Desarrollo de un modelo de infección de pez cebra larval para Clostridioides difficile

Resumen

Aquí se presenta un método seguro y eficaz para infectar las larvas de pez cebra con C. difficile anaeróbico etiquetado fluorescentemente por microinyección y microvago no invasivo.

Resumen

Clostridioides difficile infección (CDI) se considera una de las infecciones gastrointestinales más comunes asociadas a la atención médica en los Estados Unidos. Se ha descrito la respuesta inmune innata contra C. difficile, pero se entienden menos los roles exactos de los neutrófilos y los macrófagos en la CDI. En el estudio actual, las larvas de Danio rerio (pez cebra) se utilizan para establecer un modelo de infección por C. difficile para tomar imágenes del comportamiento y la cooperación de estas células inmunitarias innatas in vivo. Para monitorear C. difficile, se ha establecido un protocolo de etiquetado utilizando un tinte fluorescente. Una infección localizada se logra mediante microinyección etiquetada C. difficile, que crece activamente en el tracto intestinal del pez cebra e imita el daño epitelial intestinal en CDI. Sin embargo, este protocolo de infección directa es invasivo y causa heridas microscópicas, que pueden afectar los resultados experimentales. Por lo tanto, aquí se describe un protocolo de microgavage más no invasivo. El método consiste en la entrega de células C. difficile directamente en el intestino de las larvas de peces cebra por intubación a través de la boca abierta. Este método de infección imita de cerca la ruta de infección natural de C. difficile.

Introducción

C. difficile es un bacilo grampositivo, formador de esporas, anaeróbico y productor de toxinas que es la principal causa de infecciones graves en el tracto gastrointestinal¹. Los síntomas típicos de la ICD incluyen diarrea, dolor abdominal y colitis pseudomembranosa fatal, y a veces puede llevar a la muerte^1,2. La evidencia ha demostrado que las respuestas inmunitarias del huésped desempeñan un papel crítico tanto en la progresión como en el resultado de esta enfermedad³. Además de la respuesta inmunitaria, la microbiota intestinal autóctona es crucial para la aparición y la patogénesis de la CDI^4. En la última década, tanto el número de casos como la tasa de mortalidad de la CDI han aumentado significativamente debido a la aparición de una cepa hipervirulenta de C. difficile (BI/NAP1/027)^5,6. Una mejor comprensión de los mecanismos inmunitarios subyacentes y el papel de la microbiota durante la CdC ayudará a dar lugar a nuevos desarrollos y avances terapéuticos, lo que permitirá un mejor control de esta epidemia.

Varios modelos animales, como el hámster y el ratón, se han desarrollado para proporcionar una visión de la defensa inmune contra C. difficile^7,8. Sin embargo, el papel de las células inmunitarias innatas todavía se entiende mal, particularmente porque el comportamiento innato de las células inmunitarias se deriva principalmente del análisis histológico o de las células cultivadas in vitro. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo transparente de pez cebra para revelar la respuesta inmune innata a C. difficile dentro de un organismo vertebrado vivo facilitará tales estudios. Las larvas de peces cebra tienen un sistema inmunitario innato funcional, pero carecen del sistema inmunitario adaptativo hasta 4-6 semanas después de la fertilización^9. Esta característica única hace que las larvas de pez cebra sean un excelente modelo para estudiar la respuesta aislada y la función de las células inmunitarias innatas en la ICD.

Este informe describe nuevos métodos que utilizan larvas de peces cebra para estudiar las interacciones entre C. difficile y las células inmunitarias innatas, como macrófagos y neutrófilos. En primer lugar, se presenta un protocolo de microinyección localizado que incluye C. difficile inoculum y tinción. Utilizando imágenes confocales in vivo de lapso de tiempo, se registra la respuesta de neutrófilos y macrófagos hacia el sitio de la infección, y se observa la fagocitosis de bacterias por neutrófilos y macrófagos. Sin embargo, se ha informado de que la inyección en sí causa daño tisular y conduce al reclutamiento de leucocitos independientes de la bacteria¹⁰. Por lo tanto, posteriormente se describe un protocolo de microgavage no invasivo para administrar C. difficile en el intestino de las larvas de peces cebra. Estudios anteriores han demostrado que la microbiota gastrointestinal indígena protege a un huésped contra la colonización de C. difficile¹¹. Por lo tanto, las larvas de pez cebra gnotobióticas también se utilizan para predisponer el pez cebra que están infectados ¹². Después, la disección intestinal se realiza para recuperar la C. difficile viable y validar la duración de su presencia en los tracto intestinales del pez cebra.

Protocolo

Todo el trabajo animal descrito aquí se realizó de acuerdo con las regulaciones legales (DIRECTIVA UE 2010/63, licencia AZ 325.1.53/56.1-TUBS y licencia AZ 33.9-42502-04-14/1418).

1. Preparación de agarosa de baja fusión, placa de gel y agujas de microinyección/microgavage

1. Disolver 0,08 g de agarosa de baja fusión(Tabla de materiales, agarosa A2576) en 10 ml del medio de Danieau al 30% (0,12 mM MgSO₄, 0,18 mM Ca [NO₃]₂), 0,21 mM KCl, HEPES de 1,5 mM (pH a 7,2) y 17,4 mM de NaCl, almacenados a temperatura ambiente (RT) para obtener una solución del 0,8%.
   NOTA: Se pueden utilizar concentraciones más altas o más bajas de agarosa. Sin embargo, el tiempo necesario para solidificar varía para diferentes marcas de agarosa, incluso en la misma concentración.
2. Preparar agujas de microinyección y microvaage a partir de capilares de vidrio(Tabla de materiales).
   1. Utilice un tirador de micropipetas con los siguientes ajustes (tenga en cuenta que las unidades son específicas del tirador utilizado aquí; véase Tabla de materiales):agujas de microinyección (presión de aire 500; calor a 400; tirar a 125; velocidad a 75; tiempo a 150); y agujas de microvalamiento (presión de aire 500; calor a 400; tirar a 100; velocidad de 75; tiempo a 150). Utilice una punta de microcargador para cargar 3 l de H₂O sin nucleasas en la aguja tirada.
   2. Introducir la aguja en el inyector y fijarla correctamente. Ajuste la aguja a un ángulo adecuado para la inyección. Ajuste la presión de inyección entre 600-900 hPa para la aguja de microinyección y 200–300 hPa para la aguja de gavage.
   3. Coloque una gota de aceite mineral en el círculo negro de la diapositiva de calibración. Utilice fórceps finos para sujetar la punta de la aguja. Inyecte una gota en el aceite mineral para medir el tamaño de la gota.
   4. Para la microinyección, ajuste el tiempo de inyección para obtener una gota con un diámetro de 0,10–0,12 mm, lo que equivale a un volumen de 0,5–1,0 nL. Para microvago, obtenga una gota con un diámetro de 0,18–0,20 mm, lo que equivale a un volumen de 3-5 nL.
3. Preparar una placa de agarosa del 1,5 % con agarosa(Tabla de materiales,8050) en una placa Petri de 10 cm en un medio de Danieau al 30% utilizando un molde de plástico como molde de microvaage. Conservar a 4oC para evitar la desecación hasta que sea necesario. Caliente a RT o 28 oC antes del experimento.

2. Preparación y etiquetado de C. difficile y esporas con tinte fluorescente

1. Preparar una solución de 1 mM de un tinte fluorescente (Tabla de materiales). Debido a que el tinte se vende en alícuotas de 50 g de polvo, añadir 69 ml de DMSO al vial para obtener una concentración de stock de 1 mM.
2. Preparar una solución de trabajo de 100 m del tinte fluorescente añadiendo 2 ml de solución de material de 1 mM a 18 ml de DMSO en un tubo de centrífuga, y mezclar bien.
3. Cultivo C. difficile (R20291, una cepa ribotipo 027) inoculando 10 ml de medio líquido BHIS con dos a tres colonias de una placa en una campana anaeróbica sin agitar durante la noche. BHIS es BHI complementado con 0.5% (p/v) Extracto de levadura y 0.1% (w/v) L-cisteína. Disolver 1 g de L-cisteína en 10 ml de ddH₂O y esterilizar por filtración, luego añadir al medio autoclave para obtener una concentración final de 1 g/L. Las placas se preparan añadiendo 15 g/L agar-agar-agar al medio antes de la autoclave. El cultivo selectivo de C. difficile se realiza mediante el uso de placas cromólicas C. difficile (Tabla de materiales).
4. Mancha c. difficile con el tinte fluorescente
   1. Cosecha C. difficile a una OD₆₀₀ de 1.0–1.2 y lavar 1x con 1 mL de 1x PBS (5.000 x g durante 3 min a RT). Resuspender en 1 mL de 1 x PBS.
   2. Añadir 3 ml de solución de trabajo del tinte fluorescente en 1 ml de suspensión bacteriana. Incubar la muestra durante 15 minutos a RT en la oscuridad. Lavar el C. difficile teñido una vez con 1 ml de PBS para eliminar el tinte residual y resuspender en 1x PBS a una DoT₆₀₀ de 1.0 (1.0 OD₆₀₀ es aproximadamente equivalente a 10⁸ cfu/ml).

3. Inyección de C. difficile manchado en larvas de pez cebra

1. Anestetizar 20–30 larvas de pez cebra a los 5 días posteriores a la fertilización (referido aquí como 5 dpf) con 0.02% –0.04% tricaína (polvo de tricaína se disuelve en agua de doble destilación y se ajusta al pH 7 con 1 M Tris-HCL solución) en 30% medio de Danieau 10 min antes Inyección. Transfiere las larvas anestesiadas a un plato Petri fresco de 10 cm y elimina cualquier exceso del medio de Danieau.
2. Coloque una gota de agarosa baja de fusión del 0,8% sobre las larvas del pez cebra para cubrir. Ajuste suavemente las larvas a una posición lateral. Coloque la placa Petri sobre hielo durante 30-60 s para permitir que la baja agarosa de fusión se solidifique. Añadir 30% medio de Danieau que contiene 0.02%–0.04% tricaína para cubrir la agarosa.
3. Prepare la solución de inyección. Añadir 1 l de 0,5% de color rojo fenol en solución de PBS en 9 l del inóculo de C. difficile teñido de tinte para visualizar el proceso de inyección.
4. Cargue una aguja de microinyección calibrada con la solución de inyección utilizando un microcargador. Monte la aguja cargada en un micromanipulador y colóquela bajo un estereomicroscopio.
5. Ajuste la presión de inyección entre 600–900 hPa. Establezca el tiempo de inyección en 0,1–0,3 s para obtener 0,5–1,0 nL. Ajuste la aguja en el micromanipulador en un ángulo de 45o apuntando hacia las larvas incrustadas.
6. Coloque la punta de la aguja por encima del tracto gastrointestinal cerca del poro urogenital. Perforar a través de agarosa entonces el músculo con la punta de la aguja, a continuación, insertarlo en el lumen intestinal e inyectar 0.5–1.0 nL de C. difficile. Utilice un microscopio de fluorescencia para monitorear las larvas inyectadas y recoger las larvas inyectadas correctamente para obtener imágenes confocales.

4. Generación de larvas gnotobióticas de pez cebra

1. Utilice el método de reproducción natural bien establecido para generar embriones de pez cebra gnotobióticos, incluyendo: fertilización in vitro, lavado con medio que contenga antibióticos (1 g/ml de anfotericina B, kanamicina de 10 g/ml y ampicilina de 20 g/ml), lavado con solución de pirrolidona-yodo de polivinilo de 1,1% wt/vol, e incubación de embriones en un campana de cultivo celular¹².
2. Mantener todas las larvas de pez cebra gnotobiótico en condiciones gnotobióticas hasta 5 dpf o justo antes del gavage. Después del gavage, las larvas de pez cebra serán transferidas a una incubadora estándar pero con un medio estéril del 30% de Danieau.

5. Gavage de larvas de pez cebra

1. Calibre la aguja de microgavage como se describe en el paso 1.2.
2. Mida el diámetro de la punta de la aguja colocando la aguja en un portaobjetos de calibración con una gota de aceite mineral. Asegúrese de que la punta tenga un diámetro de 30-40 m, contundente y lisa. Deseche las agujas afiladas o ásperas.
   NOTA: Los bordes afilados de las agujas se pueden atenuar mediante llamas rápidas.
3. Prepare la solución de gavage como se describe en el paso 3.3.
4. Cargue y monte la aguja en un micromanipulador como se describe en el paso 3.4. Ajuste el micromanipulador para colocar la aguja en un ángulo de 45o.
5. Anestetizar las larvas de pez cebra mencionadas en el paso 3.1. Cuando las larvas dejen de moverse, transfiéralas a la ranura de un molde de microvalaje utilizando una pipeta Pasteur.
6. Coloque una gota de agarosa baja de fusión del 0,8% sobre las larvas del pez cebra para cubrir. Ajuste suavemente las larvas con las cabezas orientadas hacia arriba en ángulos de 45o en la ranura y las colas contra la pared de la ranura. Asegúrese de que los ángulos de las cabezas sean aproximadamente los mismos para que estén alineados con el ángulo de las agujas de gavage. Colocar el molde de microgavage sobre hielo durante 30-60 s, permitiendo que la baja agarosa de fusión se solidifique para estabilizar las posiciones de las larvas.
7. Ajuste la presión de inyección entre 200–300 hPa. Establezca el tiempo de inyección en 0.1–0.3 s para obtener un volumen de inyección de 3–5 nL de C. difficile.
8. Operar suavemente la aguja a través de la agarosa y luego en la boca de larvas de pez cebra, a través del esófago. Una vez que la punta de la aguja está dentro del bulbo intestinal anterior, presione el pedal de inyección para liberar la bacteria. Llene el lumen del intestino con el volumen entregado. No deje que se desborde del esófago o cloaca. Retire suavemente la aguja de la boca del pez cebra.
9. Después de la gavage, rescata las larvas de pez cebra infectadas de la agarosa con una punta de microcargador flexible cortando primero la agarosa y luego levantando las larvas. Transfiere estas larvas al medio estéril del 30% de Danieau. Enjuague las larvas en un medio estéril dos veces. Transfiera las larvas a un plato Petri fresco de 10 cm. Las larvas se mantendrán hasta 11 dpf.

6. Análisis de microscopía confocal de larvas de pez cebra inyectadas

1. Anestetizar las larvas de pez cebra referida al paso 3.1. Haga un agujero en la parte inferior de una placa Petri de 35 mm con un portaobjetos de vidrio unido al orificio, conocido como la cámara de imágenes. Transfiera embriones a la parte inferior de la cámara de imágenes con una cantidad adecuada del 30% del medio de Danieau.
2. Añadir de 200 a 300 l de agarosa de fusión baja al 1% para cubrir las larvas anestesiadas. Puesto que se utiliza un microscopio confocal invertido, coloque la región infectada de las larvas contra el portaobjetos de vidrio lo más cerca posible.
3. Deje que la agarosa se solidifique en hielo durante 30-60 s. Sumerja la agarosa con 30% de Danieau que contiene 0.02%–0.04% tricaína.
4. Imagen de las larvas con un microscopio de escaneo láser confocal (Tabla de Materiales).

7. Disección del intestino larvario de peces cebra para recuperar Viable C. difficile

1. Aislar los tracto gastrointestinales de las larvas para analizar la carga bacteriana. Comience por eutanasia larvas de pez cebra con 0,4 % de tricaína.
2. Enjuague brevemente el pez cebra con 1x PBS estéril y transfiéralo a una placa de agarosa fresca.
3. Disección de peces cebra
   1. Inserte una aguja en el tronco dorsal de larvas de pez cebra cerca de la cabeza para inmovilizar al pez cebra. Retire la cabeza detrás de las branquias con una lanceta.
   2. Inserte la segunda aguja en el centro del tronco dorsal. Inserte la tercera aguja en el abdomen del pez cebra y extraiga el intestino de la cavidad corporal.
      NOTA: Se necesita un cuidado extremo para aislar el intestino intacto. Si es difícil hacerlo, realice extracciones adicionales para separar el resto del intestino de los órganos internos restantes.
   3. Utilice una aguja de microinyección para transferir de 10 a 15 intestinos a un tubo de 1,5 ml que contenga 200 ml estériles de 1 x PBS.
   4. Homogeneizar los intestinos con un pestillo para interrumpir el tejido y preparar homogeneiza. Asegúrese de que el pestillo llegue a la parte inferior del tubo para interrumpir todos los intestinos por completo.
4. Incubar los homogenates en C. difficile medio de cría que contiene D-cicloserina y cefoxitina, con o sin taurochola (TCA, un germinante de C. difficile esporas) en una cámara anaeróbica.
5. Incubar la placa anaeróbicamente durante 48 h a 37oC.
6. Utilice el cultivo bacteriano para 16S rRNA-PCR.
   1. Resuspender una colonia en 50 oL de H₂O y hervirla a 95 oC durante 15 minutos. Pellet los restos de levas por centrifugación (14.000 rpm durante 2 min a RT) y utilizar 2 l del sobrenadante como plantilla en 25 éL de reacción PCR utilizando C. difficile-específico sillas (Cdiff16Sfw: 5' GTG Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
   2. Cuando se utilizan bacterias de cultivo líquido, cosechar 1 ml de cultivo y lavar una vez con 1 ml de PBS (14.000 rpm durante 2 min en RT). Resuspenda el gránulo en 100 ml de H₂O_dd y trate como se ha hecho anteriormente. Para caracterizar aún más las colonias bacterianas, raya en una placa BHIS o cromoID(Tabla de Materiales).

   

Resultados

C. difficile es estrictamente anaeróbico, pero el cromóforo de las proteínas fluorescentes generalmente requiere oxígeno para madurar. Para superar este problema, se utilizó un tinte fluorescente para manchar las células vivas de C. difficile que estaban creciendo activamente (R20291, una cepa ribotipo 027; Figura 1A). Utilizando el sistema Gal4/UAS, se generaron líneas estables transgénicas de peces cebra para imágenes en vivo, en las que los prom...

Discusión

Los métodos presentados modifican y amplían un enfoque existente para infectar las larvas de peces cebra mediante la realización de inyección y microvaage^10,14. También demuestra un enfoque para estudiar patógenos anaeróbicos con larvas de peces cebra^22. Además, el protocolo facilita el análisis de las respuestas innatas de las células inmunitarias in vivo sobre el CDI y sobre la colonización de C. difficile en el pez c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576	Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM)	Pronadisa	8050	It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial Stain	Thermo Fisher Scientific	B35001	Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion Broth	Carl Roth GmbH	X916.1
Brass (wild-type)			deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396
Capillary Glass	Harvard Apparatus	30-0019	Injection needles
Clostridioides difficile			R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	open-source platform		Image processing
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
Horizontal needle puller	Sutter instrument Inc	P-87
L-cysteine	Sigma-Aldrich	168149
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Image processing
Magnesium sulfate (MgSO4)	Carl Roth GmbH	P026
Micro injector	eppendorf	5253000017
Microinjection molds	Adaptive Science Tools	TU1
Leica SP8 confocal microscope	Leica
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P0290
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH	5346
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265
Taurocholate	Carl Roth GmbH	8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3			stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3			stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Yeast extract	BD Bacto	212750