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Resumo

Apresentado aqui é um método seguro e eficaz para infectar larvas de zebrafish com c. anaeróbico fluorescente rotulado por microinjeção e microgavage não invasivo.

Resumo

A infecção por clostridioides difficile (CDI) é considerada uma das infecções gastrointestinais mais comuns associadas à saúde nos Estados Unidos. A resposta imune inata contra C. difficile foi descrita, mas os papéis exatos dos neutrófilos e macrófagos no CDI são menos compreendidos. No presente estudo, larvas de Danio rerio (zebrafish) são usadas para estabelecer um modelo de infecção por C. difficile para a imagem do comportamento e cooperação dessas células imunes inatas inatas inatas invivas. Para monitorar C. difficile, foi estabelecido um protocolo de rotulagem usando um corante fluorescente. Uma infecção localizada é alcançada pela microinjeção rotulada de C. difficile, que cresce ativamente no trato intestinal de zebrafish e imita o dano epitelial intestinal no CDI. No entanto, esse protocolo de infecção direta é invasivo e causa feridas microscópicas, que podem afetar os resultados experimentais. Assim, um protocolo microgavage mais não invasivo é descrito aqui. O método envolve a entrega de células C. difficile diretamente no intestino de larvas de zebrafish por intubação através da boca aberta. Este método de infecção imita de perto a rota de infecção natural de C. difficile.

Introdução

C. difficile é um bacilo produzido por esporos, anaeróbico e produtor de toxinas que é a principal causa de infecções graves no trato gastrointestinal1. Os sintomas típicos do CDI incluem diarreia, dor abdominal e colite pseudomembrannosa fatal, e às vezes pode levar à morte1,2. Evidências mostraram que as respostas imunes hospedeiras desempenham um papel crítico tanto na progressão quanto no resultado desta doença3. Além da resposta imune, a microbiota intestinal indígena é crucial para o início e a patogênese do CDI4. Na última década, tanto o número de casos quanto a taxa de mortalidade do DiEd aumentaram significativamente devido ao surgimento de uma cepa hipervirulenta de C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Uma melhor compreensão dos mecanismos imunológicos subjacentes e o papel da microbiota durante o CDI ajudarão a levar a novos desenvolvimentos terapêuticos e avanços, possibilitando um melhor controle desta epidemia.

Vários modelos animais, como o hamster e o rato, foram desenvolvidos para fornecer uma visão da defesa imunológica contra C. difficile7,8. No entanto, o papel das células imunes inatas ainda é mal compreendido, particularmente porque o comportamento inato das células imunes é derivado principalmente da análise histológica ou células cultivadas in vitro. Portanto, estabelecer um modelo transparente de zebrafish para revelar a resposta imune inata a C. difficile dentro de um organismo de vertebrado vivo facilitará tais estudos. As larvas de zebrafish têm um sistema imunológico inata funcional, mas não têm o sistema imunológico adaptativo até 4-6 semanas após a fertilização9. Essa característica única faz das larvas de zebrafish um excelente modelo para estudar a resposta isolada e a função das células imunes inatas no CDI.

Este relatório descreve novos métodos usando larvas de zebrafish para estudar as interações entre C. difficile e células imunes inatas, como macrófagos e neutrófilos. Primeiro, um protocolo de microinjeção localizado que inclui c. difficile inoculum e coloração é apresentado. Usando imagens de lapso de tempo confocal in vivo, a resposta de neutrófilos e macrófagos em relação ao local da infecção é registrada, e observa-se a fagocitose de bactérias por neutrófilos e macrófagos. No entanto, foi relatado que a injeção em si causa danos teciduais e leva ao recrutamento de leucócitos independentes das bactérias10. Portanto, um protocolo microgavage não invasivo para entregar C. difficile no intestino de larvas de zebrafish é posteriormente descrito. Estudos anteriores demonstraram que a microbiota gastrointestinal indígena protege um hospedeiro contra a colonização de C. difficile11. Portanto, larvas de zebrafish gnotobióticos também são usadas para predispor os zebrafish que estão infectados 12. Posteriormente, a dissecção intestinal é realizada para recuperar o difundido c. viável e validar a duração de sua presença em tratos intestinais de zebrafish.

Protocolo

Todo o trabalho animal descrito aqui foi realizado de acordo com as normas legais (DIRETIVA UE 2010/63, licença AZ 325.1.53/56.1-TUBS e licença AZ 33.9-42502-04-14/1418).

1. Preparação de Agarose de Baixo Derretimento, Placa de Gel e Agulhas microinjeção/microgavage

  1. Dissolver 0,08 g de agarose de baixo derretimento (Tabela de Materiais, agarose A2576) em 10 mL de 30% danieau médio (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) e 17,4 mM NaCl, armazenados à temperatura ambiente (RT) para obter uma solução de 0,8%.
    NOTA: Podem ser utilizadas concentrações mais altas ou menores de agarose. No entanto, o tempo necessário para solidificar varia para diferentes marcas de agarose, mesmo na mesma concentração.
  2. Prepare microinjeção e agulhas de microgavage a partir de capilares de vidro (Tabela de Materiais).
    1. Use um puxador de micropipette com as seguintes configurações (note que as unidades são específicas para o puller usado aqui; veja Tabela de Materiais): agulhas de microinjeção (pressão de ar = 500; calor = 400; pull = 125; velocidade = 75; tempo = 150); e agulhas de microgavage (pressão de ar = 500; calor = 400; puxar = 100; velocidade = 75; tempo = 150). Use uma ponta de microcarregador para carregar 3 μL de H2O sem nuclease na agulha puxada.
    2. Introduza a agulha no injetor e aperte-a corretamente. Ajuste a agulha em um ângulo adequado para injeção. Defina a pressão de injeção entre 600-900 hPa para agulha de microinjeção e 200-300 hPa para agulha de gavage.
    3. Coloque uma gota de óleo mineral no círculo preto do slide de calibração. Use fórceps finos para cortar a ponta da agulha. Injete uma gota no óleo mineral para medir o tamanho da gotícula.
    4. Para microinjeção, ajuste o tempo de injeção para obter uma gotícula com um diâmetro de 0,10 a 0,12 mm, o que equivale a um volume de 0,5 a 1,0 nL. Para microgavage, obtenha uma gotícula com diâmetro de 0,18 a 0,20 mm, o que equivale a um volume de 3-5 nL.
  3. Prepare uma placa de 1,5 % de agarose com agarose (Tabela de Materiais, 8050) em uma placa petri de 10 cm em 30% do meio de Danieau usando um molde de plástico como molde de microgavage. Armazene a 4 °C para evitar a dessecação até que seja necessário. Aqueça-se a RT ou 28 °C antes do experimento.

2. Preparação e Rotulagem de C. difficile e Esporos com Corante Fluorescente

  1. Prepare uma solução de estoque de 1 mM de um corante fluorescente (Tabela de Materiais). Como o tintura é vendido em 50 μg de aliquots de pó, adicione 69 μL de DMSO ao frasco para obter uma concentração de estoque de 1 mM.
  2. Prepare uma solução de trabalho de 100 μM do corante fluorescente adicionando 2 μL de 1 mM solução de estoque a 18 μL de DMSO em um tubo de centrífuga, e misture bem.
  3. Cultura C. difficile (R20291, uma cepa ribótipo 027) inoculando 10 mL de meio líquido BHIS com duas a três colônias de uma placa em um capô anaeróbico sem tremer durante a noite. BHIS é BHI complementado com extrato de levedura de 0,5% (w/v) e 0,1% (v) L-cysteine. Dissolva 1 g de L-cysteine em 10 mL de ddH2O e esterilizar por filtração, em seguida, adicione ao meio autocelava para obter uma concentração final de 1 g/L. As placas são preparadas adicionando 15 g/L agar-agar ao meio antes da autovérquim. O culismo seletivo de C. difficile é feito utilizando placas de cromid C. difficile (Tabela de Materiais).
  4. Coloração C. difficile com o corante fluorescente
    1. Harvest C. difficile em um OD600 de 1.0-1.2 e lave 1x com 1 mL de 1x PBS (5.000 x g por 3 min na RT). Resuspender em 1 mL de 1 x PBS.
    2. Adicione 3 μL de solução de trabalho do corante fluorescente em 1 mL de suspensão de bactérias. Incubar a amostra de 15 min na RT no escuro. Lave o C. difficile manchado uma vez com 1 mL PBS para remover corante residual e resuspender em 1x PBS para um OD600 de 1.0 (1.0 OD600 é aproximadamente equivalente a 108 cfu/mL).

3. Injeção de C. difficile manchado em larvas de zebrafish

  1. Anestesia 20-30 larvas de zebrafish em 5 dias após a fertilização (referida aqui como 5 dpf) com 0,02%-0,04% tricaine (pó de tricaina é dissolvido em água destilada duplamente e ajustada para pH = 7 com 1 M Tris-HCL solução) em 30% o médio de Danieau ~10 min antes Injeção. Transfira as larvas anestesiadas para uma placa de Petri fresca de 10 cm e remova qualquer excesso de 30% do meio de Danieau.
  2. Coloque uma queda de 0,8% de baixo derretimento agarose sobre as larvas de zebrafish para cobrir. Ajuste delicadamente as larvas em uma posição lateral. Coloque a placa de Petri no gelo por 30-60 s para permitir que a agarose de baixo derretimento se solidifique. Adicione 30% do meio de Danieau contendo 0,02% a 0,04% de tricaine para cobrir a agarose.
  3. Prepare a solução de injeção. Adicione 1 μL de vermelho fenol de 0,5% na solução PBS em 9 μL do inóculo c. difficile manchado de tinta para visualizar o processo de injeção.
  4. Carregue uma agulha de microinjeção calibrada com a solução de injeção usando um microcarregador. Coloque a agulha carregada em um micromanipulador e posicione-a um estereótipo.
  5. Ajuste a pressão de injeção entre 600-900 hPa. Defina o tempo de injeção para 0,1-0.3 s para obter 0,5-1.0 nL. Coloque a agulha no micromanipulador em um ângulo de ~45°apontando para as larvas incorporadas.
  6. Coloque a ponta da agulha acima do trato gastrointestinal perto do poro urogenital. Fure através da agarose, em seguida, o músculo com a ponta da agulha, em seguida, inseri-lo no lúmen intestinal e injetar 0,5-1.0 nL de C. difficile. Use um microscópio de fluorescência para monitorar as larvas injetadas e pegar as larvas devidamente injetadas para imagens confocais.

4. Geração de Larvas gnotobióticas de zebrafish

  1. Use o método de reprodução natural bem estabelecido para gerar embriões de zebrafish gnotobióticos, incluindo: fertilização in vitro, lavagem com meio contendo antibióticos (1 μg/mL amphoticina B, 10 μg/mL kanamycin, e 20 μg/mL ampicillin), lavagem com 0,1% wt/vol polisrolido-iodo (PVP-I) solução, e incubação dos embriões em um capuz de cultura celular12.
  2. Mantenha todas as larvas gnotobióticas de zebrafish condições gnotobióticas até 5 dpf ou pouco antes do gavage. Após o gavage, as larvas de zebrafish serão transferidas para uma incubadora padrão, mas com 30% de danieau estéril.

5. Gavage de Larvas de Zebrafish

  1. Calibrar a agulha do microgavage como descrito na etapa 1.2.
  2. Meça o diâmetro da ponta da agulha colocando a agulha em um slide de calibração com uma gota de óleo mineral. Certifique-se de que a ponta tem 30 a 40 μm de diâmetro, contundente e lisa. Descarte as agulhas afiadas ou ásperas.
    NOTA: Bordas afiadas de agulhas podem ser cegas por fogo rápido.
  3. Prepare a solução gavage como descrito na etapa 3.3.
  4. Carregue e coloque a agulha em um micromanipulador conforme descrito na etapa 3.4. Ajuste o micromanipulador para posicionar a agulha em um ângulo de 45°.
  5. Anestesiar as larvas de zebrafish referidas na etapa 3.1. Quando as larvas pararem de se mover, transfira-as para o sulco de um molde microgavage usando uma pipeta Pasteur.
  6. Coloque uma queda de 0,8% de baixo derretimento agarose sobre as larvas de zebrafish para cobrir. Ajuste delicadamente as larvas com cabeças viradas para a direita em ângulos de 45° no sulco e caudas contra a parede do sulco. Certifique-se de que os ângulos das cabeças são aproximadamente os mesmos para que estejam alinhados com o ângulo das agulhas gavage. Coloque o molde de microgavage no gelo por 30-60 s, permitindo que a agarose de baixo derretimento se solidifique para estabilizar as posições das larvas.
  7. Ajuste a pressão de injeção entre 200-300 hPa. Ajuste o tempo de injeção para 0,1-0.3 s para obter um volume de injeção de 3-5 nL de C. difficile.
  8. Opere delicadamente a agulha através da agarose e depois na boca de larvas de zebrafish, através do esôfago. Uma vez que a ponta da agulha esteja dentro da lâmpada intestinal anterior, pressione o pedal de injeção para liberar a bactéria. Encha o lúmen do intestino com o volume entregue. Não deixe transbordar do esôfago ou cloaca. Retire suavemente a agulha da boca do zebrafish.
  9. Após o gavage, resgate as larvas infectadas de zebrafish da agarose com uma ponta flexível de microloader, primeiro cortando a agarose para longe, em seguida, levantando as larvas. Transfira essas larvas para o meio estéril de 30% de Danieau. Enxágüe as larvas em meio estéril duas vezes. Transfira as larvas para uma placa de Petri fresca de 10 cm. As larvas serão mantidas por até 11 dpf.

6. Análise de microscopia confocal de larvas de zebrafish injetadas

  1. Larvas de zebrafish anestesiadas referem-se à etapa 3.1. Faça um buraco no fundo de uma placa de Petri de 35 mm com um escorregador de vidro preso ao orifício, referido como a câmara de imagem. Transferir embriões para o fundo da câmara de imagem com uma quantidade adequada de 30% do meio de Danieau.
  2. Adicione 200-300 μL de 1% de agarose de derretimento baixa para cobrir as larvas anestesiadas. Uma vez que um microscópio confocal invertido é usado, coloque a região infectada das larvas contra o deslizamento de vidro o mais próximo possível.
  3. Deixe a agarose solidificar no gelo por 30-60 s. Submerge a agarose com 30% de Danieau contendo 0,02%-0,04% tricaine.
  4. Imagem das larvas com um microscópio de varredura a laser confocal (Tabela de Materiais).

7. Dissecção de intestino zebrafish larval para recuperar viável C. difficile

  1. Isolar os tratos gastrointestinais das larvas para analisar a carga bacteriana. Comece por eutanizar larvas de zebrafish com 0,4 % tricaine.
  2. Enxágüe o zebrafish brevemente com PBS 1x estéreis e transfira-os para uma placa de agarose fresca.
  3. Dissecação de zebrafish
    1. Insira uma agulha no tronco dorsal das larvas de zebrafish perto da cabeça para imobilizar o zebrafish. Remova a cabeça atrás das brânquias com uma lança.
    2. Insira a segunda agulha no meio do tronco dorsal. Insira a terceira agulha no abdômen do zebrafish e puxe o intestino para fora da cavidade corporal.
      NOTA: São necessários cuidados extremos para isolar o intestino intacto. Se for difícil fazê-lo, realize puxões adicionais para separar o resto do intestino dos órgãos internos restantes.
    3. Use uma agulha de microinjeção para transferir intestinos de 10 a 15 em um tubo de 1,5 mL contendo 200 μL estéreis de 1x PBS.
    4. Homogeneize os intestinos com um pilão para interromper o tecido e preparar homogeneiza. Certifique-se de que o pilão chegue ao fundo do tubo para interromper todos os intestinos completamente.
  4. Incubar os homogeneizados em C. difficile meio contendo D-cicloserina e cefoxitina, com ou sem taurochola (TCA, um germinante de esporos c. difficile) em uma câmara anaeróbica.
  5. Incubar a placa anaerobicamente por 48 h a 37 °C.
  6. Use cultura bacteriana para rRNA-PCR 16S.
    1. Resuspender uma colônia em 50 μL de H2O e fervê-la a 95 °C por 15 min. Pelotas os detritos lised por centrífuga (14.000 rpm para 2 min na RT) e usar 2 μL do supernatant como modelo em 25 μL de reação PCR usando primers c. difficile-específico (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
    2. Quando as bactérias da cultura líquida são utilizadas, colher 1 mL de cultura e lavar uma vez com 1 mL de PBS (14.000 rpm por 2 min na RT). Resuspender a pelota em 100 μL de H2Odd e tratar como feito acima. Para caracterizar ainda mais colônias bacterianas, raia em um BHIS ou palid-placa(Tabela de Materiais).

   

Resultados

C. difficile é estritamente anaeróbico, mas o cromosforo de proteínas fluorescentes geralmente requer oxigênio para amadurecer. Para superar esse problema, um corante fluorescente foi usado para manchar células c. difficile vivas que estavam crescendo ativamente (R20291, uma cepa ribótipo 027; Figura 1A). Usando o sistema Gal4/UAS, foram geradas linhas de zebrafish transgênicas estáveis para imagens vivas, nas quais os promotores mpeg1.1 ou...

Discussão

Os métodos apresentados modificam e estendem uma abordagem existente para infectar larvas de zebrafish realizando injeção e microgavage10,14. Também demonstra uma abordagem para estudar patógenos anaeróbicos com larvas de zebrafish22. Além disso, o protocolo facilita a análise das respostas inatas das células imunes inatos no vivo sobre o CDI e após a colonização de C. difficile em zebrafish. O método é reprodutível...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Somos gratos a Timo Fritsch por um excelente cuidado animal. Agradecemos aos membros dos laboratórios Köster e Steinert por apoio e discussões úteis. Agradecemos ao Dr. Dandan Han por ler o manuscrito. Reconhecemos com gratidão o financiamento do Estado Federal da Baixa Saxônia, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA2576Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM)Pronadisa8050It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial StainThermo Fisher ScientificB35001Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion BrothCarl Roth GmbHX916.1
Brass (wild-type)deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2)Sigma-AldrichC1396
Capillary GlassHarvard Apparatus30-0019Injection needles
Clostridioides difficileR20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSOCarl Roth GmbHA994
FIJIopen-source platformImage processing
HEPESCarl Roth GmbH6763
Horizontal needle pullerSutter instrument IncP-87
L-cysteineSigma-Aldrich168149
Leica Application Suite X (LAS X)LeicaImage processing
Magnesium sulfate (MgSO4)Carl Roth GmbHP026
Micro injectoreppendorf5253000017
Microinjection moldsAdaptive Science ToolsTU1
Leica SP8 confocal microscopeLeica
Phenol RedSigma-AldrichP0290
Potassium chloride (KCl)Carl Roth GmbH5346
Sodium chloride (NaCl)Carl Roth GmbH9265
TaurocholateCarl Roth GmbH8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
TricaineSigma-AldrichE10521
Yeast extractBD Bacto212750

Referências

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