Croissance des couches cellulaires endothéliales coréennes humaines et brebis sur les membranes biomatériaux

Résumé

Ce protocole décrit les étapes critiques nécessaires pour établir et cultiver les cultures endothéliales cornéennes de cellules des explants des tissus humains ou de mouton. Une méthode pour subculturing cellules endothéliales cornéennes sur les biomatériaux membranaires est également présentée.

Résumé

Les cultures épithéliales de cellules endothéliales cornéennes ont tendance à subir la transition épithéliale-à-mesenchymal (EMT) après perte du contact de cellule-à-cellule. EMT est délétère pour les cellules car il réduit leur capacité à former une couche mature et fonctionnelle. Ici, nous présentons une méthode pour établir et subculper les cultures endothéliales endotales cornées humaines et breturantes qui minimisent la perte de contact de cellule à cellule. Les explants de l’endothélium cornéen/de la membrane de Descemet sont prélevés sur des cornées donneuses et placés dans la culture tissulaire dans des conditions qui permettent aux cellules de migrer collectivement sur la surface de la culture. Une fois qu’une culture a été établie, les explantations sont transférées dans des assiettes fraîches pour initier de nouvelles cultures. Dispase II est utilisé pour soulever doucement des amas de cellules des plaques de culture tissulaire pour la subculturing. Les cultures de cellules endothéliales cornéennes qui ont été établies en utilisant ce protocole sont appropriées pour le transfert aux membranes de biomatériaux pour produire des couches cellulaires tissulaires pour la transplantation dans les essais sur les animaux. Un dispositif fait sur mesure pour soutenir des membranes de biomatériau pendant la culture de tissu est décrit et un exemple d’une greffe tissulaire-engineered composée d’une couche des cellules endothéliales cornéennes et d’une couche des cellules stromal cornéennes de chaque côté d’une membrane de type de collagène I est présentée.

Introduction

La cornée est un tissu transparent qui est situé à l’avant de l’œil. Il est composé de trois couches principales : une couche épithéliale sur la surface extérieure, une couche de stroma moyenne, et une couche intérieure appelée l’endothélium cornéen. L’endothélium cornéen est une monocouche de cellules qui se trouve sur une membrane de sous-sol appelée membrane de Descemet et il maintient la transparence de la cornée en régulant la quantité de liquide qui pénètre dans le stroma de l’humour aqueux sous-jacent. Trop de liquide dans le stroma provoque un gonflement cornéen, l’opacité et la perte de vision. L’endothélium est donc essentiel pour maintenir la vision.

L’endothélium cornéen peut devenir dysfonctionnel pour un certain nombre de raisons, y compris le vieillissement, la maladie et les blessures, et le seul traitement actuel est la chirurgie de transplantation. Pendant cette chirurgie, l’endothélium et la membrane de Descemet sont enlevés de la cornée du patient et remplacés par une greffe de l’endothélium et de la membrane de Descemet obtenues d’une cornée de distributeur. Beaucoup de greffes d’endothélium contiennent également une fine couche de tissu stromal pour faciliter la manipulation et l’attachement à la cornée hôte¹.

Dans le monde entier, la demande de tissus de donneurs cornéens pour les chirurgies de transplantation est supérieure à la quantité qui peut être fournie par les banques oculaires². Il y a donc eu une volonté de développer des greffes d’endothélium cornéen tissulaire qui pourraient être utilisées pour pallier ce manque à gagner³. La raison d’être de ceci est basée sur le fait qu’actuellement, l’endothélium d’une cornée individuelle ne peut être transféré à un seul patient, cependant, si les cellules endothéliales cornéennes ont été d’abord étendues et cultivées sur des échafaudages de biomatériaux dans la culture de tissu, elles pourraient être employées pour traiter plusieurs patients.

Les principaux défis qui doivent être relevés avant que les greffes d’endothélium cornéen tissulal deviennent une option réalisable pour les chirurgiens comprennent: (1) l’établissement de techniques pour l’expansion des cellules endothéliales cornéennes de haute qualité et pour la production de maturité et couches endothéliales endothéliales cornées fonctionnelles in vitro, et (2) établissant des techniques pour cultiver les cellules sur des échafaudages de biomatériaux pour produire des greffes tissulaires qui sont égales, ou meilleures que, les greffes cornées de donneur qui sont actuellement employées.

Les cellules endothéliales cornéennes ont un très faible potentiel de prolifération in vivo, mais peuvent être stimulées pour diviser in vitro⁴. Néanmoins, ils ont une forte tendance à subir une transition épithéliale-mésenchymale in vitro (EMT), ce qui réduit leur capacité à former une couche endothéliale fonctionnelle et mature. Les déclencheurs connus de l’EMT dans les cellules endothéliales cornéennes comprennent l’exposition à certains facteurs de croissance et la perte de contact cellule-cellule⁵. Il est donc presque inévitable que les cultures endothéliales endothéliales cornéennes qui sont enzymatiquement dissociées pendant la sous-culture subiront des changements associés à l’EMT. Ici, nous présentons une méthode de culture cellulaire pour les cellules endothéliales cornéennes humaines ou brebis qui est conçue pour minimiser la perturbation des contacts de cellule à cellule pendant les étapes d’isolement, d’expansion et de sous-culture, afin de réduire le potentiel d’EMT. En outre, nous démontrons comment les greffes tissulaires qui ressemblent à l’endothélium/greffes de tissu stromal de la cornée dérivée de la cornée de donneur peuvent être produites en cultivant des couches de cellules cultivées des deux côtés d’une membrane de biomatériau dans un dispositif de montage fait sur mesure.

Protocole

Des cornées humaines avec le consentement des donateurs pour la recherche ont été obtenues de la Queensland Eye Bank et utilisées avec l’approbation éthique du Comité d’éthique de la recherche humaine du Metro South Hospital and Health Service (HREC/07/QPAH/048). Des cornées de mouton ont été obtenues des animaux euthanasiés au centre médical de recherche de Herston de l’université du Queensland en vertu d’un accord de partage de tissu.

1. Préparation d’outils de dissection

1. Stérilisez deux paires de forceps d’horloger numéro 4 en les trempant dans une solution de 70% d’éthanol pendant 5 min ou en les autoclantant.

2. Préparation des plaques de culture moyenne et de culture tissulaire

1. Préparer 100 ml de milieu de culture contenant opti-MEM 1 (1x) - GlutaMAX-1, 5% de sérum bovin fœtal et 100 U/mL Pen/Strep. Ce milieu de culture est adéquat pour les cultures endothéliales endothéliales de cornée de mouton, cependant, pour les cultures endothéliales endothéliales cornées humaines le milieu devrait être complété avec l’extrait pituitaire bovin de 50 g/mL, 0.08% de sulfate de chondroitin, 200 'g/mL de chlorure de calcium et 0.3 mM d’acide l’ascorbique 2-phosphate. Le milieu de culture peut être stocké dans l’obscurité à 4 oC pendant deux semaines.
2. Enrober les puits d’une plaque de culture de tissu de 6 puits avec le facteur d’attachement en utilisant les instructions du fabricant et puis ajouter 1 ml de milieu de culture à chaque bien enduit. Préparer un puits pour chaque cornée.

3. Dissection d’explantation et procédure de culture cellulaire

1. Placer la cornée, côté endothélium vers le haut, dans un plat stérile Petri sur la scène d’un microscope disséquant. Ajuster l’éclairage de façon à ce que la surface cornéenne soit bien éclairée avec un contraste suffisant pour mettre en évidence la couche endothéliale. Ajustez le zoom de sorte que le bord et un peu d’endothélium cornéen central est en vue.
2. Utilisez des forceps d’horloger stérilisés pour soulever et déchirer doucement la membrane de Descemet du stroma sous-jacent (Figure 1). La membrane se détachera du stroma comme une bande qui se recroqueville immédiatement. Placez la bande dans un puits d’une plaque de culture de tissu de 6 puits qui a été enduite avec le facteur d’attachement et contient 1 ml de milieu de culture. Le couvercle de la plaque de culture tissulaire doit être maintenu en tout temps, sauf lorsque des explants y sont ajoutés, afin de réduire le risque de contamination.
3. Enlever les bandes de la membrane de Descemet de la périphérie extrême de l’endothélium d’abord, puis des régions centrales plus tard. Placer toutes les bandes d’une cornée dans un seul puits dans la plaque de 6 puits.
4. Incuber les explants dans un incubateur de culture cellulaire humidifié fixé à 5% CO₂ et 37 oC. Laissez la culture intacte pendant 2 jours pour permettre aux explants de se déposer et de s’attacher à la surface de la plaque. En règle générale, jusqu’à un tiers des explants ne se fixent pas à la plaque.
5. Retirer le milieu et les explants non attachés de la culture après 4 jours et ajouter doucement 2 ml de milieu de culture frais en prenant soin de ne pas déranger les explants attachés. Le média culturel doit être modifié deux fois par semaine.

4. Production continue de cellules endothéliales cornéennes par culture d’explantation en série

REMARQUE : Les plantes peuvent être transférées dans des plaques de culture de tissus frais après 10 jours afin d’établir d’autres cultures endothéliales endothéliales cornéennes.

1. Placez la culture d’explantation sur le stade d’un microscope disséquant et ajustez l’éclairage et le zoom de sorte que les explants soient visibles.
2. À l’aide de forceps d’horloger stérilisés, arracher délicatement chaque explante de sa plaque de culture et la transférer dans un puits frais d’une plaque de culture de 6 puits qui a été recouverte d’un facteur d’attachement et contient 1 ml de milieu de culture.
3. Laisser les explants s’installer sur la surface de leur nouvelle assiette pendant 4 jours avant de remplacer le milieu de culture par 2 ml de milieu de culture frais. Le milieu de la culture du changement a changé deux fois par semaine.

5. Cultiver des cellules endothéliales cornéennes sur des couvertures en verre pour des analyses d’immunofluorescence

REMARQUE : Les cultures cellulaires qui sont destinées à être analysées à l’aide de l’immunofluorescence doivent être établies sur des couvercles en verre qui peuvent être montés sur des lames de microscope en verre suivant la procédure de coloration.

1. Stériliser un paquet de couvercles en verre rond de 13 mm de diamètre dans un autoclave ou en trempant à 70 % d’éthanol pendant 15 min, suivi de trois rinçants en salin tamponné par phosphate (PBS).
2. Placez les couvertures individuelles dans les puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits, enrobez-les d’un facteur d’attachement, puis ajoutez 0,5 ml de milieu de culture à chaque puits.
3. À l’aide de forceps horrisés, les explants retirent les explants de leurs plaques de culture tissulaire et les transfèrent dans des puits contenant des plaques de couverture. Laisser les explants s’installer sur les couvertures pendant 4 jours avant de changer le milieu.
4. Après la période d’incubation requise, fixer et tacher les cultures de couverture dans leurs puits de culture. Montez les couvercles tachés sur des lames de microscope en verre pour les analyser au microscope à fluorescence.

6. Sous-culture des cellules endothéliales cornéennes utilisant Dispase II

REMARQUE : Les grandes cellules fibroblastiques peuvent être sélectivement enlevées des cultures d’explantation dans les plaques de 6 puits avant de subculper utilisant cette procédure. Si toutes les cellules doivent être sous-cultivées, n’effectuez pas les étapes 6.2 à 6.4. Le but de cette procédure est de transférer les cellules dans des plaques fraîches tout en maintenant leurs contacts de cellule à cellule autant que possible. Les cellules doivent être manipulées en douceur. Les puits complètement confluents doivent être passages à un rapport de 1:2, tandis que les puits subconfluents doivent être passages à un rapport de 1:1 ou moins.

1. Retirez le milieu de la culture et rincez brièvement avec DPBS.
2. Ajouter 1 ml de verse. Incuber à température ambiante pendant 30 s.
3. Retirer le versene et ajouter 1 ml de TrypLE. Incuber à 37 oC dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 3 min.
4. Observez la culture à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Appuyez doucement sur la culture pour déloger les cellules de la plaque. Dès que les grandes cellules fibroblastiques se sont détachées de la plaque, retirez-les et le TrypLE à l’aide d’une pipette de 1 ml. Laver trypLE résiduel des cellules restantes en rinçant deux fois avec 2 ml de DPBS.
5. Ajouter 1 ml de 1 mg/mL de dispase II à la culture et incuber dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 1 à 2 h ou jusqu’à ce que toutes les cellules se soient détachées de la plaque. Les cellules doivent progressivement flotter loin de la plaque en touffes.
6. Recueillir les cellules à l’aide d’une pipette de 1 ml et transférer à 20 ml de DPBS dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Centrifugeuse de 5 min à 300 x g à température ambiante.
7. Retirer le supernatant et resuspendre doucement le granule cellulaire par trituration avec une pipette de 1 ml dans 1 ml de milieu de culture. Transférer la suspension cellulaire à un ou deux puits d’une plaque de 6 puits, au passage à un ratio de 1:1 ou 1:2 respectivement.
8. Rehaussez le milieu dans chaque puits pour faire 2 ml et placez les cultures dans l’incubateur de culture tissulaire. Remplacer le milieu par 2 ml de milieu frais deux fois par semaine.

7. Croissance des couches de cellules endothéliales cornéennes sur les membranes biomatériaux

REMARQUE : La procédure suivante décrit les étapes impliquées dans le montage d’un biomatériau membranaire dans un dispositif de montage sur mesure, appelé chambre micro-Boyden, pour la culture cellulaire. Veuillez consulter notre publication récente⁶ pour plus d’informations sur l’appareil et pour l’achat de détails.

1. Assembler la chambre supérieure de la chambre micro-Boyden en plaçant un anneau O rouge en son centre.
2. Utilisez une trephine de 18 mm de diamètre pour percer un disque d’une feuille de biomatériau sur une planche à découper en polytétrafluoroéthylène (PTFE). Placez ce disque sur l’anneau O rouge dans la chambre haute de la chambre micro-Boyden.
3. Visser la chambre inférieure sur la chambre supérieure, en fixant le disque de biomatériau entre les deux.
4. Faire tremper la chambre micro-Boyden assemblée dans 70% d’éthanol pendant 1 h pour la stériliser.
5. Immerger complètement la chambre micro-Boyden assemblée dans le HBSS stérile pendant 10 min pour enlever l’éthanol. Répétez cette étape de lavage deux fois. Effectuer une dernière étape de lavage pendant 10 min dans un milieu de culture non complété.
6. Transférer la chambre micro-Boyden stérilisée au milieu de culture dans le puits d’une plaque de 6 puits en veillant à ce que la chambre haute soit la plus haute. Ajuster le niveau du milieu de culture afin qu’il entre en contact avec la surface inférieure de la membrane biomatériau, mais ne coule pas dans la chambre supérieure.
7. Préparer une suspension des cellules endothéliales cornéennes en utilisant la procédure décrite à la section 6. Une densité cellulaire suffisante dans la suspension devrait être atteinte pour permettre une densité d’ensemencement d’au moins 100 000 cellules par cm² sur la membrane de la chambre micro-Boyden. La surface de la culture dans la chambre micro-Boyden est de 0,5 cm² et elle peut contenir un volume de 100 L. Par conséquent, une suspension contenant 500 000 cellules/mL doit être préparée.
8. Pipette 100 l de suspension cellulaire (50 000 cellules) sur la membrane de la chambre micro-Boyden. Incuber dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 4 h avant de remplir le milieu pour immerger complètement la chambre. Incuber la culture pendant la période de temps requise, en remplaçant le milieu deux fois par semaine.
   REMARQUE : Une fois que les cellules endothéliales cornéennes se sont attachées à la surface supérieure de la membrane de biomatériau la chambre micro-Boyden peut être renversée au sein de la culture bien de sorte que la chambre inférieure soit la plus haute. Plus de cellules peuvent alors être ajoutées à la chambre pour initier des cultures cellulaires sur l’autre surface de la membrane. Par exemple, les cellules stromales cornéennes peuvent être facilement appliquées à la surface alternative imitant ainsi l’emplacement relatif des types de cellules cornéennes comme on le voit dans la cornée postérieure.

Résultats

La méthode d’isoler et d’élargir les cellules endothéliales cornéennes des cornées humaines ou brebis est résumée dans la figure 1 et la figure 2. La plupart des explants qui sont dérivés des cornées de moutons de 1 à 2 ans ou de donneurs humains de moins de 30 ans se fixent aux plaques de culture tissulaire enduites de facteur d’attachement dans une semaine, cependant, il n’est pas rare de constater que jusqu’à un tiers des explants ne se ...

Discussion

Un défi technique important lié à l’établissement et à l’expansion des cellules endothéliales cornéennes humaines empêche l’EMT de se produire dans les cultures. L’EMT peut être déclenchée dans les cellules endothéliales cornéennes par la perte du contact cellule-cellule, pourtant la plupart des protocoles de culture cellulaire pour ces cellules impliquent la dissociation enzymatique aux cellules simples pendant l’isolement et la sous-culture^10. Ici nous présentons un proto...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.