JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представленный здесь безопасный и эффективный метод заражения личинок зебры флуоресцентно помечены анаэробных C. difficile микроинъекции и неинвазивных микрогаважа.

Аннотация

Clostridioides difficile инфекции (CDI) считается одним из наиболее распространенных медицинских связанных желудочно-кишечных инфекций в Соединенных Штатах. Врожденный иммунный ответ против C. difficile был описан, но точные роли нейтрофилов и макрофагов в CDI менее понятны. В текущем исследовании, Личинки Данио рерио (зебрафиш) используются для создания модели C. difficile инфекции для визуализации поведения и сотрудничества этих врожденных иммунных клеток in vivo. Для мониторинга C. difficileустановлен протокол маркировки с использованием флуоресцентного красителя. Локализованная инфекция достигается путем микроинъекций с пометкой C. difficile, которая активно растет в желудочно-кишечном тракте зебры и имитирует повреждение эпителиального кишечника в CDI. Однако, этот прямой протокол инфекции является инвазивным и вызывает микроскопические раны, которые могут повлиять на экспериментальные результаты. Таким образом, здесь описан более неинвазивный протокол микрогаважа. Метод включает в себя доставку C. difficile клеток непосредственно в кишечнике личинок зебры путем интубации через открытый рот. Этот метод инфекции тесно имитирует естественный путь инфекции C. difficile.

Введение

C. difficile является грамположительный, спорообразующих, анаэробных и токсинопроизводящих бацилл, что является основной причиной тяжелых инфекций в желудочно-кишечном тракте1. Типичные симптомы CDI включают диарею, боли в животе, и смертельный псевдомембранный колит, и это иногда может привести к смерти1,2. Фактические данные показали, что иммунные реакции хозяина играют решающую роль как в прогрессировании, так и в исходе этого заболевания3. В дополнение к иммунному ответу, коренная микрофлора кишечника имеет решающее значение для начала и патогенеза CDI4. За последнее десятилетие, как число случаев заболевания, так и смертность от CDI значительно возросли из-за появления гипервирулентного штамма C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Более глубокое понимание основных иммунных механизмов и роли микробиоты во время CDI поможет привести к новым терапевтическим изменениям и достижениям, что позволит лучше контролировать эту эпидемию.

Несколько животных моделей, таких как хомяк и мышь, были разработаны, чтобы обеспечить понимание иммунной защиты от C. difficile7,8. Тем не менее, роль врожденных иммунных клеток все еще плохо понимается, тем более, что врожденное поведение иммунных клеток в основном происходит от гистологического анализа или культивированных клеток in vitro. Таким образом, создание прозрачной модели зебры, чтобы выявить врожденный иммунный ответ на C. difficile внутри живого позвоночного организма будет способствовать таким исследованиям. Личинки зебрафиш имеют функциональную врожденную иммунную систему, но им не хватает адаптивной иммунной системы до 4-6 недель после оплодотворения9. Эта уникальная особенность делает личинки зебры отличной моделью для изучения изолированной реакции и функции врожденных иммунных клеток в CDI.

В настоящем докладе описаны новые методы использования личинок зебры для изучения взаимодействий между C. difficile и врожденными иммунными клетками, такими как макрофаги и нейтрофилы. Во-первых, представлен локализованный протокол микроинъекций, который включает C. difficile inoculum и окрашивание. При использовании in vivo конфокальной визуализации покадровой прослеживание, реакция нейтрофилов и макрофагов на место заражения фиксируется, а также наблюдается фагоцитоз бактерий нейтрофилов и макрофагов. Тем не менее, было сообщено, что сама инъекция вызывает повреждение тканей и приводит к набору лейкоцитов независимо от бактерий10. Таким образом, неинвазивный протокол микрогаважа для доставки C. difficile в кишечнике личинок зебры впоследствии описывается. Предыдущие исследования показали, что коренная микрофлора желудочно-кишечного тракта защищает хозяина от колонизации C. difficile11. Таким образом, гнотобиотические личинки зебры также используются для предрасположенности зебры, которые инфицированы 12. После этого проводится вскрытие кишечника для восстановления жизнеспособного C. difficile и проверки продолжительности их присутствия в желудочно-кишечных трактах зебры.

протокол

Все описанные здесь работы на животных выполнялись в соответствии с правовыми нормами (EU-Directive 2010/63, лицензия АЗ 325.1.53/56.1-TUBS и лицензия АЗ 33.9-42502-04-14/1418).

1. Подготовка низкорасплавляющихся агароуз, гель плиты, и микроинъекции / микрогаважских игл

  1. Растворите 0,08 г низкорасплавляющей агарозы(Таблица материалов,агароз a2576) в 10 мл 30% средней Данио (0,12 мМ MgSO4, 0,18 мм Ca No32), 0,21 мМ ККЛ, 1,5 мМ HEPES (pH 7.2), и 17.4 mM NaCl, хранящийся при комнатной температуре (RT) для получения раствора 0,8%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие или более низкие концентрации агарозы могут быть использованы. Тем не менее, необходимое время для затвердевк варьируется для различных марок агарозы, даже при той же концентрации.
  2. Подготовка микроинъекций и микрогавагии иглы из стеклянных капилляров(Таблица материалов).
    1. Используйте выдвижной микропайпот со следующими настройками (обратите внимание, что единицы специфичны для шкива, используемого здесь; см. Таблица Материалов):иглы микроинъекций (давление воздуха 500; тепло 400; тянуть 125; скорость 75; время 150); и иглы микрогаважа (давление воздуха - 500; тепло 400; тяга 100; скорость - 75; время - 150). Используйте наконечник микрозагрузчика, чтобы загрузить 3 Зл нуклеазы без H2O в вытащил иглы.
    2. Введите иглу в инжектор и закрепите его должным образом. Отрегулируйте иглу под подходящий угол для инъекций. Установите давление инъекций между 600-900 hPa для микроинъекционной иглы и 200-300 hPa для gavage иглы.
    3. Поместите каплю минерального масла на черный круг калибровочной горки. Используйте тонкие щипцы, чтобы обрезать кончик иглы. Введите одну каплю в минеральное масло, чтобы измерить размер капли.
    4. Для микроинъекции отрегулируйте время впрыска, чтобы получить капельку диаметром 0,10-0,12 мм, что равно объему 0,5-1,0 нл. Для микрогаважа получите капельку диаметром 0,18-0,20 мм, что равно объему 3-5 нл.
  3. Подготовка 1,5 % агарозной пластины с агарозом(Таблица материалов, 8050) в 10 см Петри блюдо в 30% Данио среды с помощью пластиковой формы, как микрогавадж формы. Хранить при 4 градусах по Цельсию, чтобы предотвратить высыхание до тех пор, пока это необходимо. Теплый до RT или 28 градусов по Цельсию до начала эксперимента.

2. Подготовка и маркировка C. difficile и спор с флуоресцентным красителем

  1. Подготовьте 1 мМ бульонный раствор флуоресцентного красителя(Таблица материалов). Поскольку краситель продается в 50 мкг аликвотов порошка, добавьте 69 мл DMSO в флакон, чтобы получить концентрацию запасов 1 мМ.
  2. Подготовьте рабочий раствор флуоресцентного красителя мощностью 100 км флуоресцентного красителя, добавив 2 л 1 мМ бульонного раствора к 18 л DMSO в центрифуге трубки, и хорошо перемешайте.
  3. Культура C. difficile (R20291, штамм риботипа 027) путем прививки 10 мл жидкой среды BHIS с двумя-тремя колониями из пластины в анаэробном капюшоне, не тряся на ночь. BHIS является BHI дополнен0,5% (w/v) дрожжевой экстракт и 0,1% (w/v) L-цистеин. Растворите 1 г L-цистеина в 10 мл ddH2O и стерилизуйте путем фильтрации, затем добавьте к автоклавизированной среде, чтобы получить окончательную концентрацию 1 г/л. Плиты готовятся путем добавления 15 г/л агар-агара к среде перед автоклавированием. Селективная культивирование C. difficile осуществляется с помощью хромидных C. difficile пластин (Таблица материалов).
  4. Окрашивание C. difficile с флуоресцентным красителем
    1. Урожай C. difficile при ОД600 1,0-1,2 и мыть 1x с 1 мл 1x PBS (5000 х г в течение 3 мин на RT). Приостановить в 1 мл 1 х PBS.
    2. Добавьте 3 зл и сто рабочий раствор флуоресцентного красителя в 1 мл суспензии бактерий. Инкубировать образец в течение 15 минут на RT в темноте. Вымойте окрашенные C. difficile один раз с 1 мл PBS для удаления остаточного красителя и resuspend в 1x PBS до OD600 из 1,0 (1,0 OD600 примерно эквивалентно 108 cfu/mL).

3. Инъекции окрашенных C. difficile в личинки зебрафиш

  1. Анестезия 20-30 личинки зебры в 5 дней после оплодотворения (называется здесь как 5 dpf) с 0,02%-0,04% трикаин (трикаин порошок растворяется в двойной дистиллированной воды и скорректированы до рН No 7 с 1 M Tris-HCL решение) в 30% Данио в среднем до 10 мин Инъекций. Перенесите обезопаренные личинки в свежее блюдо Петри высотой 10 см и удалите излишки 30% среды Данио.
  2. Поместите падение 0,8% низкой плавления агарозы на личинки зебры, чтобы покрыть. Аккуратно отрегулируйте личинки в боковое положение. Поместите чашку Петри на лед в течение 30-60 с, чтобы позволить низкой таяния агарозы затвердеть. Добавьте 30% среды Данио, содержащей 0,02%-0,04% трикаин для покрытия агарозы.
  3. Подготовьте раствор для инъекций. Добавьте 1 зл 0,5% фенола красного цвета в растворе PBS в 9 л окрашенных красителями C. difficile inoculum, чтобы визуализировать процесс инъекций.
  4. Загрузите откалиброванные микроинъекционные иглы с помощью инъекционного раствора с помощью микрозагрузчика. Установите заряженную иглу на микроманипулятор и расположите ее под стереомикроскопом.
  5. Отрегулируйте давление инъекций между 600-900 hPa. Установите время инъекции до 0,1-0,3 с, чтобы получить 0,5-1,0 нл. Установите иглу в микроманипулятор под углом 45 градусов, указывая на встроенные личинки.
  6. Поместите кончик иглы над желудочно-кишечным трактом близко к урогенитальной поре. Прокалывая через агарозу затем мышцы с кончиком иглы, а затем вставить его в просвет кишечника и вводить 0,5-1,0 нл C. difficile. Используйте флуоресцентный микроскоп для мониторинга инъекционных личинок и подобрать правильно вводили личинки для конфокальной визуализации.

4. Поколение гнотобиотиков червей зебрафиш

  1. Используйте устоявшийся метод естественного размножения для генерации гноотобиотических эмбрионов зебры, в том числе: экстракорпоральное оплодотворение, промывка с антибиотикосодержащей средой (1 мкг/мЛ амфотерицина В, 10 мкг/мл канамицин, и 20 мкг/мл ампициллин), промывание с 0,1% wt/vol поливинил пирролидон-йод (PVP-I) раствор, и инкубация эмбриона в клетке.
  2. Поддерживать все гнотобиотические личинки зебры в гнотобиоических условиях до 5 dpf или непосредственно перед gavage. После гаважа личинки зебры будут переданы в стандартный инкубатор, но со стерильным 30% среды Данио.

5. Гаваж из личинки зебрафиш

  1. Калибровать иглу микрогаважа, как описано в шаге 1.2.
  2. Измерьте диаметр кончика иглы, поместив иглу на калибровочной горке с одной каплей минерального масла. Убедитесь, что наконечник 30-40 мкм в диаметре, тупой и гладкой. Откажитесь от острых или грубых игл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Острые края иглы могут быть притуплены быстрым пылающим.
  3. Подготовьте решение gavage, как описано в шаге 3.3.
  4. Загрузите и установите иглу на микроманипулятор, как описано в шаге 3.4. Отрегулируйте микроманипулятор, чтобы расположить иглу под углом 45 градусов.
  5. Анестезия личинок зебры, упомянутых в шаге 3.1. Когда личинки перестанут двигаться, перенесите их в паз микрогаважа с помощью пипетки Pasteur.
  6. Поместите падение 0,8% низкой плавления агарозы на личинки зебры, чтобы покрыть. Аккуратно отрегулируйте личинки головками, обращенными в вертикальное, под углом 45 градусов в пазе и хвостами к стене канавки. Убедитесь, что углы головок примерно одинаковы, чтобы они были выровнены под углом иглы gavage. Поместите форму микрогаважа на лед на 30-60 с, что позволяет низкоплавающей агарозы затвердеть, чтобы стабилизировать позиции личинок.
  7. Отрегулируйте давление инъекций между 200-300 hPa. Установите время инъекции до 0,1-0,3 с, чтобы получить объем инъекции 3-5 nL C. difficile.
  8. Аккуратно работать иглы через агарозу затем в рот личинки зебры, через пищевод. После того, как кончик иглы находится внутри передней кишечной лампы, нажмите на педаль инъекций, чтобы освободить бактерии. Заполните просвет кишечника с доставленным объемом. Не позволяйте ему перетекать из пищевода или клоаки. Аккуратно вынять иглу из уст зебры.
  9. После gavage, спасти инфицированных личинок зебры из агарозы с гибкой микропогрузчик отзыв, сначала резки агарозы прочь, то, подняв личинки. Перенесите эти личинки в стерильную 30% среды Данио. Промыть личинки в стерильной среде в два раза. Перенесите личинки в свежее 10 см чашку Петри. Личинки будут поддерживаться до 11 dpf.

6. Конфокальная микроскопия Анализ инъекционных личинки зебрафиш

  1. Анестезия личинки зебры относится к шагу 3.1. Сделайте отверстие в нижней части 35 мм Петри блюдо со стеклянной горкой прилагается к отверстию, называется камеры изображения. Перенос эмбрионов на дно камеры изображения с достаточным количеством 30% среды Данио.
  2. Добавьте 200-300 л из 1% низкоплавленной агарозы, чтобы покрыть анестезированные личинки. Так как используется перевернутый конфокальный микроскоп, поместите зараженную область личинок к стеклянной горке как можно ближе.
  3. Пусть агароуз затвердеет на льду на 30-60 с. Погрузите агароз у 30% Данио, содержащего 0,02%-0,04% трикаин.
  4. Изображение личинок с конфокального лазерного сканирования микроскопа(Таблица материалов).

7. Рассечение кишечника Larval Зебрафиш для восстановления жизнеспособного C. difficile

  1. Изолировать желудочно-кишечные тракты от личинок для анализа бактериальной нагрузки. Начните с эвтаназии личинок зебры с 0,4% трикаина.
  2. Промыть зебры кратко стерильной 1x PBS и передать их в свежей пластине агарозы.
  3. Рассечение зебры
    1. Вставьте иглу в ствол доза личинок зебры близко к голове, чтобы обездвижить зебры. Снимите голову за жабры с ланцетом.
    2. Вставьте вторую иглу в середину туловища. Вставьте третью иглу в брюшную полость зебры и вытащите кишечник из полости тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайняя осторожность необходима для изоляции нетронутой кишечника. Если это трудно сделать, выполнить дополнительные тянет, чтобы отделить остальную часть кишечника от остальных внутренних органов.
    3. Используйте иглу микроинъекции для передачи 10-15 кишечника в трубку 1,5 мл, содержащую 200 л стерильных 1x PBS.
    4. Гомогенизировать кишечник с пестиком, чтобы нарушить ткани и подготовить гомогенаты. Убедитесь, что пестик достигает нижней части трубки, чтобы нарушить все кишечника полностью.
  4. Инкубировать гомогенаты в C. difficile воспитания среды, содержащей D-циклоцерин и цефокситин, с или без таурохолата (TCA, зародышевой C. difficile спор) в анаэробной камере.
  5. Инкубировать пластину анаэробически в течение 48 ч при 37 градусах Цельсия.
  6. Используйте бактериальную культуру для 16S rRNA-PCR.
    1. Приостановите колонию в 50 л H2O и варите ее при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 15 мин. Пеллетли лисиченые обломки центрифугации (14000 об/мин в течение 2 мин на RT) и использовать 2 злицу супернатанта в качестве шаблона в 25 ЗЛ ПЦР-реакции с использованием C. difficile-специфическихпраймеров (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
    2. При использовании бактерий из жидкой культуры, урожай 1 мл культуры и мыть один раз с 1 мл PBS (14000 об/мин в течение 2 мин на RT). Приостановите гранулы в 100 Л H2Odd и обработайте, как это делается выше. Для дальнейшей характеристики бактериальных колоний, полоса на BHIS- или хромид-пластины(Таблица материалов).

   

Результаты

C. difficile строго анаэробный, но хромофор флуоресцентных белков обычно требует кислорода, чтобы созреть. Чтобы преодолеть эту проблему, флуоресцентный краситель был использован для окрашива тькоцита C. difficile клеток, которые активно росли (R20291, штамм риботипа 027; Рисунок...

Обсуждение

Представленные методы изменить и расширить существующий подход к заражению личинок зебры, выполняя как инъекции и микрогаваж10,14. Он также демонстрирует подход к изучению анаэробных патогенов с личинками зебры22. Кроме того, протокол облегча...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарны Тимо Фричу за отличный уход за животными. Мы благодарим сотрудников лабораторий Кёстер и Штайнерт за поддержку и полезные обсуждения. Мы благодарим доктора Дандана Хана за критическое чтение рукописи. Мы с благодарностью признательны за финансирование со стороны федеральной штата Нижняя Саксония, Nieders'chsisches Вораб (ВВЗН2889).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA2576Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM)Pronadisa8050It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial StainThermo Fisher ScientificB35001Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion BrothCarl Roth GmbHX916.1
Brass (wild-type)deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2)Sigma-AldrichC1396
Capillary GlassHarvard Apparatus30-0019Injection needles
Clostridioides difficileR20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSOCarl Roth GmbHA994
FIJIopen-source platformImage processing
HEPESCarl Roth GmbH6763
Horizontal needle pullerSutter instrument IncP-87
L-cysteineSigma-Aldrich168149
Leica Application Suite X (LAS X)LeicaImage processing
Magnesium sulfate (MgSO4)Carl Roth GmbHP026
Micro injectoreppendorf5253000017
Microinjection moldsAdaptive Science ToolsTU1
Leica SP8 confocal microscopeLeica
Phenol RedSigma-AldrichP0290
Potassium chloride (KCl)Carl Roth GmbH5346
Sodium chloride (NaCl)Carl Roth GmbH9265
TaurocholateCarl Roth GmbH8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
TricaineSigma-AldrichE10521
Yeast extractBD Bacto212750

Ссылки

  1. Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
  2. Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
  3. Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
  4. Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
  5. Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
  6. Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
  7. Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
  8. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  9. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
  10. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  11. Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
  12. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
  13. Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
  14. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
  15. Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
  16. Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
  17. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  18. Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
  19. Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
  20. Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
  21. Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
  22. Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

156Clostridioides difficile

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены