JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол демонстрирует точное и воспроизводимое измерение потребления кислорода в нечеловеческих островках поджелудочной железы приматов. Методы загрузки на аклетии и покрытие микроплиты обеспечивают основу для эффективного измерения дыхания в других типах культивированных сфероидов.

Аннотация

Измерение потребления кислорода в сфероидных кластерах клеток, таких как островки поджелудочной железы ex vivo, исторически было сложным. Мы демонстрируем измерение потребления кислорода с помощью 96-лукосновейной микроплиты, предназначенной для измерения потребления кислорода в сфероидах. В этом анализе, сфероидные микроплиты покрыты клеткой и клей ткани на день до начала асссе. Мы используем небольшой объем клеевого раствора, чтобы стимулировать присоединение к аботам только в нижней части скважины. В день проведения асссея 15 островков загружаются непосредственно в основание каждой скважины с помощью техники, обеспечивающей оптимальное позиционирование островков и точное измерение потребления кислорода. Различные аспекты митохондриального дыхания исследуются фармакологически в нечеловеческих островках приматов, включая аТПл-зависимое дыхание, максимальное дыхание и протонную утечку. Этот метод позволяет для последовательных, воспроизводимых результатов, используя только небольшое количество островков на скважину. Теоретически его можно применять к любым культурным сфероидам аналогичного размера.

Введение

Для того, чтобы поддерживать нормальный уровень глюкозы в крови, поджелудочная клетка должна чувствовать возвышения в глюкозе и выделять инсулин соответственно. Связь секреции инсулина с уровнем глюкозы напрямую связана с метаболизмом глюкозы и выработкой АТФ через митохондриальную окислительное фосфорилирование. Таким образом, митохондрии играют важную роль в стимул-секретии связи1. Оценка митохондриальной функции клеток может выявить дефекты, которые приводят к нарушению секреции инсулина. Секреция глюкагона клетками поджелудочной железы также тесно связана с митохондриальной функцией2. Хотя увековеченные линии островковых клеток оказались полезными для некоторых типов анализов, физиология этих клеток не точно резюмировать функцию целых островков, как показано на потенцировании секреции инсулина глюкагоном3,4 и ингибирование секреции глюкагона инсулином/соматостатином5,6 в нетронутых островках. Это свидетельствует о необходимости измерения потребления кислорода с помощью целых, нетронутых островков.

Методы измерения респирометрии клеток на случай развития произошли, начиная с использования чувствительных к кислороду флуоресцентных красителей7 и к твердотельным датчикам, которые непосредственно измеряют потребление кислорода8. Первоначально предназначенные для монослойных, адептов клеток, широко используемых систем клеточной культуры пластины оказались неэффективными для островков поджелудочной железы. Поскольку островки естественным образом не прилипают к скважинам, они склонны к вытеснению на периферию культуры, что приводит к неточному измерению потребления кислорода9. Для борьбы с этой проблемой были разработаны специализированные 24-колодчатые пластины с центральной депрессией, которые могли содержатьостровки. Тем не менее, 24-хорошая система пластины была ограничена большим количеством островков требуется (50-80 на скважину) и количество условий, которые могут быть проверены одновременно10. Недавняя разработка 96-колодчатых микроплит, разработанных специально для внеклеточного анализа потока в сфероидах, преодолела эти барьеры, позволив измерить островок с помощью 20 или меньше островков на10.

Здесь мы демонстрируем использование этой системы для измерения потребления кислорода в островках от японской макаки (Macaca fuscata), модель животных с аналогичной биологией островка для людей11,12. В этом протоколе анализируются 15 островков макаки на скважину. В наших руках, 15 островков на хорошо производится более высокое потребление исходного кислорода, чем меньше островков, с надежной активации и подавления дыхания в ответ на фармакологические манипуляции. Мы выделяем шаги по подготовке к ассею, эффективный метод последовательной загрузки островков в центре каждой скважины, и общие проблемы при выполнении этого асссе.

протокол

1. Подготовка микроплиты и датчика картриджа на день до запуска асссе

Островки были изолированы от трехлетних японских макак, как ранее описано13. Этот метод очень похож на метод, используемый для изоляции островков человека от доноров трупов, но отличается от мышей, в которых панкреата часто раздувается раствором коллагеназы, в то время как животное находится под седативным и до удаления органов. Извлечение на изыма хитов было проведено в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Национального исследовательского центра приматов штата Орегон (ONPRC) и Орегонского университета здравоохранения и науки и было одобрено ONPRC IACUC. ОНПРК соблюдает Закон о защите животных и положения, применяемые Министерством сельского хозяйства Соединенных Штатов (USDA) и Политикой службы общественного здравоохранения в области гуманного ухода и использования лабораторных животных в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным Национальными институтами здравоохранения.

  1. Приготовление сфероидной микроплиты
    1. Приготовьте 3 мл раствора бикарбоната натрия 0,1 М. Фильтр стерилизовать решение. Мы использовали 0,45 мкм фильтр(Таблица материалов).
    2. В капюшоне клеточной культуры добавьте 200 кл/кл клея клеток и тканей(Таблица материалов)до 2,8 мл бикарбоната натрия 0,1 М. Затем добавьте 20 кЛ этого раствора в нижней части каждой скважины 96-хорошо сфероидной микроплиты(Таблица материалов). Убедитесь, что пузырьки воздуха удаляются из трубы кончика и только дно пластины покрыто. Покрытие микроплиты предотвращает движение островков вверх по сторонам колодцев, когда препараты добавляются и смешиваются в колодец во время асссе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это только необходимо, чтобы покрыть, как многие колодцы, как будет использоваться для островков, когда планка запущена. Если будет использовано всего несколько скважин, то раствор клея может быть уменьшен соответствующим образом. Клей, используемый в анализе, представляет собой раствор, разработанный из морской мидии. Кроме того, микроплитные скважины могут быть покрыты 20 мкг/мл поли-D-лизин.
    3. Инкубировать тарелку в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, некосо 2 в течение одного часа.
    4. В стерильной среде, аспирный клейный раствор из пластины. Вымойте каждый колодец два раза с 400 qL стерильной воды 37 градусов по Цельсию с помощью многоканальной трубы. Дайте высохнуть воздуху.
    5. Через 30-40 минут накройте тарелку и храните на ночь при 4 градусах Цельсия.
  2. Гидратация сенсорного картриджа
    1. В стерильной среде откройте пакет картриджей датчика(Таблица материалов)и удалите содержимое. Поместите картридж датчика вверх дном рядом с утилитой пластины.
    2. Заполните каждую скважину утилиты пластины с 200 л стерильной воды и опустите картридж датчика обратно в утилиту пластины. Поместите собранный сенсорный картридж и пластину полезности в инкубатор е37 кВ, не-CO2 на ночь.
  3. Подготовка Калибранта
    1. Aliquot 25 мл калибранта(Таблица материалов) в 50 мл конической трубки. Поместите трубку в инкубатор 37 градусов по Цельсию, не-CO2 на ночь.

2. Протокол по подготовке СРЕДСТВ массовой информации, загрузке островков и загрузке сенсорного картриджа в День Асса

  1. Подготовка средств массовой информации
    1. До 48,5 мл базовых носителей (минимальный DMEM, см. Таблица материалов),добавить 500 л каждый из 1 мм натрия пируват и 2 мм глутамина. Кроме того, добавьте 496 л из 200 мг/мл глюкозы (окончательная концентрация глюкозы в сми составляет 5,5 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Базовая концентрация глюкозы была постоянной для этих экспериментов. Тем не менее, глюкоза также может быть использована для стимулирования дыхания в дополнение к фармакологических манипуляций описано удар10.
    2. Подтвердите, что рН составляет 7,4 евро/- 0,1, при необходимости регулируя.
  2. Приготовление сенсорного картриджа
    1. Выньте из инкубатора сенсорный картридж, снимите крышку патрона датчика и сбросьте воду из колодцев. Поместите 200 мл предварительно разогретого калибранта в каждую скважину и замените крышку патрона датчика.
    2. Поместите картридж датчика обратно в инкубатор в течение 1 часа (до необходимости).
  3. Препарат препаратов для митохондриального стресса
    1. Откройте набор стресс-тестов(Таблица материалов)и удалите содержимое. Составьте запас и рабочие решения для олигомицина, карбонилового цианида-4-(трифторометокси)фенилгидразона (FCCP) и Ротенона/Антимицина А (АА) следующим образом.
      1. Олигомицин: добавить 630 л собранных носителей в трубку, чтобы сделать 100 мкм запаса. Затем разбавить до 45 мкм средствами массовой информации для получения концентрации порта (окончательная концентрация скважины после инъекции составит 4,5 мкм)
      2. FCCP: добавить 720 л собранных носителей в трубку, чтобы сделать 100 мкм запаса. Разбавить до 10 КМ со средствами массовой информации для получения концентрации порта (окончательная концентрация скважины составит 1 мкм)
        ПРИМЕЧАНИЕ: BSA и / или FBS не должны быть добавлены к средствам массовой информации, так как это может повлиять на действие митохондриальных uncouplers14.
      3. Rotenone/AA: добавьте 540 qL собранных носителей в трубку, чтобы сделать 50 мкм запаса. Разбавить до 25 КМ со средствами массовой информации для получения концентрации порта (окончательная концентрация скважины составит 2,5 мкм)
        ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные концентрации дали последовательные результаты в наших руках. Дополнительные FCCP привело к дальнейшему увеличению дыхания. Тем не менее, концентрации наркотиков, возможно, должны быть скорректированы в зависимости от размера островка, и особенно с островками из различных видов или неостровных сфероидов. Для справки, средний диаметр нечеловеческого островка приматов составляет около 150 мкм15.
  4. Приготовление сфероидной пластины и перенос островков
    1. Ручные островки поджелудочной железы в 60 мм х 15 мм клеточной культуры блюдо, содержащее собранные средства массовой информации для получения около 100% чистоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Островки должны казаться округлыми, с четко определенной периферией, и казаться плотнее, чем загрязнители экзокринной ткани. Избегайте островков, которые кажутся поврежденными или изношенными. В этом эксперименте размер островка не измерялся напрямую, хотя мы пытались выбрать островки примерно эквивалентного размера для каждой скважины и образца.
    2. Загрузите каждую скважину сфероидной микроплиты с 175 зл и средствами массовой информации с помощью многоканального пипетка.
    3. Используя пипетку P20, установленную на 15 кЛ, аспир 15 островков из тарелки клеточной культуры. Островки должны быть видны в кончике пипетки невооруженным глазом.
    4. Для переноса островков на сфероидную микроплиту, опустите наконечник пипетки на дно колодца, едва поднимите, и медленно вырвет очень небольшой объем (5 евро). Подтвердите, что все островки покинули наконечник пипетки. Каждая скважина должна получить 15 островков. Иногда проверить сфероид микроплиты под микроскопом, чтобы проверить, что островки находятся в нижней части каждого колодца, а не застрял в стороны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте загрузки угловых колодцев островками. Кислород и рН поток из пластика может произойти во время ассе, и это усугубляется в четырех угловых скважин.
    5. После того, как все островки были переданы в микроплиту сферидов, инкубировать микроплиту в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, не-CO2 при завершении шагов ниже.
  5. Загрузка картриджа датчика и запуск асссея
    1. Удалите сенсорный картридж из инкубатора. Порты A-C для каждой скважины должны быть загружены либо снадобьем, либо спредами. Скважины, содержащие островки и четыре угловые колодцы, должны быть загружены с наркотиками. Неугловые скважины без островков должны быть загружены носителями. Порт D можно оставить пустым. Загрузите порт А (вверху слева от каждого датчика) с 20 зл олигомицина или носителя. Загрузите порт B (вверху справа) с 22 Зл FCCP или носителями. Загрузите порт C (внизу слева) с 25 Зл Ротено/АА или носителями.
    2. Программа внеклеточный анализатор потока анализатор для 30 минут базового периода дыхания (5 циклов 3 минуты смеси, 3 минуты измерения), 42 минуты олигомицина периода измерения (7 циклов 3 минуты смеси, 3 минуты измерения), 30 минут FCCP (5 циклов 3 минуты микс, 3 минуты измерения), и 30 минут Rotenone / AA (5 циклов 3 минуты измерения, 3 минуты измерения), 3 минуты измерения).
    3. Выполнить анализ и следовать инструкциям на экране для калибровки датчика и вставки микроплиты.

Результаты

Для загрузки островков в микроплиту, 15 островков должны быть аспирированы в 15 ЗЛ носителей, как показано на рисунке 1A. Островки, естественно, оседают к нижней части наконечника трубы в течение нескольких секунд. Затем наконечник трубаопроката ...

Обсуждение

Изучение потребления кислорода островка ранее было затруднено сферической формой островков, их несоблюдением культурных поверхностей и количеством островков, необходимых для скважины. В этом протоколе мы подчеркиваем эффективность 96-хорошей сфероидной микроплиты для измерения пот?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить Vanderbilt High Throughput скрининга core для использования их объектов, Agilent биотехнологии, д-р Пол Kievit (Орегон здравоохранения и науки университета) для не-человеческих приматов изысканий приматов, и Эрик Донахью (Университет Вандербильта) за помощь с рисунком 1. J.M.E. была поддержана NIGMS Национальных институтов здравоохранения под номером премии T32GM0007347. М.Г. была поддержана NIH/NIDDK (R24DK090964-06) и Департаментом по делам ветеранов (BX003744).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture dish, 60 mm X 15 mm styleCorning430166
Cell-Tak Cell and Tissue AdhesiveCorning354240
Conical tube, 50 mLFalcon352070
Dextrose anhydrousFisher ScientificBP350-1For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered
Disposable reservoirs (sterile), 25 MLVistalab3054-1033for loading multichannel pipet
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mmFoxx Life Sciences371-3115-OEM
L-glutamineGibco25030-081200 mM (100x)
Multichannel pipette tipsThermoFisher Scientific94410810
Multichannel pipette, 15-1250 μLThermoFisher Scientific4672100BTRecommended
P20, P200, and P1000 pipettesEppendorf2231000602
pH ProbeHanna InstrumentsHI2210-01
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μLOlympus24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base MediaAgilent103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test KitAgilent103015-100Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilentS7800BIncluding prep station with 37 °C non-CO2 incubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak MiniAgilent102905-100Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant
Sodium bicarbonateFisher ScientificBP328-500
Sodium pyruvateGibco11360-070100 mM (100x)
Stereo MicroscopeOlympusSZX9
Syringe (sterile), 5 mLBD309603For sterile filtration
Water (sterile)SigmaW3500-500mL

Ссылки

  1. Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
  2. Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
  3. Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
  4. Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
  5. Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
  6. Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
  7. Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
  8. . Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide Available from: https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019)
  9. Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
  10. Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
  11. Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
  12. Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
  13. Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
  14. Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
  15. Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
  16. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  17. Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

154

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены