生物材料膜上人与羊角膜内皮细胞层的生长

摘要

该协议描述了从人类或绵羊组织外植植物中建立和生长角膜内皮细胞培养的关键步骤。提出了一种在膜状生物材料上对角膜内皮细胞进行亚培养的方法。

摘要

角膜内皮细胞培养体在细胞与细胞失去接触后有发生上皮到中皮过渡（EMT）的倾向。EMT对细胞是有害的，因为它降低了细胞形成成熟和功能层的能力。在这里，我们提出了一种建立和亚培养人类和绵羊角膜内皮细胞培养的方法，以尽量减少细胞与细胞接触的损失。角膜内皮/Descemet膜的外部从供体角膜中取走，在允许细胞集体迁移到培养表面的条件下放入组织培养中。一旦文化建立，外植物被转移到新鲜的板块，以启动新的文化。去巴塞II用于轻轻地将细胞团从组织培养板上提起，用于亚培养。使用该协议建立的角膜内皮细胞培养物适用于转移到生物材料膜，以产生组织工程细胞层，用于动物试验中的移植。介绍了一种在组织培养过程中支持生物材料膜的定制装置，并举例说，由一层角膜内皮细胞和胶原蛋白I型膜两侧的角膜基质细胞组成的组织工程移植物。

引言

角膜是位于眼睛前面的透明组织。它由三个主要层组成:外表面的上皮层、中间的频闪层和称为角膜内皮的内层。角膜内皮是一个单层细胞，位于称为Descemet膜的基底膜上，通过调节从底层水性幽默进入频闪的液体量来保持角膜的透明度。频闪内过多的液体会导致角膜肿胀、不理想和视力丧失。因此，内皮内皮对维持视力至关重要。

角膜内皮可能由于多种原因（包括衰老、疾病和损伤）而功能失调，目前唯一的治疗是移植手术。在这次手术中，内皮和Descemet的膜从患者的角膜上去除，代之以从供体角膜获得的内皮和Descemet膜的移植物。许多内皮移植物也含有一层薄薄的基质组织，以帮助处理和附着到宿主角膜^1。

在全球范围内，移植手术对角膜供体组织的需求大于眼库²所能提供的量。因此，人们一直在推动开发组织工程的角膜内皮移植，可用于缓解这^{一不足3。}其依据是，目前，单个角膜的内皮只能转移到单个患者，但是，如果角膜内皮细胞首先在组织培养的生物材料支架上扩张和生长，它们可用于治疗多个患者。

在组织工程的角膜内皮移植成为外科医生的可行选择之前需要解决的主要挑战包括:（1） 建立扩展高质量角膜内皮细胞和生产成熟和功能性角膜内皮细胞层在体外，和（2）建立技术，在生物材料支架上生长细胞，以产生组织工程移植物，等于或优于目前使用的供体角膜衍生移植物。

角膜内皮细胞在体内具有非常低的增殖潜力，但可以刺激在体外分裂^4。然而，他们有强烈的倾向，经历体外上皮到中皮过渡（EMT），这降低了他们的能力，形成一个成熟的，功能内皮层。角膜内皮细胞中EMT的已知诱因包括接触某些生长因子和细胞与细胞接触的丧失^5。因此，在亚培养过程中酶分离的角膜内皮细胞培养物几乎是不可避免的，这种变化与EMT相关。在这里，我们提出了一种用于人类或绵羊角膜内皮细胞的细胞培养方法，该方法旨在最大限度地减少在隔离、扩张和亚培养阶段细胞与细胞接触的中断，以降低EMT的可能性。此外，我们演示了如何通过在定制安装装置中生物材料膜两侧生长培养细胞层来生成类似于供体角膜衍生内皮/Descemet 膜/体组织移植物的组织工程移植物。

研究方案

经捐赠者同意进行研究的人类角膜从昆士兰眼库获得，并经地铁南方医院和卫生服务部人类研究伦理委员会（HREC/07/QPAH/048）的道德认证使用。根据组织共享协议，在昆士兰大学赫斯顿医学研究设施从安乐死动物身上获得羊角膜。

1. 准备解剖工具

1. 将两对 4 号制表匠钳浸泡在 70% 乙醇溶液中 5 分钟或高压灭菌，使其消毒。

2. 培养培养基板和组织培养板的制备

1. 准备含有Opti-MEM 1 （1x） + GlutaMAX-1、5%胎儿牛血清和100 U/mL笔/链球菌的培养基100 mL。这种培养基培养基足以用于羊角膜内皮细胞培养，然而，对于人类角膜内皮细胞培养基，该培养基应辅以50μg/mL牛脑垂体提取物、0.08%软骨素硫酸盐、200微克/mL氯化钙和0.3 mM L-磷酸2-磷酸盐。培养基可以在黑暗中储存在4°C下两周。
2. 使用制造商的说明，使用附件因子涂覆 6 孔组织培养板的孔，然后向每个涂布孔添加 1 mL 培养基。为每个角膜准备一口井。

3. 除植物解剖和细胞培养程序

1. 将角膜，内皮侧向上，放入无菌培养皿在解剖显微镜的阶段。调整照明，使角膜表面光线充足，对比度足够强，以突出内皮层。调整变焦，使边缘和一些中央角膜内皮在视图中。
2. 使用消毒制表机钳轻轻提起并撕裂 Descemet 的膜，使之远离底层频闪（图 1）。膜将从频闪中分离为立即卷曲的条带。将条带放入6孔组织培养板的一个孔中，该孔已涂有附着因子，并含有1 mL培养基。组织培养板的盖子应始终保持，除非在外植中添加外植物，以降低污染风险。
3. 先从内皮层的极端外围去除Descemet膜的条带，然后再从中心区域取出。将一个角膜的所有条材放入 6 孔板内的单个孔中。
4. 在5%CO₂和37°C的加湿细胞培养箱中孵育外植。保持培养层不受干扰2天，让外植沉淀并附着在板面上。通常，多达三分之一的外植无法附着在板上。
5. 4天后，从培养物中取出培养基和任何未附着的外植，并轻轻加入2 mL的新鲜培养基，注意不要打扰附着的外植。文化媒介应每周更改两次。

4. 通过连续外植培养连续生产角膜内皮细胞

注:外植植物可在10天后转移到新鲜组织培养板，以建立额外的角膜内皮细胞培养。

1. 将外植培养装置放在解剖显微镜的舞台上，并调整照明和缩放，使外植可见。
2. 使用消毒制表匠钳，轻轻地从培养板中取出每个出苗，并将其转移到6孔组织培养板的新鲜孔中，该培养板已涂有附着因子，并含有1 mL培养基。
3. 让外植植物在新板表面沉降4天，然后用2 mL的新鲜培养基取代培养基。更改区域性介质每周更改两次。

5. 在玻璃盖玻片上生长角膜内皮细胞，用于免疫荧光分析

注:注定要使用免疫荧光分析的细胞培养物应建立在玻璃盖玻片上，这些玻璃盖玻片可在染色程序后安装在玻璃显微镜玻片上。

1. 在高压灭菌器中消毒一包直径为 13 mm 的圆形玻璃盖玻片，或浸泡在 70% 乙醇中 15 分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗三次。
2. 将单独的盖片放入24孔组织培养板的孔中，涂上附着因子，然后向每口井添加0.5 mL的培养基。
3. 使用消毒制表钳将外植从组织培养板中取出，并将其转移到含有盖玻片的井中。在更换介质之前，让外植物在盖玻片上沉淀4天。
4. 在规定的潜伏期之后，修复和染色其培养井内的盖玻片培养物。将染色盖玻片安装到玻璃显微镜玻片上，在荧光显微镜下进行分析。

6. 使用Dispase II的角膜内皮细胞的亚培养

注:使用本程序进行分栽培之前，可选择性地从6孔板中的外植培养物中去除大成纤维细胞。如果要对所有单元格进行亚培养，请不要执行步骤 6.2 到 6.4。此过程的目的是将细胞转移到新鲜板中，同时尽可能保持细胞与细胞的接触。细胞应轻轻处理。完全流水井应以 1:2 的比例通过，而分流孔应以 1:1 或更低的比例通过。

1. 从培养液中取出培养基，然后用 DPBS 短暂冲洗。
2. 添加 1 mL 的 Versene。在室温下孵育30s。
3. 取出弗塞恩，并添加 1 mL 的 TrypLE。在组织培养培养箱中孵育37°C3分钟。
4. 使用相对比显微镜观察培养。轻轻敲击培养点，将细胞从盘子中移开。一旦大型成纤维细胞从板中分离，就用1mL移液器将其和TrypLE去除。用2 mL的DPBS冲洗两次，洗掉剩余的细胞。
5. 将1mL的1mg/mL除脂酶II加入培养，并在组织培养箱中孵育1至2小时，或直到所有细胞从板中分离。细胞应逐渐漂浮在团块中，远离板。
6. 使用 1 mL 移液器收集细胞，并在 50 mL 离心管中转移到 20 mL 的 DPBS。在室温下在300 x g下离心5分钟。
7. 在1mL培养基中，用1mL移液器进行三聚，取出上清液并轻轻重新悬浮细胞颗粒。将电池悬架转移到 6 孔板的一口或两口井，以 1:1 或 1:2 的比例通过。
8. 在每个井中补上介质，使其达到 2 mL，并将培养物放入组织培养箱中。每周两次用 2 mL 的新鲜介质更换介质。

7. 生物材料膜上角膜内皮细胞层的生长

注:以下步骤描述了在定制的安装设备（称为微型博伊登室）中安装膜状生物材料以用于细胞培养的步骤。有关设备的更多信息和购买详情，请参阅我们最近的出版物^6。

1. 将红色 O 形环放入其中心，将微型博登室的上室组装。
2. 使用直径为 18 mm 的三聚苯乙烯从聚四氟乙烯 （PTFE） 切割板上的生物材料片中冲出圆盘。将光盘放在微型博登室上室的红色 O 形环上。
3. 将下腔拧到上腔室上，将生物材料圆盘固定在中间。
4. 将组装的微型博伊登室浸泡在70%乙醇中1小时，使其消毒。
5. 将组装的微型博登室完全浸入无菌 HBSS 中 10 分钟，以去除乙醇。重复此洗涤步骤两次。在未补充的培养基中执行最后洗涤步骤 10 分钟。
6. 将消毒的微博登室转移到 6 孔板的孔中的培养介质，以确保上室位于最上面。调整培养基的级别，使其接触生物材料膜的下表面，但不会流入上腔。
7. 使用第6节概述的程序，准备暂停角膜内皮细胞。悬浮液中的细胞密度应达到足够的，使微博伊登室的膜上每cm²的播种密度至少为100，000个。微博伊登室内的培养表面积为0.5 cm^2，可容纳100μL的体积。因此，应准备含有500，000个细胞/mL的悬浮液。
8. 将100μL的细胞悬浮液（50，000个细胞）移液器放在微博伊登室的膜上。在组织培养培养箱中孵育4小时，然后补充介质以完全淹没腔室。在规定的时间内孵育培养，每周更换两次介质。
   注:一旦角膜内皮细胞附着在生物材料膜的上表面，微博登室可以在培养井内翻转，使下腔位于最上层。然后，可以将更多的细胞添加到腔室中，以在膜的另一面启动细胞培养。例如，角膜基质细胞可能很容易应用于交替表面，从而模仿角膜细胞类型的相对位置，如在后角膜中所看到的。

结果

图1和图2总结了从人或羊角膜中分离和扩大角膜内皮细胞的方法。大多数来自1至2岁绵羊角膜或30岁以下人类捐赠者的外植植物将在一周内附着在附着因子组织培养板上，然而，发现多达三分之一的外科在这段时间内无法附着，这种情况并不罕见。这些"浮动"的外植可以从培养物中去除。超过30年的人类捐赠者的外植不太可能附着在板上，也不太可能产生...

讨论

与建立和扩大人类角膜内皮细胞相关的一项重大技术挑战是防止EMT在培养物中发生。EMT可以通过细胞与细胞接触的丧失在角膜内皮细胞中触发，然而这些细胞的大多数细胞培养协议在分离和亚培养过程中涉及酶分离到单个细胞^。在这里，我们提出了角膜内皮细胞的替代细胞培养方案，将细胞在隔离和亚培养阶段失去接触的风险降至最低。

我们建立角膜内皮?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.