Crescimento de Camadas de Células Endoteliais De Córnea Humana e Ovelha em Membranas Biomateriais

Resumo

Este protocolo descreve os passos críticos necessários para estabelecer e cultivar culturas de células endoteliais da córnea a partir de explantas de tecido humano ou ovino. Também é apresentado um método para subculindo células endoteliais córneas em biomateriais membranrosas.

Resumo

As culturas de células endoteliais da córnea tendem a se submeter à transição epitelial-mesenquimal (EMT) após a perda do contato celular-célula. O EMT é deletério para as células, pois reduz sua capacidade de formar uma camada madura e funcional. Aqui, apresentamos um método para estabelecer e subculir culturas de células endoteliais de córnea humanas e ovelhas que minimizam a perda do contato celular-célula. Explantas de endotelio córnea/membrana descemet são retiradas de córneas doadoras e colocadas na cultura tecidual em condições que permitem que as células migrem coletivamente para a superfície cultural. Uma vez estabelecida uma cultura, as explantas são transferidas para placas novas para iniciar novas culturas. Dispase II é usado para levantar suavemente aglomerados de células das placas de cultura do tecido para subculturing. Culturas de células endoteliais da córnea que foram estabelecidas usando este protocolo são adequadas para transferência para membranas biomateriais para produzir camadas celulares projetadas por tecido para transplante em ensaios em animais. Um dispositivo personalizado para suportar membranas biomateriais durante a cultura tecidual é descrito e um exemplo de um enxerto projetado por tecido composto por uma camada de células endoteliais da córnea e uma camada de células estrôquias córneas em ambos os lados de uma membrana do tipo I de colágeno é apresentada.

Introdução

A córnea é um tecido transparente que está situado na frente do olho. É composto por três camadas principais: uma camada epitelial na superfície externa, uma camada de estroma médio e uma camada interna chamada endotelio córnea. O endotelio córnea é uma monocamada de células que fica em uma membrana do porão chamada membrana de Descemet e mantém a transparência da córnea regulando a quantidade de fluido que entra no estrume do humor aquoso subjacente. Muito fluido dentro do estrume causa inchaço na córnea, opacidade e perda de visão. O endotelo é, portanto, vital para manter a visão.

O endotelo córnea pode se tornar disfuncional por uma série de razões, incluindo envelhecimento, doença e lesão, e o único tratamento atual é a cirurgia de transplante. Durante esta cirurgia, o endotelo e a membrana de Descemet são removidos da córnea do paciente e substituídos por um enxerto de endotelio e a membrana de Descemet obtida de uma córnea doadora. Muitos enxertos de endotelio também contêm uma fina camada de tecido estrônio para ajudar no manuseio e afixação à córnea^{hospedeira 1}.

Em todo o mundo, a demanda por tecido doador de córnea para cirurgias de transplante é maior do que a quantidade que pode ser fornecida pelos bancos oculares². Por isso, houve um impulso para desenvolver transplantes de endotelio de córnea projetados por tecido que poderiam ser usados para aliviar essa carência³. A lógica para isso baseia-se no fato de que, atualmente, o endotelo de uma córnea individual só pode ser transferido para um único paciente, no entanto, se as células endoteliais da córnea foram expandidas e cultivadas pela primeira vez em andaimes biomateriais na cultura tecidual, elas poderiam ser usadas para tratar vários pacientes.

Os principais desafios que precisam ser enfrentados antes que transplantes de endotelio de córnea projetados por tecido se tornem uma opção viável para os cirurgiões incluem: (1) estabelecer técnicas para expandir células endoteliais da córnea de alta qualidade e para a produção de maduros e camadas funcionais de células endoteliais in vitro, e (2) estabelecendo técnicas para o cultivo das células em andaimes biomateriais para produzir enxertos projetados por tecido que são iguais, ou melhores do que, os enxertos derivados da córnea doador que são usados atualmente.

As células endoteliais da córnea têm um potencial proliferativo muito baixo in vivo, mas podem ser estimuladas a dividir in vitro⁴. No entanto, eles têm uma forte tendência a se submeter à transição epitelial in vitro para messínquimal (EMT), que reduz sua capacidade de formar uma camada endólial madura e funcional. Os gatilhos conhecidos para EMT em células endoteliais da córnea incluem exposição a certos fatores de crescimento e perda do contato celular-célula⁵. É, portanto, quase inevitável que as culturas de células endoteliais da córnea que são enzimáticamente dissociadas durante a subcultura sofrerão mudanças associadas à EMT. Aqui, apresentamos um método de cultura celular para células endoteliais de córneas humanas ou ovelhas que foi projetada para minimizar a interrupção dos contatos entre células durante estágios de isolamento, expansão e subcultura, para reduzir o potencial para a EMT. Além disso, demonstramos como enxertos projetados por tecido que se assemelham ao endotelo derivado de córnea/enxertos de tecido estrônico da Descemet podem ser produzidos pelo cultivo de camadas de células cultivadas em ambos os lados de uma membrana biomaterial em um dispositivo de montagem personalizado.

Protocolo

Córneas humanas com consentimento de doadores para pesquisa foram obtidas do Queensland Eye Bank e usadas com aprovação ética do Comitê de Ética em Pesquisa Humana do Hospital Do Sul e do Serviço de Saúde do Metro South (HREC/07/QPAH/048). Córneas de ovelhas foram obtidas de animais eutanizados no Herston Medical Research Facility da Universidade de Queensland um acordo de compartilhamento de tecidos.

1. Preparação de ferramentas de dissecção

1. Esterilizar dois pares de fórceps de relojoeiro número 4, encharcando-os em uma solução de 70% de etanol por 5 min ou autoclaving-los.

2. Preparação de placas culturais de cultura média e tecidual

1. Prepare 100 mL de meio cultural contendo Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, 5% de soro bovino fetal e 100 U/mL Pen/Estrep. Este meio cultural é adequado para culturas de células endoteliais de ovelha, no entanto, para culturas de células endoteliais da córnea humana, o meio deve ser complementado com extrato pituitário bovino de 50 μg/mL, 0,08% de sulfato de condroitina, cloreto de cálcio de 200 μg/mL e 0,3 mM L-ascorbicácido 2-fosfato. O meio de cultura pode ser armazenado no escuro a 4 °C por duas semanas.
2. Cubra os poços de uma placa de cultura de tecido de 6 poços com fator de apego usando as instruções do fabricante e, em seguida, adicione 1 mL de cultura média a cada poço revestido. Prepare um bem para cada córnea.

3. Dissecação explantária e procedimento de cultura celular

1. Coloque a córnea, o lado endotelio para cima, em uma placa de Petri estéril no palco de um microscópio dissecando. Ajuste a iluminação para que a superfície da córnea seja bem iluminada com contraste suficiente para destacar a camada endotelial. Ajuste o zoom para que a borda e algum endotelo da córnea central esteja em vista.
2. Use fórceps esterilizados para levantar e rasgar suavemente a membrana de Descemet longe do estroma subjacente (Figura 1). A membrana se desprenderá do estroma como uma tira que imediatamente se enrola. Coloque a tira em um poço de uma placa de cultura de tecido de 6 poços que foi revestida com Fator de Apego e contém 1 mL de meio cultural. A tampa da placa de cultura do tecido deve ser mantida em todos os momentos, exceto quando as explantas estão sendo adicionadas a ela, para reduzir o risco de contaminação.
3. Remova as tiras da membrana de Descemet da periferia extrema do endotelo primeiro e depois das regiões centrais mais tarde. Coloque todas as tiras de uma córnea em um único poço dentro da placa de 6 poços.
4. Incubar as explants em uma incubadora de cultura celular umidificada fixada em 5% CO₂ e 37 °C. Deixe a cultura intacta por 2 dias para permitir que as explants se instalem e se afiem à superfície da placa. Normalmente, até um terço das explantas não se prendem à placa.
5. Remova o meio e qualquer explants não anexada da cultura após 4 dias e adicione suavemente 2 mL de cultura fresca meio tomando cuidado para não perturbar as explantas anexadas. O meio cultural deve ser alterado duas vezes por semana.

4. Produção contínua de células endoteliais da córnea pela cultura explante em série

NOTA: Explantas podem ser transferidas para placas de cultura de tecido fresco após 10 dias para estabelecer culturas celulares endoteliais endoteliais adicionais.

1. Coloque a cultura explante no palco de um microscópio dissecando e ajuste a iluminação e o zoom para que as explantas sejam visíveis.
2. Usando fórceps esterilizados, retire suavemente cada explanta de sua placa de cultura e transfira-a para um poço fresco de uma placa de cultura de tecido de 6 poços que foi revestida com Fator de Apego e contém 1 mL de meio cultural.
3. Permita que as explants se instalem na superfície de sua nova placa por 4 dias antes de substituir o meio cultural por 2 mL de meio de cultura fresca. Mudar o meio cultural mudou duas vezes por semana.

5. Células endoteliais de córnea em tampas de vidro para análises de imunofluorescência

NOTA: Culturas celulares destinadas a serem analisadas usando imunofluorescência devem ser estabelecidas em tampas de vidro que podem ser montadas em slides de microscópio de vidro após o procedimento de coloração.

1. Esterilizar um pacote de tampas redondas de vidro de 13 mm de diâmetro em um autoclave ou encharcando 70% de etanol por 15 min seguido por três enxágues em sorofia tampão de fosfato (PBS).
2. Coloque os coverslips individuais nos poços de uma placa de cultura de tecido de 24 poços, cubra-os com Fator de Apego e, em seguida, adicione 0,5 mL de cultura média a cada poço.
3. Usando fórceps esterilizados remover explantas de suas placas de cultura de tecido e transferi-las para poços contendo tampas. Deixe as explants se instalarem nos deslizamentos de cobertura por 4 dias antes de mudar o meio.
4. Após o período de incubação necessário, fixe e colora as culturas de deslizamento de cobertura dentro de seus poços culturais. Monte os deslizamentos de cobertura manchados em slides de microscópio de vidro para análise um microscópio de fluorescência.

6. Subcultura de células endoteliais da córnea usando Dispase II

NOTA: Grandes células fibrobésticas podem ser removidas seletivamente de culturas explantais em placas de 6 poços antes de subculmar usando este procedimento. Se todas as células forem subcultivadas, não realize etapas de 6,2 a 6,4. O objetivo deste procedimento é transferir as células para placas frescas, mantendo seus contatos celular-celular o máximo possível. As células devem ser manuseadas suavemente. Os poços completamente confluentes devem ser repassagems a uma proporção de 1:2, enquanto os poços subconfluentes devem ser passagens a uma proporção de 1:1 ou menos.

1. Retire o meio da cultura e enxágue brevemente com DPBS.
2. Adicione 1 mL de Versene. Incubar a temperatura ambiente de 30 s.
3. Remova o Versene e adicione 1 mL de TrypLE. Incubar a 37 °C na incubadora de cultura tecidual por 3 min.
4. Observe a cultura usando um microscópio de contraste de fase. Toque delicadamente na cultura para desalojar células do prato. Assim que as grandes células fibroblásticas se desprendem da placa remova-as e o TrypLE usando uma pipeta de 1 mL. Lave o trypLE residual das células restantes enxaguando duas vezes com 2 mL de DPBS.
5. Adicione 1 mL de 1 mg/mL Dispase II à cultura e incubar na incubadora de cultura tecidual por 1 a 2h ou até que todas as células tenham se destacado da placa. As células devem gradualmente flutuar para longe da placa em aglomerados.
6. Colete as células usando uma pipeta de 1 mL e transfira para 20 mL de DPBS em um tubo de centrífuga de 50 mL. Centrífuga por 5 min a 300 x g em temperatura ambiente.
7. Remova o supernatant e resuspenda suavemente a pelota celular por trituração com uma pipeta de 1 mL em 1 mL de meio cultural. Transfira a suspensão celular para um ou dois poços de uma placa de 6 poços, para passagem a uma razão de 1:1 ou 1:2, respectivamente.
8. Cubra o meio em cada poço para fazer 2 mL e coloque as culturas na incubadora de cultura tecidual. Substitua o médio por 2 mL de meio fresco duas vezes por semana.

7. Crescimento de camadas de células endoteliais da córnea em membranas biomateriais

NOTA: O procedimento a seguir descreve as etapas envolvidas na montagem de um biomaterial membranme em um dispositivo de montagem feito medida — chamado de câmara micro-Boyden — para cultura celular. Consulte nossa recente publicação⁶ para obter mais informações sobre o dispositivo e para obter detalhes de compra.

1. Monte a câmara superior da câmara micro-Boyden colocando um O-ring vermelho em seu centro.
2. Use um trephine de 18 mm de diâmetro para socar um disco de uma folha biomaterial em uma placa de corte de politetrafluoroethtileno (PTFE). Coloque este disco sobre o anel Vermelho O na câmara superior da câmara micro-Boyden.
3. Dane-se a câmara inferior na câmara superior, protegendo o disco biomaterial no meio.
4. Mergulhe a câmara de microboyden montada em 70% de etanol por 1h para esterilizá-la.
5. Mergulhe completamente a câmara de micro-Boyden montada em HBSS estéril por 10 min para remover o etanol. Repita este passo de lavagem duas vezes. Realize uma etapa final de lavagem por 10 min em meio de cultura não suplementar.
6. Transfira a câmara micro-Boyden esterilizada para o meio de cultura no poço de uma placa de 6 poços garantindo que a câmara superior seja superior. Ajuste o nível de meio cultural para que ele entre em contato com a superfície inferior da membrana biomaterial, mas não flua para a câmara superior.
7. Prepare uma suspensão das células endoteliais da córnea usando o procedimento descrito na seção 6. A densidade celular suficiente na suspensão deve ser alcançada para permitir uma densidade de semeades de pelo menos 100.000 células por cm² na membrana na câmara micro-Boyden. A área de superfície da cultura dentro da câmara micro-Boyden é de 0,5 cm² e pode conter um volume de 100 μL. Portanto, deve ser preparada uma suspensão contendo 500.000 células/mL.
8. Pipette 100 μL de suspensão celular (50.000 células) na membrana na câmara micro-Boyden. Incubar na incubadora de cultura tecidual por 4 h antes de cobrir o meio para submergir completamente a câmara. Incubar a cultura pelo período de tempo necessário, substituindo o médium duas vezes por semana.
   NOTA: Uma vez que as células endoteliais da córnea se apegam à superfície superior da membrana biomaterial, a câmara micro-Boyden pode ser virada dentro da cultura bem para que a câmara inferior seja superior. Mais células podem então ser adicionadas à câmara para iniciar culturas celulares na outra superfície da membrana. Por exemplo, as células estromal córnea podem ser prontamente aplicadas à superfície alternativa, imitando assim a localização relativa dos tipos de células córneas como visto dentro da córnea posterior.

Resultados

O método para isolar e expandir células endoteliais córneas de córneas humanas ou ovelhas é resumido na Figura 1 e Figura 2. A maioria das explantas derivadas das córneas de 1 a 2 anos de idade doadores ou doadores humanos com menos de 30 anos de idade se ligarão às placas de cultura do tecido revestido do Fator anexo dentro de uma semana, no entanto, não é incomum descobrir que até um terço das explantas não se apegam dentro deste período. Essas e...

Discussão

Um desafio técnico significativo associado ao estabelecimento e à expansão das células endoteliais da córnea humana está impedindo que a EMT ocorra nas culturas. A EMT pode ser acionada em células endoteliais da córnea por perda de contato celular-célula, mas a maioria dos protocolos de cultura celular para essas células envolvem dissociação enzimática a células únicas durante o isolamento e subcultura¹⁰. Aqui apresentamos um protocolo alternativo de cultura celular para células en...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.