JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

عرض هنا هو وسيلة آمنة وفعالة لتصيب يرقات حمار وحشي مع اللاهوائية الفلورية C. difficile عن طريق الحقن المجهري وmicrogavage غير الباضعة.

Abstract

تعتبر عدوى كلوستريديديس difficile (CDI) واحدة من أكثر التهابات الجهاز الهضمي المرتبطة بالرعاية الصحية شيوعًا في الولايات المتحدة. وقد وصفت الاستجابة المناعية الفطرية ضد C. difficile، ولكن الأدوار الدقيقة للالعدلات والضامة في CDI هي أقل فهما. في الدراسة الحالية ، يتم استخدام يرقات Danio rerio (حمار وحشي) لإنشاء نموذج عدوى C. difficile لتصوير سلوك وتعاون هذه الخلايا المناعية الفطرية في الجسم الحي. لمراقبة C. difficile، تم إنشاء بروتوكول وضع العلامات باستخدام صبغة الفلورسنت. يتم تحقيق عدوى موضعية عن طريق الحقن الدقيق المسمى C. difficile ، الذي ينمو بنشاط في الأمعاء حمار وحشي ويحاكي الضرر الظهاري المعوي في CDI. ومع ذلك ، فإن بروتوكول العدوى المباشرة هذا غازي ويسبب جروحًا مجهرية ، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج التجريبية. وبالتالي ، يتم وصف بروتوكول microgavage أكثر غير الغازية هنا. تتضمن الطريقة تسليم خلايا C. difficile مباشرة إلى الأمعاء من يرقات حمار وحشي عن طريق التنبيب من خلال الفم المفتوح. هذه الطريقة العدوى تحاكي عن كثب مسار العدوى الطبيعية من C. difficile.

Introduction

C. difficile هو الغرام إيجابية, بوغ تشكيل, اللاهوائية, والسموم المنتجة للعصية التي هي السبب الرئيسي للالتهابات الشديدة في الجهاز الهضمي1. وتشمل الأعراض النموذجية لـ CDI الإسهال وآلام البطن والتهاب القولون الزائف القاتل ، ويمكن أن يؤدي في بعض الأحيان إلى الموت1،2. وقد أظهرت الأدلة أن الاستجابات المناعية المضيفة تلعب دورا حاسما في كل من تطور ونتائج هذا المرض3. بالإضافة إلى الاستجابة المناعية ، فإن ميكروبيوتا الأمعاء الأصلية أمر بالغ الأهمية لبداية وإمراض CDI4. في العقد الماضي، زاد كل من عدد الحالات ومعدل الوفيات من CDI بشكل ملحوظ بسبب ظهور سلالة مفرطة من C. difficile (BI/NAP1/027)5،6. ومن شأن الفهم الأفضل لآليات المناعة الكامنة ودور الكائنات الحية المجهرية خلال مبادرة التنمية المجتمعية أن يساعد على النهوض بتطورات وتطورات علاجية جديدة، مما يتيح السيطرة على هذا الوباء بشكل أفضل.

وقد وضعت العديد من النماذج الحيوانية، مثل الهامستر والفأر، لتوفير نظرة ثاقبة في الدفاع المناعي ضد C. difficile7،8. ومع ذلك ، فإن دور الخلايا المناعية الفطرية لا يزال غير مفهوم بشكل جيد ، خاصة وأن سلوك الخلايا المناعية الفطرية مستمد بشكل رئيسي من التحليل النسيجي أو الخلايا المستزرعة في المختبر. ولذلك ، فإن إنشاء نموذج حمار وحشي شفاف للكشف عن الاستجابة المناعية الفطرية لC. difficile داخل كائن فقري حي سيسهل مثل هذه الدراسات. تحتوي يرقات حمار وحشي على نظام مناعة فطري وظيفي ، ولكنها تفتقر إلى الجهاز المناعي التكيفي حتى 4-6 أسابيع بعد الإخصاب9. هذه الميزة الفريدة تجعل يرقات سمك الحمار الوحشي نموذجًا ممتازًا لدراسة الاستجابة المعزولة ووظيفة الخلايا المناعية الفطرية في CDI.

يصف هذا التقرير طرقًا جديدة باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي لدراسة التفاعلات بين الخلايا المناعية المفحلة والفطرية، مثل الضامة والالعدلات. أولاً، يتم تقديم بروتوكول حقن دقيق موضعي يتضمن C. inoculum وتلطيخ. باستخدام في التصوير الفاصل بين الوقت في الجسم الحي ، يتم تسجيل استجابة العدلات والضامة تجاه موقع العدوى ، ويلاحظ البلعوم من البكتيريا عن طريق العدلات والضامة. ومع ذلك ، فقد أفيد أن الحقن نفسه يسبب تلف الأنسجة ويؤدي إلى تجنيد الكريات البيض مستقلة عن البكتيريا10. لذلك ، يتم وصف بروتوكول microgavage غير الباضع لتسليم C. difficile إلى الأمعاء من يرقات حمار وحشي في وقت لاحق. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الميكروبات المعدية المعوية الأصلية حماية مضيف ضد استعمار C. difficile11. لذلك ، تستخدم يرقات حمار وحشي gnotobiotic أيضًا لتهيئ ة سمك الحمار الوحشي المصاب 12. بعد ذلك ، يتم إجراء تشريح الأمعاء لاستعادة قابلة للحياة C. difficile والتحقق من مدة وجودها في المسالك المعوية حمار وحشي.

Protocol

تم تنفيذ جميع الأعمال الحيوانية الموصوفة هنا وفقًا للأنظمة القانونية (EU-Directive 2010/63 ، الترخيص AZ 325.1.53/56.1-TUBS والترخيص AZ 33.9-42502-04-14/1418).

1. إعداد أغروس ذوبان منخفضة، لوحة جل، والحقن المجهري / إبر Microgavage

  1. حل 0.08 غرام من أغروس منخفض الانصهار(جدول المواد، agarose A2576) في 10 مل من 30 ٪ دانيو المتوسطة (0.12 mM MgSO4، 0.18 mM Ca [NO3]2) ، 0.21 mM KCl ، 1.5 mM HEPES (درجة الحموضة = 7.2)، و 17.4 mM NaCl، المخزنة في درجة حرارة الغرفة (RT) للحصول على حل 0.8٪.
    ملاحظة: يمكن استخدام تركيزات أعلى أو أقل من أغاروز. ومع ذلك ، فإن الوقت المطلوب لترسيخ يختلف عن العلامات التجارية المختلفة من agarose ، حتى في نفس التركيز.
  2. إعداد الحقن المجهري وإبر microgavage من الشعيرات الدموية الزجاجية(جدول المواد).
    1. استخدام السطاط micropipette مع الإعدادات التالية (لاحظ أن وحدات محددة إلى السلاط المستخدمة هنا؛ انظر جدول المواد):إبر الحقن المجهري (ضغط الهواء = 500؛ الحرارة = 400؛ سحب = 125؛ السرعة = 75؛ الوقت = 150)؛ وإبر الميكروغافاج (ضغط الهواء = 500؛ الحرارة = 400؛ سحب = 100؛ السرعة = 75؛ الوقت = 150). استخدام تلميح microloader لتحميل 3 ميكرولتر من nuclease خالية H2O في الإبرة سحبت.
    2. إدخال الإبرة في حاقن وربطها بشكل صحيح. ضبط الإبرة إلى زاوية مناسبة للحقن. ضبط ضغط الحقن بين 600-900 hPa لإبرة الحقن المجهري و 200-300 hPa لإبرة gavage.
    3. ضع قطرة من الزيت المعدني على الدائرة السوداء لشريحة المعايرة. استخدام ملقط غرامة لقص غيض من الإبرة. حقن قطرة واحدة في الزيت المعدني لقياس حجم قطرات.
    4. بالنسبة للحقن المجهري، قم بضبط وقت الحقن للحصول على قطرة قطرها 0.10-0.12 مم، والتي تساوي حجم ًا قدره 0.5-1.0 لتر. بالنسبة للميكروغافاج، احصل على قطرة قطرها 0.18-0.20 مم، والتي تساوي حجم3-5 لتر.
  3. إعداد 1.5 ٪ صفيحة agarose مع agarose(جدول المواد، 8050) في 10 سم بيتري طبق في 30 ٪ دانيو المتوسطة باستخدام قالب من البلاستيك والعفن microgavage. تخزينها في 4 درجة مئوية لمنع الجفاف حتى الحاجة. دافئ إلى RT أو 28 درجة مئوية قبل التجربة.

2. إعداد ووضع العلامات من C. difficile والجراثيم مع صبغ الفلورسنت

  1. إعداد حل مخزون 1 mM من صبغة الفلورسنت(جدول المواد). لأن الصبغة تباع في 50 ميكروغرام aliquots من مسحوق، إضافة 69 ميكرولتر من DMSO إلى القارورة للحصول على تركيز المخزون 1 mM.
  2. إعداد حل عمل 100 ميكرومتر من صبغة الفلورسنت عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من محلول مخزون 1 mM إلى 18 ميكرولتر من DMSO في أنبوب الطرد المركزي ، وتخلط جيدًا.
  3. الثقافة C. difficile (R20291، سلالة ribotype 027) عن طريق تلقيح 10 مل من وسط السائل BHIS مع اثنين إلى ثلاثة مستعمرات من لوحة في غطاء لاهوائي دون اهتزاز بين عشية وضحاها. BHIS هو BHI تستكمل مع 0.5٪ (ث / v) استخراج الخميرة و 0.1٪ (ث / v) L-السيستين. حل 1 غرام من L-السيستين في 10 مل من ddH2O وتعقيم عن طريق الترشيح، ثم تضاف إلى وسيلة أوتوكلاف للحصول على تركيز نهائي من 1 ز / لتر يتم إعداد لوحات عن طريق إضافة 15 غ / لتر أغار أغار إلى الوسط قبل التعقيم. ويتم التهيئة انتقائية من C. difficile باستخدام لوحات chromID C. difficile (جدول المواد).
  4. تلطيخ C. difficile مع صبغة الفلورسنت
    1. حصاد C. difficile في OD600 من 1.0-1.2 وغسل 1x مع 1 مل من 1x PBS (5000 × ز لمدة 3 دقيقة في RT). إعادة تعليق في 1 مل من 1 × PBS.
    2. إضافة 3 ميكرولتر من حل العمل من صبغة الفلورسنت إلى 1 مل من تعليق البكتيريا. احتضان العينة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام. غسل الملطخة C. difficile مرة واحدة مع 1 مل PBS لإزالة الصبغة المتبقية وإعادة تعليق في 1x PBS إلىOD 600 من 1.0 (1.0 OD600 ما يعادل تقريبا 108 cfu/mL).

3. حقن الملون C. difficile في يرقات حمار وحشي

  1. تهويل 20-30 يرقات حمار وحشي في 5 أيام بعد الإخصاب (المشار إليها هنا باسم 5 dpf) مع 0.02٪ - 0.04٪ tricaine (يذوب مسحوق التريكين في الماء المقطر المزدوج وتعديلها إلى درجة الحموضة = 7 مع 1 M Tris-HCL الحل) في 30٪ دانيو المتوسطة ~ 10 دقيقة قبل حقن. نقل اليرقات المؤكّد إلى طبق بيتري طازج بطول 10 سم وإزالة أي وسط دانيو الزائد بنسبة 30٪.
  2. ضع انخفاضًا بنسبة 0.8٪ في الذوبان على يرقات سمك الحمار الوحشي لتغطية. ضبط بلطف اليرقات إلى موقف جانبي. ضع طبق بيتري على الثلج لمدة 30-60 s للسماح للأغروز المنخفضة الانصهار لترسيخ. أضف 30% من وسيط دانيو الذي يحتوي على 0.02% -0.04% من التريكين لتغطية الأغاروز.
  3. إعداد محلول الحقن. أضف 1 ميكرولتر من 0.5٪ أحمر الفينول في محلول PBS إلى 9 ميكرولتر من الإنكولوم C. الملطخ بالصبغة لتصور عملية الحقن.
  4. قم بتحميل إبرة حقن مجهرية محسوبة باستخدام محلول الحقن باستخدام أداة microloader. قم بتركيب الإبرة المحملة على المتلاعبين الدقيق ووضعها تحت مجهري.
  5. ضبط ضغط الحقن بين 600-900 hPa. تعيين وقت الحقن إلى 0.1-0.3 s للحصول على 0.5-1.0 nL. تعيين الإبرة في micromanipulator في ~ 45 درجة زاوية مشيرا نحو اليرقات جزءا لا يتجزأ.
  6. ضع طرف الإبرة فوق الجهاز الهضمي بالقرب من المسام البولية التناسلية. بيرس من خلال agarose ثم العضلات مع طرف إبرة، ثم إدراجه في تجويف الأمعاء وحقن 0.5-1.0 nL من C. difficile. استخدام المجهر الفلوري لرصد اليرقات المحقونة والتقاط اليرقات المحقونة بشكل صحيح للتصوير المعكور.

4. جيل من يرقات حمار وحشي الغنوصي

  1. استخدام طريقة التربية الطبيعية الراسخة لتوليد أجنة حمار وحشي gnotobiotic، بما في ذلك: الإخصاب في المختبر، والغسيل مع متوسطة تحتوي على المضادات الحيوية (1 ميكروغرام/مل أمفوتيريسين B، 10 ميكروغرام/مل كاناموسين، و 20 ميكروغرام/مل أمبيسيلين)، وغسل مع 0.1٪ من wt/vol البولي فينيل بيرولدون-اليود (PVP-I) الحل، واحتضان الأجنة في غطاء ثقافة الخلية12.
  2. الحفاظ على جميع يرقات حمار وحشي gnotobiotic تحت الظروف gnotobiotic حتى 5 dpf أو قبل gavage. بعد اليرقات ، سيتم نقل يرقات سمك الحمار الوحشي إلى حاضنة قياسية ولكن مع وسيط Danieau المعقم بنسبة 30٪.

5. Gavage من يرقات حمار وحشي

  1. معايرة إبرة microgavage كما هو موضح في الخطوة 1.2.
  2. قياس قطر طرف الإبرة عن طريق وضع الإبرة على شريحة معايرة مع قطرة واحدة من الزيوت المعدنية. تأكد من أن الطرف هو 30-40 ميكرون في القطر، حادة، وعلى نحو سلس. تجاهل الإبر الحادة أو الخشنة.
    ملاحظة: يمكن الحد من حواف حادة من الإبر عن طريق المشتعلة سريعة.
  3. إعداد حل gavage كما هو موضح في الخطوة 3.3.
  4. تحميل وتركيب الإبرة على micromanipulator كما هو موضح في الخطوة 3.4. ضبط micromanipulator لوضع الإبرة في زاوية 45 درجة.
  5. تهوّر يرقات سمك الحمار الوحشي المشار إليها في الخطوة 3.1. عندما تتوقف اليرقات عن الحركة ، قم بنقلها إلى أخدود قالب ميكروغافج باستخدام ماصة باستور.
  6. ضع انخفاضًا بنسبة 0.8٪ في الذوبان على يرقات سمك الحمار الوحشي لتغطية. ضبط بلطف اليرقات مع رؤساء تواجه تستقيم في زوايا 45 درجة في الأخدود والذيول ضد جدار الأخدود. تأكد من أن زوايا الرؤوس هي نفسها تقريبا بحيث يتم محاذاتها مع زاوية الإبر gavage. ضع قالب الميكروغافاج على الثلج لمدة 30-60 s ، مما يسمح للأغروز الذوبان المنخفض بترسيخه من أجل تثبيت مواقع اليرقات.
  7. ضبط ضغط الحقن بين 200-300 hPa. تعيين وقت الحقن إلى 0.1-0.3 s للحصول على حجم حقن من 3-5 nL من C. difficile.
  8. تعمل بلطف الإبرة من خلال أغاروز ثم في فم يرقات حمار وحشي، من خلال المريء. بمجرد أن يكون طرف الإبرة داخل لمبة الأمعاء الأمامي ، اضغط على دواسة الحقن للإفراج عن البكتيريا. ملء تجويف الأمعاء مع حجم تسليمها. لا تدع ذلك يفيض من المريء أو الكلوأكا. سحب بلطف الإبرة من فم حمار وحشي.
  9. بعد gavage ، قم بإنقاذ يرقات سمك الحمار الوحشي المصابة من الأغاروز بطرف محمل صغير مرن عن طريق قطع الأروز أولاً بعيدًا ثم عن طريق رفع اليرقات. نقل هذه اليرقات إلى وسط دانيو المعقم بنسبة 30٪. شطف اليرقات في وسط معقم مرتين. نقل اليرقات إلى طبق بيتري الطازج 10 سم. سيتم الحفاظ على اليرقات لمدة تصل إلى 11 dpf.

6. تحليل المجهر كونالبؤر من يرقات حمار وحشي حقن

  1. اليرقات الهريسوثيرة المشار إليها إلى الخطوة 3.1. قم بإجراء ثقب في الجزء السفلي من طبق بيتري عيار 35 مم مع شريحة زجاجية متصلة بالثقب، يشار إليها باسم غرفة التصوير. نقل الأجنة إلى الجزء السفلي من غرفة التصوير مع كمية كافية من 30٪ من متوسط دانيو.
  2. أضف 200-300 ميكرولتر من أغاروز منخفض الذوبان بنسبة 1٪ لتغطية اليرقات المُسهّسة. نظرًا لأنه يتم استخدام المجهر المقلوب ، ضع المنطقة المصابة من اليرقات ضد الشريحة الزجاجية بأكبر قدر ممكن.
  3. اسمحوا agarose تصلب على الجليد لمدة 30-60 s. غمر أغاروز مع 30٪ دانيو تحتوي على 0.02٪ - 0.04٪ tricaine.
  4. صورة اليرقات مع المجهر المسح الضوئي بالليزر المعالبؤر(جدول المواد).

7. تشريح الأمعاء حمار وحشي اليرقات لاسترداد قابلة للحياة C. difficile

  1. عزل المسالك الهضمية من اليرقات لتحليل الحمل البكتيري. ابدأ بيرقات سمك الحمار الوحشي الرحيم مع 0.4٪ التريكين.
  2. شطف حمار وحشي لفترة وجيزة مع 1x مقسم المعقم ونقلها إلى لوحة أغاروز الطازجة.
  3. تشريح سمك الحمار الوحشي
    1. أدخل إبرة في الجذع الظهري ليرقات سمك الحمار الوحشي بالقرب من الرأس لشل سمك الحمار الوحشي. إزالة الرأس وراء الخياشيم مع الرمح.
    2. أدخل الإبرة الثانية في منتصف الجذع الظهري. أدخل الإبرة الثالثة في بطن سمكة الحمار الوحشي وأخرج الأمعاء من تجويف الجسم.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى العناية القصوى لعزل الأمعاء سليمة. إذا كان من الصعب القيام بذلك، قم بإجراء سحب إضافية لفصل بقية الأمعاء عن الأعضاء الداخلية المتبقية.
    3. استخدم إبرة الحقن المجهري لنقل 10-15 أمعاء إلى أنبوب 1.5 مل يحتوي على 200 ميكرولتر معقم من 1x PBS.
    4. تجانس الأمعاء مع الحشرات لتعطيل الأنسجة وإعداد التجانس. ضمان وصول الحشرات إلى الجزء السفلي من الأنبوب لتعطيل جميع الأمعاء تمامًا.
  4. احتضان المتجانسات في C. difficile تربية المتوسطة التي تحتوي على D-cycloserine وسيفوكستين، مع أو بدون taurocholate (TCA، إنبات من الجراثيم C. difficile) في غرفة اللاهوائية.
  5. احتضان لوحة لاهوائيا لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية.
  6. استخدام الثقافة البكتيرية ل16S rRNA-PCR.
    1. إعادة تعليق مستعمرة في 50 ميكرولتر من H2O وغليها في 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بيليه الحطام المنحل عن طريق الطرد المركزي (14000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين في RT) واستخدام 2 ميكرولتر من supernatant كقالب في 25 ميكرولتر من تفاعل PCR باستخدام C. difficile-محددةالتمهيديات (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'؛ Cdiff16Srev: 5 ' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
    2. عندما يتم استخدام البكتيريا من الثقافة السائلة، حصاد 1 مل من الثقافة وغسل مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني (14،000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة في RT). إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من H2ODD وعلاج كما هو الحال أعلاه. لزيادة توصيف المستعمرات البكتيرية ، تُخطعلى لوحة BHIS أو chromID(جدول المواد).

   

النتائج

C. difficile هو اللاهوائي تماما، ولكن الكروموفور من البروتينات الفلورية عادة ما يتطلب الأكسجين لتنضج. للتغلب على هذه المشكلة، تم استخدام صبغة الفلورسنت لبقعة يعيش C. الخلايا المتفرقة التي كانت تنمو بنشاط (R20291، سلالة ribotype 027; الشكل 1ألف). باستخدام نظام Gal4/UAS ، تم ...

Discussion

الأساليب المقدمة تعديل وتوسيع نهج القائمة لتصيب يرقات حمار وحشي عن طريق تنفيذ كل من الحقن وmicrogavage10،14. كما أنه يوضح نهج لدراسة مسببات الأمراض اللاهوائية مع يرقات حمار وحشي22. بالإضافة إلى ذلك ، يسهل البروتوكول تحليل استجابات الخلايا المناعية ال?...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

نحن ممتنون لتيمو فريتش لرعاية الحيوانات الممتازة. نشكر أعضاء مختبرات كوستر وستينرت على دعمهم ومناقشاتهم المفيدة. نشكر الدكتور داندان هان على قراءته النقدية للمخطوطة. ونحن نقدر بامتنان التمويل من قبل الدولة الاتحادية من ولاية سكسونيا السفلى، Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA2576Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM)Pronadisa8050It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial StainThermo Fisher ScientificB35001Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion BrothCarl Roth GmbHX916.1
Brass (wild-type)deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2)Sigma-AldrichC1396
Capillary GlassHarvard Apparatus30-0019Injection needles
Clostridioides difficileR20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSOCarl Roth GmbHA994
FIJIopen-source platformImage processing
HEPESCarl Roth GmbH6763
Horizontal needle pullerSutter instrument IncP-87
L-cysteineSigma-Aldrich168149
Leica Application Suite X (LAS X)LeicaImage processing
Magnesium sulfate (MgSO4)Carl Roth GmbHP026
Micro injectoreppendorf5253000017
Microinjection moldsAdaptive Science ToolsTU1
Leica SP8 confocal microscopeLeica
Phenol RedSigma-AldrichP0290
Potassium chloride (KCl)Carl Roth GmbH5346
Sodium chloride (NaCl)Carl Roth GmbH9265
TaurocholateCarl Roth GmbH8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
TricaineSigma-AldrichE10521
Yeast extractBD Bacto212750

References

  1. Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
  2. Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
  3. Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
  4. Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
  5. Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
  6. Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
  7. Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
  8. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  9. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
  10. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  11. Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
  12. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
  13. Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
  14. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
  15. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
  16. Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
  17. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  18. Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
  19. Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
  20. Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
  21. Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
  22. Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156 difficile microgavage gnotobiotic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved