생체 재료 멤브레인에 인간과 양 각막 내피 세포 층의 성장

요약

이 프로토콜은 인간 또는 양 조직의 이식에서 각막 내피 세포 배양을 확립하고 성장하는 데 필요한 중요한 단계를 설명합니다. 각막 내피 세포를 membranous 생체 재료에 소양성하는 방법도 제시된다.

초록

각막 내피 세포 배양세포는 세포 대 세포 접촉의 손실 후에 상피-중간엽 전이 (EMT)를 겪는 경향이 있습니다. EMT는 성숙하고 기능적인 층을 형성하는 그들의 기능을 감소시키기 때문에 세포에 대한 해로운 입니다. 여기서, 우리는 세포 대 세포 접촉의 손실을 최소화하는 인간과 양 각막 내피 세포 배양을 확립하고 subculcul하는 방법을 제시한다. 각막 내피 /Descemet의 막의 이식은 기증자 각막에서 취하고 세포가 집합적으로 배양 표면에 이동하는 것을 허용하는 조건하에서 조직 배양으로 두는. 문화가 확립되면, 이식은 새로운 문화를 시작하기 위해 신선한 접시로 전송됩니다. Dispase II는 부드럽게 세포의 덩어리를 들어 올리는 데 사용 됩니다 조직 배양 플레이트 에서 subculcul. 이 프로토콜을 사용하여 확립된 각막 내피 세포 배양은 동물 실험에서 이식을 위한 조직 공학세포 층을 생산하기 위하여 생체 재료 막으로 전송하기에 적당하다. 조직 배양 시 생체재료 막을 지지하기 위한 맞춤형 장치가 설명되고, 콜라겐 타입 I 막의 양쪽에 각막 내피 세포층과 각막 기질 세포의 층으로 구성된 조직 공학 이식편의 예가 제시된다.

서문

각막은 눈의 앞에 있는 투명한 조직입니다. 그것은 3개의 중요한 층으로 구성됩니다: 외부 표면에 상피 층, 중간 기질 층 및 각막 내피에게 불린 내부 층. 각막 내피는 Descemet의 막에게 불린 지하 막에 앉는 세포의 단층이고 근본적인 수성 유머에서 기질로 들어가는 액체의 양을 통제해서 각막의 투명성을 유지합니다. 기질 내의 너무 많은 액체는 각막 팽윤, 불투명도 및 비전 손실을 일으키는 원인이 됩니다. 내피는 그러므로 비전을 유지하기 위해 생명입니다.

각막 내피는 노화, 질병 및 상해를 포함하여 여러 가지 이유로 기능 장애가 될 수 있으며 현재 유일한 치료법은 이식 수술입니다. 이 수술 동안, 내피와 Descemet의 막은 환자의 각막에서 제거하고 기증자 각막에서 얻은 내피와 Descemet의 막의 접목으로 대체됩니다. 많은 내피 이식편은 또한 숙주 각막에 취급 그리고 부착을 돕기 위하여 기질 조직의 얇은 층을^{포함합니다 1.}

전 세계적으로, 이식 수술을 위한 각막 기증자 조직에 대한 수요는 안구 은행에 의해 공급될 수 있는 양보다 더 큽하다^2. 그러므로 이 부족을 완화하기 위하여 이용될 수 있던 조직 공학한 각막 내피 이식을 개발하기 위하여 드라이브가 있었습니다^3. 이것에 대한 근거는 현재, 개별 각막에서 내피는 단 하나 환자에게만 전달될 수 있다는 사실에 근거를 두었습니다, 그러나, 각막 내피 세포가 조직 배양에 있는 생체 물자 비계에 첫째로 확장되고 성장한 경우에, 그(것)들은 다중 환자를 취급하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

조직 공학각막 내피 이식이 외과 의사를 위한 실행 가능한 선택권이 되기 전에 해결될 필요가 있는 중요한 도전은 다음을 포함합니다: (1) 고품질의 각막 내피 세포를 확장하고 성숙한 및 생산을 위한 기술을 확립하십시오 기능성 각막 내피 세포층은 시험관내, (2) 현재 사용되고 있는 공여체 각막 유래 이식편과 동등하거나 더 나은 조직 공학 적 이식편을 생산하기 위해 생체 재료 스캐폴드상에서 세포를 성장시키는 기술을 확립한다.

각막 내피 세포는 생체 내에서 매우 낮은 증식 잠재력을 가지고 있지만^시험관내 4에서 분할자극 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 그(것)들은 성숙한, 기능적인 내피 층을 형성하는 그들의 수용량을 감소시키는 시험관 상피-중간엽 전이를 겪는 강한 경향이 있습니다. 각막 내피 세포에 있는 EMT를 위한 알려진 트리거는 특정 성장 인자에 노출 및 세포 대 세포 접촉의 손실을^{포함합니다 5.} 따라서 하위 배양 중에 효소적으로 해리되는 각막 내피 세포 배양이 EMT와 관련된 변화를 겪을 것이라는 것은 거의 피할 수 없습니다. 여기서, 우리는 EMT에 대한 잠재력을 감소시키기 위해 격리, 확장 및 하위 배양 단계 동안 세포 대 세포 접촉의 중단을 최소화하도록 설계된 인간 또는 양 각막 내피 세포에 대한 세포 배양 방법을 제시한다. 또한, 우리는 기증자 각막 유래 내피/Descemet의 막/기질 조직 이식과 유사한 조직 공학 접목이 맞춤형 장착 장치에서 생체 재료 막의 양쪽에 배양된 세포층을 성장시킴으로써 어떻게 생성될 수 있는지 보여줍니다.

프로토콜

연구를 위한 기증자 동의를 가진 인간 각막은 퀸즐랜드 안구 은행에서 얻어지고 메트로 사우스 병원 및 보건 서비스의 인간 연구 윤리 위원회 (HREC/07/QPAH/048)에서 윤리 승인으로 이용되었습니다. 양 각막은 조직 공유 계약에 따라 퀸즐랜드 대학의 허스턴 의학 연구 시설에서 안락사 된 동물에서 얻어졌습니다.

1. 해부 도구의 준비

1. 70% 에탄올 용액에 5분 동안 담그거나 오토클레이브를 하여 4번 워치메이커 집게 2쌍을 살균합니다.

2. 배양 배지 및 조직 배양 판의 준비

1. Opti-MEM 1 (1x) + 글루타맥스-1, 5% 태아 소 세럼 및 100 U/mL 펜/스트렙을 함유한 배양 배지 100 mL을 준비합니다. 이 배양 배지는 양 각막 내피 세포 배양에 적합하지만, 인간 각막 내피 세포 배양배지는 50 μg/mL 소 뇌하수체 추출물, 0.08% 콘드로이틴 황산염, 200 μg/mL 염화염 및 0.3 mM L-아스코르브산 인산으로 보충되어야 합니다. 배양 배지는 2주 동안 4°C에서 어둠 속에서 보관할 수 있다.
2. 제조업체의 지시에 따라 부착 인자와 6 웰 조직 배양 플레이트의 우물을 코팅 한 다음 잘 코팅 된 각 코팅 배지에 1 mL의 배양 배지를 추가합니다. 각 각막에 대해 잘 준비하십시오.

3. 배양 해부 및 세포 배양 절차

1. 해부 현미경의 단계에 멸균 페트리 접시에 각막, 내피 측면을 위로 놓습니다. 각막 표면이 내피 층을 강조하기에 충분한 대비와 잘 조명되도록 조명을 조정합니다. 가장자리와 일부 중앙 각막 내피가 볼 수 있도록 줌을 조정합니다.
2. 멸균된 워치메이커 집게를 사용하여 기본 기질에서 Descemet의 멤브레인을 부드럽게 들어 올리고 찢어냅니다(그림1). 막은 즉시 말려 스트립으로 기질에서 분리됩니다. 부착 인자로 코팅되고 배양 배지 1 mL을 포함하는 6 웰 조직 배양 판의 한 우물에 스트립을 놓습니다. 이식판의 뚜껑은 오염의 위험을 줄이기 위해 이식이 추가되는 경우를 제외하고 항상 보관해야합니다.
3. 먼저 내피의 극단적 인 주변에서 Descemet의 막의 스트립을 제거 한 다음 나중에 중앙 지역에서. 각막의 모든 스트립을 6웰 플레이트 안에 하나의 우물에 넣습니다.
4. 5%_CO2 및 37°C에서 설정된 가습 된 세포 배양 인큐베이터에서 이식을 배양한다. 이식이 정착하고 플레이트 표면에 부착 할 수 있도록 2 일 동안 문화를 방해하지 않은 상태로 둡니다. 일반적으로 최대 1/3의 이식이 플레이트에 부착되지 않습니다.
5. 배지 및 부착되지 않은 외래를 4일 후에 배양으로부터 제거하고 부착된 박식물을 방해하지 않도록 주의하면서 신선한 배양 배지 2 mL를 부드럽게 첨가한다. 배양 배지는 일주일에 두 번 변경해야합니다.

4. 직렬 이식 배양에 의한 각막 내피 세포의 지속적인 생산

참고: 이식은 추가 각막 내피 세포 배양을 확립하기 위해 10 일 후에 신선한 조직 배양 판으로 옮겨질 수 있습니다.

1. 해부 현미경의 단계에 이식 배양을 놓고 발동이 보이도록 조명과 줌을 조정합니다.
2. 멸균 된 워치 메이커 집게를 사용하여 배양 플레이트에서 각 배양을 부드럽게 뽑아 부착 인자로 코팅하고 배양 배지 1 mL을 함유 한 6 웰 조직 배양 플레이트의 신선한 우물로 옮김을 옮김으로 옮김하십시오.
3. 이식체가 새로운 배양 배지의 2 mL로 배양 배지를 대체하기 전에 4 일 동안 새로운 플레이트의 표면에 정착하게하십시오. 변경 배양 매체는 일주일에 두 번 변경되었습니다.

5. 면역 형광 분석을위한 유리 커버립에 각막 내피 세포를 성장

참고 : 면역 형광을 사용하여 분석 될 예정인 세포 배양은 염색 절차에 따라 유리 현미경 슬라이드에 장착 할 수있는 유리 커버 립에 설립되어야합니다.

1. 오클레이브에서 직경 13mm의 둥근 유리 커버립을 살균하거나 70% 에탄올을 15분 동안 담근 다음 인산완충식염수(PBS)에 3개의 헹구를 두십시오.
2. 개별 커버립을 24웰 티슈 배양 판의 우물에 넣고 부착 인자로 코팅한 다음 각각의 웰에 0.5 mL의 배양 배지를 추가합니다.
3. 멸균 된 워치 메이커 집게를 사용하여 조직 배양 판에서 이발을 제거하고 커버 립이 들어있는 우물로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 제거합니다. 배지를 변경하기 전에 4 일 동안 이식자가 커버 립에 정착할 수 있도록하십시오.
4. 필요한 잠복기 후, 커버슬립 배양액을 배양우물 내에서 수정하고 얼룩지게 한다. 형광 현미경으로 분석을 위해 스테인드 커버립을 유리 현미경 슬라이드에 장착합니다.

6. Dispase II를 사용하여 각막 내피 세포의 하위 배양

참고 : 큰 섬유 아세포 세포는이 절차를 사용하여 배양하기 전에 6 웰 플레이트에서 배양 배양물에서 선택적으로 제거 할 수 있습니다. 모든 세포가 배양되어야 하는 경우 6.2 ~ 6.4 단계를 수행하지 마십시오. 이 절차의 목적은 가능한 한 세포 대 세포 접촉을 유지하면서 세포를 신선한 접시로 옮기는 것입니다. 세포를 부드럽게 다루어야합니다. 완전히 동급 우물은 1 :2의 비율로 통과되어야하며, 하위 웰은 1 : 1 이하의 비율로 통과되어야합니다.

1. 배양물에서 배지를 제거하고 DPBS로 간략하게 헹구어 보시다.
2. 1 mL의 구절을 추가합니다. 30s의 실온에서 배양하십시오.
3. 구절을 제거하고 트립LE의 1 mL을 추가합니다. 37°C에서 조직 배양 인큐베이터에서 3분 동안 배양한다.
4. 상 대비 현미경을 사용하여 배양을 관찰합니다. 배양을 부드럽게 탭하여 플레이트에서 세포를 빼냅니다. 큰 섬유 아세포 세포가 플레이트에서 분리되자마자 1 mL 파이펫을 사용하여 트립플레와 이를 제거한다. 잔류 트립플을 DPBS 2 mL로 2회 헹구어 남은 세포를 씻어낸다.
5. 1 mL의 1 mg/mL Dispase II를 배양하고 조직 배양 인큐베이터에서 1-2 시간 동안 또는 모든 세포가 플레이트에서 분리 될 때까지 배양하십시오. 세포는 점차적으로 덩어리에 있는 접시에서 멀리 떠 서야 합니다.
6. 1 mL 파이펫을 사용하여 세포를 수집하고 50 mL 원심분리튜브에서 20 mL의 DPBS로 이송한다. 실온에서 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
7. 상류체를 제거하고 배양 배지의 1 mL에서 1 mL 파이펫으로 삼각에 의해 세포 펠릿을 부드럽게 재중단시켰다. 셀 현탁액을 6웰 플레이트의 하나 또는 두 개의 웰로 옮기고, 각각 1:1 또는 1:2의 비율로 통과한다.
8. 각 웰에서 배지를 위로 올려 2 mL을 만들고 조직 배양 인큐베이터에 배양을 배치한다. 일주일에 두 번 2 mL의 신선한 매체로 매체를 교체하십시오.

7. 생체 재료 막에 각막 내피 세포 층의 성장

참고: 다음 절차에서는 세포 배양용 마이크로 보이덴 챔버라고 하는 맞춤형 장착 장치에 membranous 생체 물질을 장착하는 데 관련된 단계를 설명합니다. 장치에 대한 자세한 내용 과 구매 세부 사항은 최근 간행물^6을 참조하십시오.

1. 중앙에 빨간색 O 링을 배치하여 마이크로 보이든 챔버의 상부 챔버를 조립합니다.
2. 직경 18mm의 트레핀을 사용하여 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 커팅 보드의 생체 재료 시트에서 디스크를 펀치아웃합니다. 이 디스크를 마이크로 보이덴 챔버의 상부 챔버에 있는 빨간색 O-링 위에 놓습니다.
3. 상부 챔버에 하부 챔버를 나사로 조이고 그 사이에 생체 재료 디스크를 고정시다.
4. 조립된 마이크로 보이든 챔버를 70% 에탄올에 1시간 동안 담그고 살균합니다.
5. 조립된 마이크로 보이든 챔버를 멸균 HBSS에 10분 동안 완전히 담그고 에탄올을 제거한다. 이 세척 단계를 두 번 반복합니다. 보충되지 않은 배양 배지에서 10분 동안 최종 세척 단계를 수행합니다.
6. 멸균된 마이크로 보이든 챔버를 6웰 플레이트의 웰에서 배양 배지로 이송하여 상부 챔버가 가장 상부에 있음을 확인한다. 배양 배지의 수준을 조절하여 생체재료 멤브레인의 하부 표면에 접촉하지만 상부 챔버로 유입되지 않도록 한다.
7. 섹션 6에 설명 된 절차를 사용하여 각막 내피 세포의 현탁액을 준비하십시오. 현탁액에 있는 충분한 세포 밀도는 마이크로 보이든 챔버내의 멤브레인상에^cm2당 적어도 100,000 셀의 파종 밀도를 허용하도록 달성되어야 한다. 마이크로 보이든 챔버 내의 배양 표면적은 0.5^cm2이고 100 μL의 부피를 보유할 수 있다. 따라서 500,000 셀/mL을 포함하는 현탁액을 준비해야 합니다.
8. 마이크로 보이든 챔버의 멤브레인 상에 세포 현탁액 (50,000 세포)의 피펫 100 μL. 체내를 완전히 침수시키기 위해 배지를 토핑하기 전에 4시간 동안 조직 배양 인큐베이터에서 배양한다. 필요한 기간 동안 배양을 배양하고 일주일에 두 번 배지를 대체합니다.
   참고 : 각막 내피 세포가 생체 재료 멤브레인의 상부 표면에 부착되면 마이크로 보이덴 챔버는 하부 챔버가 가장 상단에 있도록 배양 내에서 잘 뒤집을 수 있습니다. 더 많은 세포는 그 때 막의 그밖 표면에 세포 배양을 개시하기 위하여 챔버에 추가될 수 있습니다. 예를 들면, 각막 기질 세포는 이렇게 후방 각막 내의 보인 것과 같이 각막 세포 모형의 상대적인 위치를 모방하는 대체 표면에 쉽게 적용될 수 있습니다.

결과

인간 또는 양 각막으로부터 각막 내피 세포를 분리 및 확장하는 방법은 도 1 및 도 2에요약되어 있다. 1~2세 양 또는 30세 미만의 인간 기증자의 각막에서 파생되는 대부분의 이식은 1주일 이내에 부착 인자 코팅 조직 배양판에 부착되지만, 최대 1/3의 이식이 이 시간 내에 부착되지 않는 것은 드문 일이 아닙니다. 이러한 '부동' 이식은 문화에서 제거될 수 ...

토론

인간 각막 내피 세포를 설치하고 확장하는 것과 관련된 중요한 기술적 도전은 EMT가 배양에서 발생하는 것을 방지하고 있습니다. EMT는 세포 대 세포 접촉의 손실에 의해 각막 내피 세포에서 트리거될 수 있고, 그러나 이 세포를 위한 대부분의 세포 배양 프로토콜은 격리 및 subcultureculture 동안 단 하나 세포에 효소 해리를 관련시킵니다^10. 여기에서 우리는 격리와 하위 배양 단계 도...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.