Рост человеческих и овец Корнель Эндотелиальных клеточных слоев на биоматериальных Мембранах

Резюме

Этот протокол описывает критические шаги, необходимые для создания и выращивания золнезовых эндотелиальных клеточных культур из эксплантаторов человеческой или овечьей ткани. Также представлен метод субкультирования эндотелиальных клеток роговицы на мембранных биоматериалах.

Аннотация

Корневые эндотелиальные клеточные культуры имеют тенденцию проходить эпителиальный переход к мезенхимальному переходу (EMT) после потери контакта между клетками и клетками. EMT является вредным для клеток, как это снижает их способность формировать зрелый и функциональный слой. Здесь мы представляем метод для создания и субкультивирования человека и овец роговицы эндотелиальных клеточных культур, что сводит к минимуму потерю контакта от клетки к клетке. Выделяющиеся роговицы эндотелия/мембраны Десцемета взяты из донорской роговицы и помещаются в культуру тканей в условиях, которые позволяют клеткам коллективно мигрировать на поверхность культуры. Как только культура была установлена, explants перенесены к свежим плитам для того чтобы начать новые культуры. Dispase II используется для мягкого подъема скоплений клеток от пластин культуры тканей для субкультирования. Корневые эндотелиальные клеточные культуры, которые были созданы с помощью этого протокола, подходят для передачи в биоматериальные мембраны для производства тканевых клеточных слоев для трансплантации в испытаниях на животных. Описано специальное устройство для поддержки биоматериальных мембран во время культуры тканей и представлен пример тканевого трансплантата, состоящего из слоя эндотелиальных клеток роговицы и слоя стромальных клеток роговицы по обе стороны мембраны коллагена I типа.

Введение

Роговица представляет собой прозрачную ткань, расположенную в передней части глаза. Он состоит из трех основных слоев: эпителиального слоя на внешней поверхности, среднего строма слой, и внутренний слой называется роговицы эндотелия. Роговицы эндотелия является монослой клеток, который сидит на подвале мембраны называется мембрана Descemet и он поддерживает прозрачность роговицы, регулируя количество жидкости, которая входит в строму из основных вакавный юмор. Слишком много жидкости в стромы вызывает отек роговицы, непрозрачность и потерю зрения. Поэтому эндотелий имеет жизненно важное значение для поддержания зрения.

Эндотелий роговицы может стать дисфункциональным по ряду причин, включая старение, болезни и травмы, и только в настоящее время лечение трансплантации хирургии. Во время этой операции эндотелий и мембрана Десцемета удаляются из роговицы пациента и заменяются трансплантатом эндотелия и мембраны Десцемета, полученной из донорской роговицы. Многие эндотелия трансплантаты также содержат тонкий слой стромальной ткани, чтобы помочь обработки и привязанности к гостю роговицы¹.

Во всем мире, спрос на ткани донора роговицы для трансплантации операций больше, чем количество, которое может быть поставлено глаз банков². Поэтому было стремление к разработке ткани инженерии роговицы эндотелия трансплантации, которые могут быть использованы для облегчения этого дефицита³. Обоснование этого основано на том факте, что в настоящее время эндотелий от отдельной роговицы может быть передан только одному пациенту, однако, если роговицы эндотелиальных клеток были впервые расширены и выращены на биоматериальных лесах в культуре тканей, они могут быть использованы для лечения нескольких пациентов.

Основные проблемы, которые необходимо решить, прежде чем ткани инженерии трансплантации эндотелия роговицы стать возможным вариантом для хирургов включают в себя: (1) создание методов для расширения роговицы эндотелиальных клеток высокого качества и для производства зрелых и функциональные слои эндотелиальных клеток роговицы in vitro, и (2) создание методов для выращивания клеток на биоматериальных эшафотах для производства тканевых трансплантатов, которые равны, или лучше, чем донорские преврены, полученные из роговицы, которые в настоящее время используются.

Корневые эндотелиальные клетки имеют очень низкий пролиферативный потенциал in vivo, но могут быть стимулированы, чтобы разделить in vitro^4. Тем не менее, они имеют сильную тенденцию проходить в пробирке эпителиальный к мезенхимальному переходу (EMT), что снижает их способность формировать зрелый, функциональный эндотелиальный слой. Известные триггеры для EMT в эндотелиальных клетках роговицы включают воздействие определенных факторов роста и потерю контакта от клетки к клетке^5. Таким образом, почти неизбежно, что культуры эндотелиальных клеток роговицы, которые ферментативно диссоциированы во время субкультуры, претерпит изменения, связанные с EMT. Здесь мы представляем метод клеточной культуры для человека или овец роговицы эндотелиальных клеток, который предназначен для сведения к минимуму нарушения клеток к клетке контактов во время изоляции, расширения и субкультуры этапов, чтобы уменьшить потенциал для EMT. Кроме того, мы демонстрируем, как ткани инженерии трансплантатов, которые напоминают донора роговицы полученных эндотелия / Десцемета мембраны / стромальной ткани трансплантатов может быть произведено путем выращивания культивированных слоев клеток по обе стороны биоматериальной мембраны в специально устройства.

протокол

Роговицы человека с согласия доноров на исследования были получены из Квинслендского банка глаз и использованы с одобрения этики из больницы Metro South Hospital и Комитета по этике человеческих исследований Службы здравоохранения (HREC/07/PAH/048). Овцы роговицы были получены из эвтаназии животных в Херстон медицинских исследований фонда Университета Квинсленда в соответствии с соглашением о разделе тканей.

1. Подготовка инструментов вскрытия

1. Стерилизовать две пары номер 4 часовщикщицы щипцы, либо замачивания их в растворе 70% этанола в течение 5 минут или путем автоматического их.

2. Подготовка плит культуры средних и тканях

1. Подготовьте 100 мл культурной среды, содержащей Opti-MEM 1 (1x) - GlutaMAX-1, 5% сыворотки для крупного рогатого скота плода и 100 U/mL Pen/Strep. Эта среда культуры адекватна для культур ыненно-роговицы эндотелиальных клеток, однако, для культур ы денотелиальной клетки мозоли человека среда должна быть дополнена с 50 мкг/мл экстракта гипофиза, 0,08% хондроитина сульфата, 200 мкг/мл хлорида кальция и 0,3 мм L-аскорповиа. Культурная среда может храниться в темноте при 4 градусах Цельсия в течение двух недель.
2. Пальто скважин 6-хорошо ткани культуры пластины с присоединением фактор с использованием инструкций производителя, а затем добавить 1 мл культуры среды для каждого покрытием хорошо. Приготовьте один колодец для каждой роговицы.

3. Эксплантное рассечение и процедура клеточной культуры

1. Поместите роговицу, эндотелий вверх, в стерильное блюдо Петри на сцене расчленяющего микроскопа. Отрегулируйте освещение так, чтобы поверхность роговицы хорошо освещена с достаточным контрастом, чтобы выделить эндотелиальный слой. Отрегулируйте зум так, чтобы край и некоторые центральные эндотелия роговицы находится в поле зрения.
2. Используйте стерилизованные щипцы часовщика, чтобы аккуратно поднять и оторвать мембрану Десцемета от основной стромы(рисунок 1). Мембрана будет отсоединиться от стромы, как полоса, которая сразу же свернувшись калачиком. Поместите полосу в один колодец из 6-хорошо ткани культуры пластины, которая была покрыта присоединением фактор и содержит 1 мл культуры среды. Крышка пластины культуры ткани должна быть сохранена на все времена, за исключением случаев, когда explants добавляются к нему, чтобы уменьшить риск заражения.
3. Удалите полоски мембраны Десцемета с крайней периферии эндотелия, а затем из центральных областей позже. Поместите все полосы из одной роговицы в одну скважину в 6-колодецной пластине.
4. Инкубировать эксцвенты в увлажненный инкубатор культуры клеток, установленный при 5% CO₂ и 37 градусов по Цельсию. Оставьте культуру спокойной в течение 2 дней, чтобы позволить explants осесть и прикрепить к поверхности пластины. Как правило, до одной трети экстовых растений не прикрепляются к пластине.
5. Удалите среды и любые неприсоединенные explants от культуры после 4 дней и аккуратно добавить 2 мл свежей среде культуры заботясь, чтобы не беспокоить прилагается explants. Культурная среда должна меняться два раза в неделю.

4. Непрерывное производство эндотелиальных клеток роговицы по серийной культуре эксплантатора

ПРИМЕЧАНИЕ: Высаживания могут быть переданы в свежие пластины культуры тканей после 10 дней, чтобы установить дополнительные культуры эндотелиальных клеток роговицы.

1. Поместите культуру explant на стадию расчленяющего микроскопа и отрегулируйте освещение и увеличьте так, чтобы экспланты были видны.
2. Используя стерилизованные щипцы часовщика, аккуратно срывайте каждое растение из своей культурной тарелки и переносите его в свежий колодец 6-хорошей пластины культуры тканей, которая была покрыта фактором присоединения и содержит 1 мл культуры среды.
3. Разрешить explants поселиться на поверхности своей новой пластины в течение 4 дней, прежде чем заменить культуры среды с 2 мл свежей среде культуры. Среда изменения культуры менялась два раза в неделю.

5. Выращивание эндотелиальных клеток роговицы на стеклянных крышках для иммунофлюоресценции анализов

ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные культуры, которым суждено быть проанализированы с помощью иммунофлуоресценции должны быть установлены на стеклянных крышках, которые могут быть установлены на стеклянные слайды микроскопа после процедуры окрашивания.

1. Стерилизовать пачку круглых стеклянных покрывало 13 мм диаметром в автоклаве или замачивания в 70% этанола в течение 15 минут с последующим тремя полосками в фосфатно-буферном солей (PBS).
2. Поместите отдельные крышки в колодцы 24-хорошо ткани культуры пластины, пальто их с приложением фактор, а затем добавить 0,5 мл культуры среды для каждого колодца.
3. Используя стерилизованные щипцы часовщика, удаляют экспланты из их тканевых культурных пластин и переводят их в колодцы, содержащие крышки. Разрешить explants поселиться на крышки в течение 4 дней до изменения среды.
4. После требуемого инкубационного периода, исправить и пятно coverslip культур в пределах их культуры колодцев. Маунт окрашенных охватывает на стеклянный микроскоп слайды для анализа под флуоресценции микроскопа.

6. Субкультура эндотелиальных клеток роговицы с использованием Dispase II

ПРИМЕЧАНИЕ: Большие фибробластные клетки могут быть выборочно удалены из explant культур в 6-наилучшим пластин, прежде чем субкультивации с помощью этой процедуры. Если все клетки должны быть субкультурными, не выполняйте шаги 6.2 до 6.4. Цель этой процедуры заключается в том, чтобы перевести клетки на свежие пластины, сохраняя при этом их контакты от клетки к клетке как можно больше. Клетки должны быть обработаны осторожно. Полностью климинированные скважины должны проходиться в соотношении 1:2, в то время как подковочные скважины должны проходиться в соотношении 1:1 или меньше.

1. Удалите среду из культуры и кратко смойте DPBS.
2. Добавьте 1 мл Версена. Инкубировать при комнатной температуре 30 с.
3. Удалите Versene и добавьте 1 мл трипле. Инкубировать при 37 градусах Цельсия в инкубаторе культуры тканей в течение 3 мин.
4. Наблюдайте за культурой с помощью фазового контрастного микроскопа. Аккуратно коснитесь культуры, чтобы выбить клетки из пластины. Как только крупные фибробластные клетки отделились от пластины, удалите их и трипл с помощью 1 мл пипетки. Вымойте остаточный TrypLE от оставшихся клеток путем полоскания в два раза с 2 мл DPBS.
5. Добавьте 1 мл 1 мг/мл Dispase II к культуре и инкубировать в инкубаторе культуры тканей в течение 1 до 2 ч или до тех пор, пока все клетки не отделяются от пластины. Клетки должны постепенно уплыть от пластины в комки.
6. Соберите клетки с помощью 1 мл пипетки и перенесите до 20 мл DPBS в 50 мл центрифуги трубки. Центрифуга в течение 5 мин при температуре в комнате 300 х г.
7. Удалите супернатант и аккуратно resuspend клеточной гранулы тритурации с 1 мл пипетки в 1 мл культуры среды. Перенесите суспензию ячейки в одну или две скважины из 6-колодца пластины, чтобы пройти в соотношении либо 1:1 или 1:2 соответственно.
8. Пополнить среды в каждом колодце, чтобы сделать 2 мл и поместить культур в инкубатор культуры тканей. Замените среду 2 мл свежей среды два раза в неделю.

7. Рост слоев эндотелиальных клеток роговицы на биоматериальных мембранах

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура описывает шаги, связанные с монтажом мембрана биоматериала в специально мейп-устройстве, называемом микро-Бойден камеры для клеточной культуры. Пожалуйста, обратитесь к нашей недавней публикации⁶ для получения дополнительной информации об устройстве и для получения сведений о покупке.

1. Соберите верхнюю камеру микро-Бойден камеры, поставив красный O-кольцо в его центре.
2. Используйте трефин диаметром 18 мм, чтобы выбить диск из биоматериального листа на разделочной доске потритратрафторэтилен (PTFE). Поместите этот диск над красным O-кольцом в верхней камере камеры микро-Бойдена.
3. Привьте нижнюю камеру верхней палатой, закрепив биоматериальный диск между ними.
4. Замочите собранную микро-Бойден камеру в 70% этанола в течение 1 ч, чтобы стерилизовать его.
5. Полностью погрузите собранную микро-Бойденскую камеру в стерильную HBSS в течение 10 минут, чтобы удалить этанол. Повторите этот шаг мытья дважды. Выполните заключительный шаг мытья в течение 10 минут в недополненной среде культуры.
6. Передача стерилизованной микро-Бойден камеры культуры среды в колодце 6-хорошо пластины обеспечения того, чтобы верхняя камера является верхней. Отрегулируйте уровень среды культуры так, чтобы она контактировала с нижней поверхностью биоматериальной мембраны, но не влилась в верхнюю камеру.
7. Подготовьте суспензию эндотелиальных клеток роговицы с помощью процедуры, изложенной в разделе 6. Достаточная плотность клеток в подвеске должна быть достигнута, чтобы позволить плотность посева, по крайней мере 100000 клеток на см² на мембране в микро-Бойден камеры. Площадь поверхности культуры в микро-Бойденской камере составляет 0,5 см² и может содержать объем 100 л. Поэтому следует подготовить подвеску, содержащую 500 000 ячеек/мл.
8. Пипетка 100 л клеточной суспензии (50 000 клеток) на мембрану в камере микро-Бойдена. Инкубировать в инкубаторе культуры ткани на 4 ч перед пополнением среды, чтобы полностью погрузить камеру. Инкубировать культуру в течение необходимого периода времени, заменяя среду два раза в неделю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как клетки эндотелиальных роговицы прикрепились к верхней поверхности биоматериальной мембраны, микро-Бойден камера может быть перевернута в культуре так, чтобы нижняя палата была верхней. Больше клеток можно после этого добавить к камере для того чтобы начать культуры клетки на другой поверхности мембраны. Например, стромальные клетки роговицы могут быть легко применены к альтернативной поверхности, таким образом имитируя относительное расположение типов клеток роговицы, как видно в задней роговицы.

Результаты

Метод изоляции и расширения эндотелиальных клеток роговицы из роговицы человека или овец обобщен на рисунке 1 и рисунке 2. Большинство эксрастенив, которые являются производными от роговицы от 1 до 2-летних овец или человеческих доноров в возрасте до 30 ле?...

Обсуждение

Значительная техническая проблема, связанная с созданием и расширением эндотелиальных клеток роговицы человека, препятствует возникновению ЭМТ в культурах. EMT может быть вызвано в роговицы эндотелиальных клеток в связи с потерей контакта клетки к клетке, но большинство протоколов кл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.