Biyomalzeme Membranlar Üzerinde İnsan ve Koyun Korneal Endotel Hücre Tabakalarının Büyümesi

Özet

Bu protokol, insan veya koyun dokusu eksbitkilerinden kornea endotel hücre kültürleri kurmak ve büyümek için gerekli kritik adımları açıklar. Membranöz biyomalzemeler üzerinde kornea endotel hücrelerinin subculturing için bir yöntem de sunulmaktadır.

Özet

Korneal endotel hücre kültürleri hücre-hücre teması kaybından sonra epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) geçmesi eğilimi vardır. EMT, olgun ve işlevsel bir tabaka oluşturma yeteneklerini azalttığı için hücreler için zararlıdır. Burada, insan ve koyun kornea endotel hücre kültürleri kurmak ve subculturing için bir yöntem sunmak hücre-hücre teması kaybını en aza indirir. Kornea endotel/Descemet zarının eksektimi donör kornealardan alınarak hücrelerin kültür yüzeyine topluca göç etmesini sağlayan koşullar altında doku kültürüne yerleştirilir. Bir kültür kurulduktan sonra, eksebitkiler yeni kültürler ilerler. Dispase II hafifçe alt külleme için doku kültürü plakaları kapalı hücrelerin kümeleri kaldırmak için kullanılır. Bu protokol kullanılarak kurulan korneal endotel hücre kültürleri, hayvan deneylerinde transplantasyon için doku mühendisliği hücre tabakaları üretmek için biyomalzeme zarlarına aktarılması için uygundur. Doku kültürü sırasında biyomateryal membranları desteklemek için özel yapım bir cihaz tanımlanmış ve kornea endotel hücrelerinin bir tabaka ve kollajen tip I membran her iki tarafında kornea stromal hücrelerinin bir tabaka oluşan bir doku mühendislik greft bir örnek sunulmaktadır.

Giriş

Kornea gözün önünde bulunan şeffaf bir dokudur. Üç ana tabakadan oluşur: dış yüzeyde bir epitel tabakası, bir orta stroma tabakası, ve kornea endotel denilen bir iç tabaka. Kornea endotel Descemet membran denilen bir bodrum membran üzerinde oturur hücrelerin bir monolayer ve altta yatan sulu mizah stroma girer sıvı miktarını düzenleyerek kornea şeffaflığını korur. Stroma içinde çok fazla sıvı kornea şişmesine neden olur, opaklık ve görme kaybı. Endotel bu nedenle görme korumak için hayati önem taşımaktadır.

Kornea endotel yaşlanma, hastalık ve yaralanma gibi nedenlerle bir dizi için işlevsiz olabilir, ve tek mevcut tedavi nakli ameliyatı. Bu ameliyat sırasında endotel ve Descemet'in zarı hastanın korneasından çıkarılır ve donör korneadan elde edilen endotel ve Descemet membranı grefti ile değiştirilir. Birçok endotel greftleri de taşıma ve ev sahibi kornea¹eki yardımcı olmak için stromal doku ince bir tabaka içerir.

Dünya çapında, organ nakli ameliyatları için kornea donör dokusu için talep göz bankaları tarafından temin edilebilir miktardan daha fazladır². Bu nedenle bu açığı hafifletmek için kullanılabilecek doku mühendisliği kornea endotel nakli geliştirmek için bir sürücü olmuştur³. Bunun gerekçesi şu anda, tek bir korneadan endotel sadece tek bir hastaya transfer edilebilir gerçeğine dayanmaktadır, ancak, kornea endotel hücreleri ilk genişletilmiş ve doku kültüründe biyomalzeme iskeleler üzerinde yetiştirilen ise, birden fazla hasta tedavisinde kullanılabilir.

Doku mühendisliğikorneal endotel nakli cerrahlar için uygun bir seçenek haline gelmeden önce ele alınması gereken başlıca zorluklar şunlardır: (1) yüksek kaliteli kornea endotel hücrelerini genişletmek ve olgun ve üretmek için teknikler kurmak fonksiyonel kornea endotel hücre tabakaları in vitro, ve (2) biyomalzeme iskelelerinde hücreleri büyütmek için teknikler oluşturarak şu anda kullanılan donör kornea kaynaklı greftlere eşit veya daha iyi doku mühendisliği greftler üretmek için.

Korneal endotel hücreleri in vivo çok düşük proliferatif potansiyele sahip ama in vitro bölmek için uyarılabilir⁴. Yine de, onlar in vitro epitelyal-mezenkimal geçiş geçmesi için güçlü bir eğilim var (EMT), hangi olgun, fonksiyonel endotel tabakası oluşturmak için kapasitelerini azaltır. Kornea endotel hücrelerinde EMT için bilinen tetikleyiciler bazı büyüme faktörleri ve hücre-hücre teması kaybı maruz kalma içerir⁵. Bu nedenle alt kültür sırasında enzimatik olarak ayrıştırılan kornea endotel hücre kültürlerinin EMT ile ilişkili değişikliklere uğraması neredeyse kaçınılmazdır. Burada, izolasyon, genişleme ve alt kültür aşamalarında hücre-hücre temaslarının bozulmasını en aza indirmek ve EMT potansiyelini azaltmak için tasarlanmış insan veya koyun kornea endotel hücreleri için bir hücre kültürü yöntemi salıyoruz. Ayrıca, donör kornea kaynaklı endotel/Descemet membran/stromal doku greftlerine benzeyen doku yapımı greftlerin, biyomalzeme zarının her iki tarafında ki kültürlü hücre tabakalarının özel yapım bir montaj cihazında nasıl yetiştirilebildiğini gösteriyoruz.

Protokol

Araştırma için donör onayı ile insan korneaları Queensland Göz Bankası'ndan alındı ve Metro South Hastanesi ve Sağlık Servisi İnsan Araştırma Etik Komitesi (HREC/07/QPAH/048) etik onayı ile kullanıldı. Koyun korneaları queensland Üniversitesi Herston Tıbbi Araştırma Tesisi'nde bir doku paylaşımı anlaşması ile ötenazi hayvanlardan elde edildi.

1. Diseksiyon araçlarının hazırlanması

1. 4 numaralı saat üreticisi iki çift forsepsi 5 dakika boyunca %70 etanol çözeltisinde ıslatarak veya otoklavlayarak sterilize edin.

2. Kültür ortamı ve doku kültür plakalarının hazırlanması

1. Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, %5 fetal büyükbaş ve 100 U/mL Pen/Strep içeren 100 mL kültür ortamı hazırlayın. Bu kültür ortamı koyun korneal endotel hücre kültürleri için yeterlidir, ancak, insan kornea endotel hücre kültürleri için orta 50 μg / mL sığır hipofiz ekstresi, 0.08% kondroitin sülfat, 200 μg/mL kalsiyum klorür ve 0.3 mM L-askorbik asit 2-fosfat ile takviye edilmelidir. Kültür ortamı karanlıkta 4 °C'de iki hafta saklanabilir.
2. Üreticinin talimatlarını kullanarak Ek Faktörü ile 6 kuyulu doku kültür plakasının kuyularını katlayın ve daha sonra kaplanmış her bir kuyuya 1 mL kültür ortamı ekleyin. Her kornea için bir iyi hazırlayın.

3. Explant diseksiyonu ve hücre kültürü prosedürü

1. Kornea yerleştirin, endotel tarafı yukarı, bir diseksiyon mikroskop aşamasında steril bir Petri kabına. Endüste'yi kornea yüzeyinin endotel tabakasını vurgulamak için yeterli kontrastla iyi aydınlatılmış olması için ayarlayın. Zum, kenar Ve bazı merkezi kornea endotel görünümünde olacak şekilde ayarlayın.
2. Descemet'in membranını altta yatan stromadan yavaşça kaldırmak ve yırtmak için sterilize edilmiş saat çicitlerini kullanın (Şekil 1). Membran hemen kıvrılır bir şerit olarak stroma ayıracak. Şerit, Ek Faktörü ile kaplanmış ve 1 mL kültür ortamı içeren 6 kuyulu doku kültürü plakasının bir kuyuya yerleştirin. Doku kültür plakasının kapağı kontaminasyon riskini azaltmak için eksektisek bitkilerin ekildiği durumlar dışında her zaman tutulmalıdır.
3. Descemet'in membran şeritlerini önce endotel'in aşırı çevresinden sonra da merkezi bölgelerden çıkarın. 6-iyi plaka içinde tek bir kuyuiçine bir kornea tüm şeritler yerleştirin.
4. %5 CO₂ ve 37 °C olarak belirlenen nemli hücre kültürü kuluçka makinesinde ekskütörlerin kuluçkaya yatırın. Ekstesyon ve plaka yüzeyine bağlamak için eksbitki izin vermek için 2 gün boyunca kültür rahatsız edilmeden bırakın. Tipik olarak, eksebitkilerin üçte biri kadarı plakaya bağlanmayı başaramaz.
5. 4 gün sonra orta ve herhangi bir bekar eksbitkiyi kültürden çıkarın ve ekli eksplants rahatsız etmemeye özen alarak yavaşça taze kültür ortamı 2 mL ekleyin. Kültür ortamı haftada iki kez değiştirilmelidir.

4. Seri eksplant kültürüne göre kornea endotel hücrelerinin sürekli üretimi

NOT: Ekstremiteler ek kornea endotel hücre kültürleri oluşturmak için 10 gün sonra taze doku kültür plakaları transfer edilebilir.

1. Eksplant kültürünü bir diseksiyon mikroskobunun aşamasına yerleştirin ve eksplantların görünür olması için aydınlatmayı ve yakınlaştırmayı ayarlayın.
2. Sterilize saat çicitleri kullanarak, her explant'ı kültür plakasından yavaşça koparın ve Ek Faktörü ile kaplanmış ve 1 mL kültür ortamı içeren 6 kuyulu doku kültür plakasının taze kuyuya aktarın.
3. Ekseforların kültür ortamını 2 mL taze kültür ortamıyla değiştirmeden önce 4 gün boyunca yeni plakalarının yüzeyine yerleşmelerine izin verin. Değişim kültür ortamı haftada iki kez değişti.

5. İmmünfloresan analizleri için cam kapaklarda kornea endotel hücrelerinin büyümesi

NOT: İmmünfloresan kullanılarak analiz edilmesi gereken hücre kültürleri, boyama işleminden sonra cam mikroskop slaytlarına monte edilebilen cam kapaklar üzerine kurulmalıdır.

1. Bir otoklavda 13 mm çapındaki yuvarlak cam kapaklı bir paketi sterilize edin veya 15 dakika boyunca %70 etanol ve ardından fosfat tamponlu salin (PBS) üç durulama yıkıntArak.
2. 24 kuyulu doku kültürü plakasının kuyularına tek tek kapakları yerleştirin, Ek Faktörü ile kaplayın ve her kuyuya 0,5 mL kültür ortamı ekleyin.
3. Sterilize saat çicitleri kullanarak doku kültür plakalarından eksplinleri çıkarır ve kapak içeren kuyulara aktarın. Explants orta değiştirmeden önce 4 gün boyunca kapakları üzerine yerleşmek için izin verin.
4. Gerekli kuluçka döneminden sonra, kültür kuyuları içindeki örtüör kültürleri düzeltin ve lekelayın. Lekeli kapakları, floresan mikroskobu altında analiz için cam mikroskop slaytlarına monte edin.

6. Dispase II kullanarak kornea endotel hücrelerinin alt kültürü

NOT: Büyük fibroblastik hücreler bu prosedürü kullanmadan önce 6 kuyulu plakalarda eksplant kültürlerinden seçici olarak çıkarılabilir. Tüm hücreler alt kültüre alınacaksa, 6.2 ile 6.4 adımlarını gerçekleştirmeyin. Bu işlemin amacı hücreleri mümkün olduğunca hücreden hücreye temaslarını sürdürürken yeni plakalara aktarmaktır. Hücreler nazikçe ele alınmalıdır. Tamamen confluent kuyular 1:2 oranında geçilmelidir, subconfluent kuyular ise 1:1 veya daha az bir oranda geçilmelidir.

1. Ortamı kültürden çıkarın ve DPBS ile kısa bir süre durulanın.
2. Versene 1 mL ekleyin. 30 s için oda sıcaklığında kuluçka.
3. Versene kaldırın ve TrypLE 1 mL ekleyin. 3 7 °C'de doku kültürü kuluçka makinesinde 3 dk kuluçkaya yatırın.
4. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak kültürü gözlemleyin. Hücreleri plakadan çıkarmak için kültüre hafifçe dokunun. En kısa sürede büyük fibroblastik hücreler plaka dan ayrılmış onları ve TrypLE 1 mL pipet kullanarak kaldırın. Kalan hücrelerden kalan TrypLE'ı 2 mL DPBS ile iki kez durulayarak yıkayın.
5. 1 mg/mL Dispase II'nin kültüre 1 mL'sini ekleyin ve doku kültürü kuluçka makinesinde 1 ila 2 saat veya tüm hücreler plakadan ayrılana kadar kuluçkaya yatırın. Hücreler yavaş yavaş kümeler halinde plaka uzak yüzen gerekir.
6. Hücreleri 1 mL pipet kullanarak toplayın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpte 20 mL DPBS'ye aktarın. Oda sıcaklığında 300 x g 5 dakika santrifüj.
7. Supernatant çıkarın ve yavaşça kültür orta 1 mL pipet ile triturasyon ile hücre pelet yeniden askıya. Hücre süspansiyonuna 6 kuyuluk bir veya iki kuyuya, sırasıyla 1:1 veya 1:2 oranında geçiş eaktarın.
8. 2 mL yapmak ve doku kültürü kuluçka içine kültürleri yerleştirmek için her kuyuda orta kadar top. Orta yı haftada iki kez 2 mL taze orta ile değiştirin.

7. Biyomalzeme zarlarında kornea endotel hücre tabakalarının büyümesi

NOT: Aşağıdaki yordam, hücre kültürü için mikro Boyden odası adı verilen özel yapım bir montaj cihazına membranöz biyomalzeme nin monte edilmesiyle ilgili adımları açıklar. Cihaz hakkında daha fazla bilgi ve satın alma ayrıntıları için lütfen son yayın^6'ya bakın.

1. Mikro Boyden haznesinin üst odasını, ortasına kırmızı bir O-halkası yerleştirerek birleştirin.
2. Bir politetrafloroetilen (PTFE) kesme tahtası üzerindeki biyomalzeme levhasından bir diski delmek için 18 mm çapında bir trephine kullanın. Bu diski mikro Boyden odasının üst odasına kırmızı o-halkasının üzerine yerleştirin.
3. Alt hazneyi üst hazneye vidala, aradaki biyomalzeme diskini emniyete ala.
4. Sterilize etmek için 1 saat boyunca % 70 etanol içinde monte mikro-Boyden odası ıslatın.
5. Etanol çıkarmak için 10 dakika boyunca steril HBSS'de birleştirilmiş mikro Boyden haznesini tamamen batırın. Bu yıkama adımLarını iki kez tekrarlayın. Tamamlanmamış kültür ortamda 10 dakika için son bir yıkama adımı gerçekleştirin.
6. Sterilize mikro-Boyden haznesini, üst haznenin en üstte olmasını sağlayan 6 kuyulu bir plakanın kuyusundaki kültür ortamına aktarın. Biyomalzeme zarının alt yüzeyine temas eder ancak üst hazneye akmayacak şekilde kültür ortamının seviyesini ayarlayın.
7. Bölüm 6'da belirtilen prosedürü kullanarak kornea endotel hücrelerinin süspansiyon hazırlayın. Mikro-Boyden haznesinde membranda cm² başına en az 100.000 hücrenin tohumlama yoğunluğuna izin vermek için süspansiyonda yeterli hücre yoğunluğu sağlanmalıdır. Mikro Boyden haznesindeki kültür yüzey alanı 0,5 cm² olup 100 μL hacimde olabilir. Bu nedenle 500.000 hücre/mL içeren bir süspansiyon hazırlanmalıdır.
8. Pipet 100 μL hücre süspansiyonu (50.000 hücre) mikro-Boyden odasındamembran üzerine. Doku kültürü kuluçka kuluçka 4 saat için tamamen oda batırmak için orta kadar tepesi önce. Haftada iki kez orta yerine, gerekli süre için kültür kuluçka.
   NOT: Kornea endotel hücreleri biyomateryal membranın üst yüzeyine bağlandıktan sonra mikro-Boyden haznesi kültür içinde ters çevrilebilir, böylece alt oda en üstte yer alabilir. Daha fazla hücre daha sonra membranın diğer yüzeyinde hücre kültürleri başlatmak için odasına eklenebilir. Örneğin, kornea stromal hücreleri kolayca alternatif yüzeye böylece arka kornea içinde görüldüğü gibi kornea hücre tiplerinin göreli konumunu taklit uygulanabilir.

Sonuçlar

Kornea endotel hücrelerinin insan veya koyun kornealarından izole etme ve genişletme yöntemi Şekil 1 ve Şekil 2'deözetlenmiştir. 1 ila 2 yaşındaki koyunların kornealarından elde edilen ekbitkilerin çoğu veya 30 yaşından küçük insan donörler bir hafta içinde Ek Faktör kaplı doku kültür plakalarına eklenecektir, ancak eksebitkilerin üçte birinin bu süre içinde bağlanmadığını görmek olağandışı değildir. Bu 'yüzen' eksplants...

Tartışmalar

İnsan kornea endotel hücrelerinin kurulması ve genişletilmesi ile ilgili önemli bir teknik sorun emt kültürlerde meydana gelen engelliyor. EMT hücre-hücre teması kaybı ile kornea endotel hücrelerinde tetiklenebilir, ancak bu hücreler için çoğu hücre kültürü protokolleri izolasyon ve altkültür¹⁰sırasında tek hücrelere enzimatik dissositasyon içerir. Burada kornea endotel hücreleri için, izolasyon ve alt kültür aşamalarında hücrelerin birbirleriyle teması kaybetme r...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.