نمو الإنسان والأغنام القرنية خلايا الخلايا الانبذيلية على الأغشية الحيوية

Summary

يصف هذا البروتوكول الخطوات الحرجة المطلوبة لإنشاء وتنمية ثقافات الخلايا البُلية القرنية من النباتات المنفّزة للأنسجة البشرية أو الأغنام. كما يتم تقديم طريقة لباطن القرنية الخلايا الفرعية على المواد الحيوية الميمبية.

Abstract

الخلايا الانجيلية القرنية الثقافات لديها ميل للخضوع للانتقال الظهاري إلى mesenchymal (EMT) بعد فقدان الاتصال من خلية إلى خلية. EMT هو ضار للخلايا لأنه يقلل من قدرتها على تشكيل طبقة ناضجة ووظيفية. هنا، نقدم طريقة لإنشاء وsubculturing الإنسان والأغنام الخلايا القرنية الخلايا البُنالتي ة التي تقلل من فقدان الاتصال من خلية إلى خلية. تؤخذ النباتات الإكسابيتية لبطانة القرنية/غشاء ديسميت من القرنيات المانحة وتوضع في زراعة الأنسجة في ظل ظروف تسمح للخلايا بالهجرة الجماعية على سطح الثقافة. وبمجرد تأسيس ثقافة ما، يتم نقل النباتات الجديدة إلى أطباق جديدة لبدء ثقافات جديدة. يستخدم Dispase II لرفع كتل من الخلايا بلطف من لوحات زراعة الأنسجة للاستزراع الفرعي. تعتبر ثقافات الخلايا البُلية القرنية التي تم تأسيسها باستخدام هذا البروتوكول مناسبة لنقلها إلى أغشية المواد الحيوية لإنتاج طبقات خلايا مصممة على الأنسجة لزرعها في التجارب على الحيوانات. يتم وصف جهاز مصنوع خصيصًا لدعم الأغشية الحيوية أثناء زراعة الأنسجة ، ويتم تقديم مثال على الكسب غير المشروع المهندس بالأنسجة المكون من طبقة من الخلايا البطانة القرنية وطبقة من الخلايا النجمية القرنية على جانبي غشاء الكولاجين من النوع الأول.

Introduction

القرنية هي نسيج شفاف يقع في الجزء الأمامي من العين. وهو يتألف من ثلاث طبقات رئيسية: طبقة ظهارية على السطح الخارجي، طبقة ستروما الأوسط، وطبقة داخلية تسمى بطانة القرنية. بطانة القرنية هو طبقة أحادية من الخلايا التي تقع على غشاء الطابق السفلي يسمى غشاء Descemet ويحافظ على شفافية القرنية من خلال تنظيم كمية السوائل التي تدخل ستروما من الفكاهة المائية الكامنة. الكثير من السوائل داخل ستروما يسبب تورم القرنية, التعتيم وفقدان البصر. وبالتالي فإن البطانة أمر حيوي للحفاظ على الرؤية.

يمكن أن يصبح بطانة القرنية مختلة لعدد من الأسباب بما في ذلك الشيخوخة والمرض والإصابة ، والعلاج الحالي الوحيد هو جراحة زرع الأعضاء. خلال هذه الجراحة ، تتم إزالة البطانية وغشاء Descemet من قرنية المريض واستبدالها بطعم البطانة وغشاء Descemet الذي تم الحصول عليه من القرنية المانحة. العديد من الطعوم بطانة تحتوي أيضا على طبقة رقيقة من الأنسجة سترومال للمساعدة في التعامل مع وتعلق القرنية^{المضيفة 1.}

في جميع أنحاء العالم ، فإن الطلب على أنسجة القرنية المانحة لعمليات زرع الأعضاء أكبر من الكمية التي يمكن توفيرها من قبل بنوك العيون^2. لذلك كان هناك دافع لتطوير زرع بطانة القرنية المهندسة الأنسجة التي يمكن استخدامها لتخفيف هذا النقص³. ويستند الأساس المنطقي لذلك على حقيقة أنه في الوقت الحالي ، لا يمكن نقل البطانة من القرنية الفردية إلا إلى مريض واحد ، ومع ذلك ، إذا تم توسيع الخلايا البطانية القرنية أولاً ونمت على السقالات الحيوية في زراعة الأنسجة ، يمكن استخدامها لعلاج مرضى متعددين.

التحديات الرئيسية التي تحتاج إلى معالجة قبل زرع بطانة القرنية المهندسة الأنسجة تصبح خيارا ممكنا للجراحين وتشمل: (1) إنشاء تقنيات لتوسيع خلايا بطانة القرنية ذات جودة عالية ولإنتاج ناضجة و طبقات الخلايا البطانية القرنية الوظيفية في المختبر، و (2) إنشاء تقنيات لزراعة الخلايا على السقالات الحيوية لإنتاج الطعوم المهندسة الأنسجة التي تساوي، أو أفضل من، الطعوم المشتقة من القرنية المانحة التي تستخدم حاليا.

الخلايا القبطانية القرنية لديها إمكانات التكاثر منخفضة جدا في الجسم الحي ولكن يمكن تحفيزها لتقسيم في المختبر⁴. ومع ذلك ، لديهم ميل قوي للخضوع في المختبر الظهارية إلى mesenchymal الانتقال (EMT) ، مما يقلل من قدرتها على تشكيل ناضجة ، طبقة البطانية وظيفية. مشغلات معروفة لEMT في الخلايا البُنفية القرنية تشمل التعرض لعوامل نمو معينة وفقدان الاتصال من خلية إلى خلية⁵. وبالتالي فمن المحتم تقريبا أن ثقافات الخلايا البطانة القرنية التي هي الانزيمية المنفصلة خلال الثقافة الفرعية سوف تخضع للتغييرات المرتبطة EMT. هنا ، نقدم طريقة زراعة الخلايا للخلايا البُنَية القرنية البشرية أو الخرافية التي تم تصميمها لتقليل اضطراب الاتصالات من خلية إلى خلية أثناء مراحل العزل والتوسع والثقافة الفرعية ، للحد من احتمال ية حدوث EMT. وعلاوة على ذلك، فإننا نبين كيف يمكن إنتاج الطعوم المهندسة من الأنسجة التي تشبه البطانة المشتقة من القرنية المانحة/الطعوم النسيجية/الأنسجة النجمية من خلال نمو طبقات الخلايا المستزرعة على جانبي غشاء المادة الحيوية في جهاز تركيب مصنوع خصيصًا.

Protocol

تم الحصول على القرنيات البشرية بموافقة المانحين للبحث من بنك كوينزلاند للعيون واستخدمت بموافقة أخلاقية من مستشفى مترو ساوث ولجنة أخلاقيات البحوث البشرية التابعة للدائرة الصحية (HREC/07/QPAH/048). تم الحصول على قرنيات الأغنام من الحيوانات المنهوبة في مرفق هيرستون للبحوث الطبية التابع لجامعة كوينزلاند بموجب اتفاق لتقاسم الأنسجة.

1. إعداد أدوات تشريح

1. تعقيم اثنين من أزواج من عدد 4 ملقط صانع الساعات إما عن طريق نقع لهم في حل من الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقيقة أو عن طريق التعقيم لهم.

2. إعداد لوحات ثقافة الثقافة المتوسطة والأنسجة

1. إعداد 100 مل من وسط الثقافة التي تحتوي على Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1، 5٪ مصل الأبقار الجنين و 100 U/mL القلم / العقدية. هذه الوسيلة الثقافية كافية لثقافات الخلايا القانية القرنية الأغنام، ومع ذلك، لثقافات الخلايا البُنبوبية القرنية الإنسان ينبغي أن تستكمل المتوسطة مع 50 ميكروغرام/مل مستخلص الغدة النخامية البقرية، 0.08٪ كبريتات شوندرويتين، 200 ميكروغرام/مل كلوريد الكالسيوم و 0.3 mM L-حمض الأسكوربيك 2-الفوسفات. يمكن تخزين الوسط الثقافي في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين.
2. معطف الآبار من 6-بئر لوحة زراعة الأنسجة مع عامل المرفق باستخدام تعليمات الشركة المصنعة ومن ثم إضافة 1 مل من الثقافة المتوسطة لكل مغلفة جيدا. إعداد بئر واحد لكل قرنية.

3- إجراء تشريح الخلايا وإزالة الخلايا

1. ضع القرنية ، جانب البطانة ، في طبق بيتري معقم على خشبة المجهر تشريح. ضبط الإضاءة بحيث يكون سطح القرنية مضاءة بشكل جيد مع تباين كاف لتسليط الضوء على الطبقة الفيوليلية. ضبط التكبير بحيث الحافة وبعض بطانة القرنية المركزية هو في العرض.
2. استخدام الملقط تعقيم الساعات لرفع بلطف والمسيل للدموع في غشاء Descemet بعيدا عن stroma الكامنة(الشكل 1). سوف ينفصل الغشاء عن الستروما كشريط تجعيد الشعر على الفور. ضع الشريط في بئر واحد من لوحة زراعة الأنسجة 6-well التي تم تغليفها بعامل التعلق وتحتوي على 1 مل من وسط الثقافة. يجب أن يبقى غطاء لوحة زراعة الأنسجة في جميع الأوقات ، إلا عندما يتم إضافة النباتات السريعة إليها ، للحد من خطر التلوث.
3. إزالة شرائط من غشاء Descemet من المحيط المتطرف ة من البطانة أولا ثم من المناطق الوسطى في وقت لاحق. ضع جميع الشرائط من قرنية واحدة في بئر واحد داخل لوحة 6-well.
4. احتضان explants في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة المحددة في 5٪ CO₂ و 37 درجة مئوية. ترك الثقافة دون عائق لمدة 2 أيام للسماح للexplants لتسوية ونعلق على سطح لوحة. عادة، ما يصل إلى ثلث explants تفشل في إرفاق لوحة.
5. إزالة المتوسطة وأي explants غير مرفقة من الثقافة بعد 4 أيام وإضافة بلطف 2 مل من الثقافة الطازجة المتوسطة مع الحرص على عدم إزعاج explants المرفقة. يجب تغيير الوسط الثقافي مرتين في الأسبوع.

4. الإنتاج المستمر للخلايا الفيوليليالقرنية من قبل ثقافة explant المسلسل

ملاحظة: يمكن نقل النباتات الخارجية إلى لوحات زراعة الأنسجة الطازجة بعد 10 أيام لإنشاء ثقافات إضافية للخلايا القفيرة.

1. وضع ثقافة explant على خشبة المسرح من المجهر تشريح وضبط الإضاءة والتكبير بحيث explants تكون مرئية.
2. باستخدام ملقط صانع الساعات المعقم ، نتف بلطف كل explant من لوحة الثقافة ونقلها إلى بئر جديد من لوحة زراعة الأنسجة 6- well التي تم المغلفة مع عامل المرفق ويحتوي على 1 مل من وسط الثقافة.
3. السماح للexplants ليستقر على سطح لوحة جديدة لمدة 4 أيام قبل استبدال الوسط الثقافة مع 2 مل من وسط الثقافة الطازجة. تغيير ثقافة المتوسطة تتغير مرتين في الأسبوع.

5. تزايد خلايا البُنزلة القرنية على القسائم الزجاجية لتحليلات الفلورسينالمناعي

ملاحظة: يجب إنشاء ثقافات الخلايا التي من المقرر تحليلها باستخدام الفلور المناعي على القسائم الزجاجية التي يمكن تركيبها على شرائح المجهر الزجاجي بعد إجراء تلطيخ.

1. قم بتعقيم حزمة من القسائم الزجاجية المستديرة التي يبلغ قطرها 13 مم في الأوتوكلاف أو عن طريق نقع الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 15 دقيقة تليها ثلاث شطفات في المالحة العازلة بالفوسفات (PBS).
2. ضع التغطيات الفردية في آبار لوحة زراعة الأنسجة 24 بئرًا ، ومعطفها بعامل التعلق ، ثم أضف 0.5 مل من الثقافة المتوسطة إلى كل بئر.
3. باستخدام ملقط صانع الساعات المعقم إزالة النباتات من لوحات زراعة الأنسجة ونقلها إلى الآبار التي تحتوي على القسائم. السماح للexplants ليستقر على القسائم لمدة 4 أيام قبل تغيير المتوسطة.
4. بعد فترة الحضانة المطلوبة، قم بإصلاح وتلطيخ ثقافات القسيمة داخل آبار الثقافة الخاصة بهم. قم بتركيب القسائم الملطخة على شرائح المجهر الزجاجي للتحليل تحت مجهر مضان.

6. الثقافة الفرعية للخلايا القانية القرنية باستخدام Dispase II

ملاحظة: يمكن إزالة الخلايا الليفية الكبيرة بشكل انتقائي من الثقافات المستفزة في 6-well plates قبل subculturing باستخدام هذا الإجراء. إذا كانت كافة الخلايا لتكون subcultured، لا تنفيذ الخطوات 6.2 إلى 6.4. والهدف من هذا الإجراء هو نقل الخلايا إلى لوحات جديدة مع الحفاظ على اتصالاتها من خلية إلى خلية قدر الإمكان. يجب التعامل مع الخلايا بلطف. وينبغي أن يتم مرور الآبار المُلَكية بالكامل بنسبة 1:2، في حين ينبغي أن تُمر الآبار الفرعية بنسبة 1:1 أو أقل.

1. إزالة المتوسطة من الثقافة وشطف لفترة وجيزة مع DPBS.
2. إضافة 1 مل من فيرسني. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 s.
3. إزالة Versene وإضافة 1 مل من التربيل. احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 3 دقيقة.
4. مراقبة الثقافة باستخدام المجهر على النقيض من المرحلة. اضغط بلطف على الثقافة لطرد الخلايا من اللوحة. بمجرد أن الخلايا الليفية الكبيرة قد انفصلت عن لوحة إزالتها والترب باستخدام ماصة 1 مل. غسل التربي المتبقية قبالة الخلايا المتبقية عن طريق الإزالة مرتين مع 2 مل من DPBS.
5. أضف 1 مل من 1 ملغ/مل ديسباسي الثاني إلى الثقافة واحتضان في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 1 إلى 2 ساعة أو حتى تنفصل جميع الخلايا عن اللوحة. يجب أن تطفو الخلايا تدريجيا بعيدا عن لوحة في كتل.
6. جمع الخلايا باستخدام ماصة 1 مل ونقل إلى 20 مل من DPBS في أنبوب طرد مركزي 50 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقيقة في 300 × ز في درجة حرارة الغرفة.
7. إزالة supernatant وبلطف إعادة تعليق بيليه الخلية عن طريق التثلمع مع 1 مل ماصة في 1 مل من وسط الثقافة. نقل تعليق الخلية إلى بئر أو بئرين من لوحة 6-well، لمرورها بنسبة 1:1 أو 1:2 على التوالي.
8. أعلى حتى المتوسطة في كل بئر لجعل 2 مل ووضع الثقافات في حاضنة زراعة الأنسجة. استبدل الوسط بمل 2 مل من المتوسط الطازج مرتين في الأسبوع.

7. نمو طبقات الخلايا البطانة القرنية على أغشية المواد الحيوية

ملاحظة: يصف الإجراء التالي الخطوات التي ينطوي عليها تركيب مادة بيولوجية دقيقة في جهاز تركيب مصنوع خصيصًا — يسمى غرفة Micro-Boyden — لثقافة الخلايا. يرجى الرجوع إلى المنشور⁶ الأخير للحصول على مزيد من المعلومات حول الجهاز وللحصول على تفاصيل الشراء.

1. تجميع الغرفة العليا من غرفة بيدن الصغيرة عن طريق وضع أحمر O-حلقة في مركزها.
2. استخدام تريفين من قطر 18 ملم لكمة من القرص من ورقة المواد الحيوية على لوحة قطع البولي تترافلوروإيثيلين (PTFE). ضع هذا القرص على حلقة O الحمراء في الغرفة العليا لحجرة بويدن الصغيرة.
3. المسمار الغرفة السفلى على الغرفة العليا، وتأمين القرص المواد الحيوية في ما بين.
4. نقع غرفة صغيرة بويدن تجميعها في الإيثانول 70٪ لمدة ساعة واحدة لتعقيمه.
5. تزج تماما في غرفة صغيرة بويدن تجميعها في HBSS العقيمة لمدة 10 دقيقة لإزالة الإيثانول. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين. تنفيذ خطوة غسل النهائي لمدة 10 دقيقة في وسط الثقافة غير المكملة.
6. نقل غرفة صغيرة بوايدن المعقمة إلى وسط الثقافة في بئر لوحة 6-well ضمان أن الغرفة العليا هو العلوي. ضبط مستوى الثقافة المتوسطة بحيث يتصل السطح السفلي من غشاء المادة الحيوية ولكن لا يتدفق إلى الغرفة العليا.
7. إعداد تعليق الخلايا الفيوليليالقرنية باستخدام الإجراء المبين في القسم 6. وينبغي تحقيق كثافة كافية للخلايا في التعليق للسماح بكثافة بذر لا تقل عن 100،000 خلية لكل سم² على الغشاء في غرفة بيدن الصغيرة. تبلغ مساحة سطح الثقافة داخل غرفة بيدن الصغيرة 0.5 سم² ويمكن أن تحمل حجمًا يبلغ 100 ميكرولتر. لذلك ، يجب إعداد تعليق يحتوي على 500،000 خلية / مل.
8. ماسيت 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (50،000 الخلايا) على الغشاء في غرفة بيدن الصغيرة. احتضان في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 4 ساعة قبل أن تتصدر المتوسط لغمر الغرفة بالكامل. احتضان الثقافة للفترة الزمنية المطلوبة، واستبدال الوسيط مرتين في الأسبوع.
   ملاحظة: بمجرد أن تعلق الخلايا البطانة القرنية على السطح العلوي من غشاء المادة الحيوية يمكن انقلبت غرفة بيدن الصغيرة داخل الثقافة بشكل جيد بحيث تكون الغرفة السفلية العلوية. ويمكن بعد ذلك إضافة المزيد من الخلايا إلى الغرفة لبدء زراعة الخلايا على السطح الآخر للغشاء. على سبيل المثال، يمكن تطبيق الخلايا النجمية للقرنية بسهولة على السطح البديل وبالتالي محاكاة الموقع النسبي لأنواع خلايا القرنية كما رأينا داخل القرنية الخلفية.

النتائج

يتم تلخيص طريقة عزل وتوسيع الخلايا القرنية البُنالتية من القرنيات البشرية أو الأغنام في الشكل 1 والشكل 2. معظم النباتات المشتقة من القرنيات من 1 إلى 2 سنة الأغنام أو المتبرعين الإنسان أقل من 30 سنة من العمر سوف نعلق على لوحات زرع الأنسجة المغلفة عامل المرفق في...

Discussion

وهناك تحد تقني كبير المرتبطة إنشاء وتوسيع الخلايا البُنْدِية القرنية البشرية هو منع EMT من الحدوث في الثقافات. يمكن أن يتم تشغيل EMT في الخلايا البطانة القرنية عن طريق فقدان الاتصال من خلية إلى خلية، ولكن معظم بروتوكولات ثقافة الخلية لهذه الخلايا تنطوي على التفكك الأنزيمي لخلايا واحدة أثنا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.