Oligomicina: aggiungere 630 l di supporti assemblati al tubo per fare un brodo di 100 M. Quindi, diluire a 45 M con i supporti per ottenere la concentrazione del porto (la concentrazione finale del pozzo dopo l'iniezione sarà 4,5 M)
      2. FCCP: aggiungere 720 l di supporti assemblati al tubo per fare un brodo di 100 M. Diluire a 10 M con supporti per ottenere la concentrazione del porto (la concentrazione finale del pozzo sarà di 1 M)
         NOTA: BSA e/o FBS non devono essere aggiunti ai supporti, in quanto ciò può influire sull'azione delle disaccoppiatori mitocondriali¹⁴.
      3. Rotenone/AA: aggiungere 540 -L di supporti assemblati al tubo per fare un brodo 50 M. Diluire a 25 M con supporti per ottenere la concentrazione del porto (la concentrazione finale del pozzo sarà di 2,5 M)
         NOTA: Le concentrazioni di cui sopra hanno prodotto risultati coerenti nelle nostre mani. Ulteriori FCCP non hanno portato a un ulteriore aumento della respirazione. Tuttavia, le concentrazioni di droga possono essere regolate a seconda delle dimensioni dell'isolotto, e soprattutto con isolotti di specie diverse o sferoidi non isolottidi. Per riferimento, il diametro medio di un'isolota di primati non umani è di circa 150 m¹⁵.
4. Preparazione della piastra sferoide e trasferimento di isse
   1. Isolottie pancreatici a selezione a mano in un piatto di coltura cellulare da 60 mm x 15 mm contenente supporti assemblati per ottenere una purezza vicina al 100%.
      NOTA: Le isole dovrebbero apparire arrotondate, con una periferia chiaramente definita, e apparire più dense dei contaminanti del tessuto esocrino. Evitare isolotti che appaiono danneggiati o sfilacciati. In questo esperimento, le dimensioni dell'isolotto non sono state misurate direttamente, anche se abbiamo tentato di raccogliere isole di dimensioni approssimativamente equivalenti per ogni pozzo e campione.
   2. Caricare ogni pozzetto di microplacca sferoide con 175 litri di supporti assemblati utilizzando una pipetta multicanale.
   3. Utilizzando una pipetta P20 impostata su 15 l, aspirare 15 isolotti da piatto di coltura cellulare. Le isolotti devono essere visibili nella punta della pipetta ad occhio nudo.
   4. Trasferire le isoc in micropiastra sferoide, abbassare la punta della pipetta sul fondo del pozzo, sollevare a malapena e lentamente pipetta fuori un volume molto piccolo (5 dollari l). Verificare che tutti gli isolotti abbiano lasciato la punta della pipetta. Ogni pozzo dovrebbe ricevere 15 isolotti. Occasionalmente controllare la microplacca sferoide al microscopio per verificare che le isolette si trovino nella parte inferiore di ogni pozzo piuttosto che attaccate ai lati.
      NOTA: Evitare di caricare i pozzi d'angolo con isolotti. Il flusso di ossigeno e pH fuori dalla plastica può verificarsi durante il saggio, e questo è esacerbato nei quattro pozzi d'angolo.
   5. Una volta che tutte le isole sono state trasferite alla microplacca sferoide, incubare la microplacca in un'incubatrice di 37 gradi centigradi, non CO_2, mentre si completano le fasi riportate di seguito.
5. Caricare la cartuccia del sensore ed eseguire il saggio
   1. Rimuovere la cartuccia del sensore dall'incubatrice. Le porte A-C per ogni pozzo devono essere caricate con farmaci o supporti. Pozzi contenenti isolotti e i quattro pozzi d'angolo dovrebbero essere caricati con droga. I pozzi non angolari senza isolotti devono essere caricati con supporti. La porta D può essere lasciata vuota. Porta di carico A (in alto a sinistra di ogni sensore) con 20 l di oligomycin o supporto. Porta di carico B (in alto a destra) con 22 - L di FCCP o supporto. Porta di carico C (in basso a sinistra) con 25 - L di Rotenone/AA o supporto.
   2. Programmare un test dell'analizzatore di flusso extracellulare per un periodo di respirazione di base di 30 minuti (5 cicli di mix 3 minuti, misura 3 minuti), 42 minuti di misurazione dell'oligomicina (7 cicli di mix di 3 minuti, misura 3 minuti), 30 minuti FCCP (5 cicli di mix 3 minuti, misura 3 minuti) e 30 minuti Rotenone/AA (5 cicli di mix 3 minuti, 3 minuti di misura).
   3. Eseguire il saggio e seguire le istruzioni sullo schermo per calibrare il sensore e inserire la micropiastra.

Risultati

Per caricare le isole in microplacca, 15 isolotti devono essere aspirati in 15 - L di supporto, come mostrato Figura 1A. Le isole si stabiliranno naturalmente verso il fondo della punta del tubo in pochi secondi. Quindi, la punta del pipet viene abbassata sul fondo del pozzo. La punta è molto leggermente sollevata, e un piccolo volume (circa 5 ) viene convogliato insieme alle isole. Questa tecnica si traduce in un posizionamento coerente del...

Discussione

Lo studio del consumo di ossigeno alle isole è stato in precedenza ostacolato dalla forma sferica delle isole, dalla loro mancanza di aderenza alle superfici di coltura e dal numero di isolotti necessari per ogni pozzo. In questo protocollo, mettiamo in evidenza l'efficacia della micropiastra sferoide da 96 pozzetto per misurare il consumo di ossigeno nelle isole su un piccolo numero di isolotti e dimostriamo una tecnica per la movimentazione e il caricamento delle isole tecnicamente fattibile e che produce Risultati.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style	Corning	430166
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	354240
Conical tube, 50 mL	Falcon	352070
Dextrose anhydrous	Fisher Scientific	BP350-1	For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML	Vistalab	3054-1033	for loading multichannel pipet
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm	Foxx Life Sciences	371-3115-OEM
L-glutamine	Gibco	25030-081	200 mM (100x)
Multichannel pipette tips	ThermoFisher Scientific	94410810
Multichannel pipette, 15-1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672100BT	Recommended
P20, P200, and P1000 pipettes	Eppendorf	2231000602
pH Probe	Hanna Instruments	HI2210-01
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL	Olympus	24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media	Agilent	103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	S7800B	Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini	Agilent	102905-100	Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070	100 mM (100x)
Stereo Microscope	Olympus	SZX9
Syringe (sterile), 5 mL	BD	309603	For sterile filtration
Water (sterile)	Sigma	W3500-500mL