为梭状体开发拉瓦尔斑马鱼感染模型

摘要

这里介绍的是一种安全有效的方法，通过微注射和非侵入性微藻感染斑马鱼幼虫荧光标记厌氧C.困难。

摘要

梭状体困难感染 （CDI） 被认为是美国最常见的医疗保健相关胃肠道感染之一。已描述对C.困难的先天免疫反应，但中性粒细胞和巨噬细胞在CDI中的确切作用较少。在目前的研究中，达尼奥雷里奥（斑马鱼）幼虫被用来建立一个C.困难感染模型，用于成像这些先天免疫细胞在体内的行为和合作。为了监测梭菌，已经建立了一个使用荧光染料的标签协议。局部感染是通过标记C.困难的显微注射实现的，这种注射在斑马鱼肠道中积极生长，并模仿CDI中的肠道上皮损伤。然而，这种直接感染方案是侵入性的，导致显微伤口，这可能会影响实验结果。因此，这里描述了一种更无创的微藻协议。该方法包括通过张口插管将C.困难细胞直接输送到斑马鱼幼虫的肠道。这种感染方法与C.困难器的自然感染途径相近。

引言

梭菌是一种克阳性、孢子成形、厌氧和毒素产生的杆菌，是胃肠道¹严重感染的主要原因。CDI的典型症状包括腹泻，腹痛，和致命的假膜结肠炎，它有时可能导致死亡^1，2。有证据表明，宿主免疫反应在这种疾病的进展和结果中都起着关键作用^。除了免疫反应，本地肠道微生物群对CDI⁴的发病和发病机制至关重要。在过去十年中，由于出现C.困难性超毒菌株（BI/NAP1/027）5、6 ，CDI的病例数和死亡率均显著增加。更好地了解潜在的免疫机制和在CDI期间微生物群的作用将有助于导致新的治疗发展和进步，从而更好地控制这一流行病。

一些动物模型，如仓鼠和老鼠，已经开发出来，以提供洞察对C.困难^7，8的免疫防御。然而，对先天免疫细胞的作用仍然知之甚少，特别是因为先天免疫细胞的行为主要来自组织学分析或体外培养细胞。因此，建立一个透明的斑马鱼模型，揭示活体脊椎动物有机体内部对C.困难的先天免疫反应，将有助于此类研究。斑马鱼幼虫具有功能性先天免疫系统，但它们缺乏适应性免疫系统，直到受精⁹周后4-6周。这一独特特征使斑马鱼幼虫成为研究CDI中先天免疫细胞的分离反应和功能的优秀模型。

本报告描述了使用斑马鱼幼虫研究梭菌和先天免疫细胞（如巨噬细胞和嗜中性粒细胞）之间的相互作用的新方法。首先，提出了一种局部的显微注射方案，包括C.困难接种和染色。利用体内共聚焦延移成像，记录中性粒细胞和巨噬细胞对感染部位的反应，并观察嗜中性粒细胞和巨噬细胞对细菌的噬菌体。然而，据报道，注射本身导致组织损伤，并导致独立于细菌¹⁰的白细胞的招募。因此，随后描述了一种非侵入性微藻方案，用于将C.困难输送到斑马鱼幼虫的肠道。先前的研究已经表明，本地胃肠道微生物群保护宿主免受C.困难¹¹的殖民化。因此，诺生物斑马鱼幼虫也被用来使被感染的斑马鱼容易^感染。之后，进行肠道解剖以恢复可行的C.困难，并验证它们在斑马鱼肠道中的持续时间。

研究方案

此处描述的所有动物工作均按照法律规定（欧盟指令 2010/63、许可证 AZ 325.1.53/56.1-TUBS 和许可证 AZ 33.9-42502-04-14/1418）进行。

1. 低熔甘蔗、凝胶板和微注射/微加注针的制备

1. 在 10 mL 的 30% Daniau 的介质（0.12 mM MgSO₄， 0.18 mM Ca [NO₃+_2]） 0.21 mM KCl） 中溶解 0.08 g 低熔融甘蔗 （材料表， 甘蔗 A2576）， 1.5 mM HEPES （pH = 7.2） 和 17.4 mM NaCl，在室温 （RT） 下储存，以获得 0.8% 的溶液。
   注:可以使用高浓度或较低浓度的甘蔗。然而，凝固所需的时间因不同品牌的甘蔗而异，即使浓度相同。
2. 从玻璃毛细血管（材料表）制备显微注射和微血管针。
   1. 使用具有以下设置的微移液器拉拔器（请注意，单位特定于此处使用的拉拔器;参见材料表）:微注射针（气压 = 500;热 = 400;拉 = 125;速度 = 75;时间 = 150）;和微加维针（气压=500;热=400;拉力=100;速度=75;时间=150）。使用微装载机尖端将 3 μL 的无核酸酶 H₂O 装载到拉针中。
   2. 将针头插入喷油器并正确固定。将针头调整到合适的角度进行注射。将注射压力设置为 600~900 hPa（用于显微注射针）和 200*300 hPa（用于加注针）。
   3. 将一滴矿物油放在校准滑块的黑色圆上。使用细钳夹住针尖。将一滴注入矿物油中，以测量水滴的大小。
   4. 对于显微注射，调整注射时间以获得直径为 0.10*0.12 mm 的液滴，等于 0.5*1.0 nL 的体积。对于微藻，获得直径为 0.18~0.20 mm 的滴，等于 3~5 nL 的体积。
3. 在 10 厘米培养皿中，在 30% Daniau 的培养基中，使用塑料模具作为微藻模具，在 10 厘米培养皿中制备一个 1.5% 的甘蔗板（材料表，8050）。储存在4°C，以防止干燥，直到需要。在实验前加热到RT或28°C。

2. 荧光染料C.衍射和孢子的制备和标记

1. 准备荧光染料的1 mM库存溶液（材料表）。由于染料以50μg等分粉末出售，在小瓶中加入69μL的DMSO，以获得1 mM的库存浓度。
2. 在离心管中向18μL DMSO中加入2μL的1mM库存溶液，制备荧光染料的100μM工作溶液，并混合均匀。
3. 培养C. 困难（R20291， 核糖型 027 应变） 通过接种 10 mL 的 BHIS 液体介质与两到三个菌落从板在厌氧罩没有晃动过夜。BHIS 是 BHI 补充 0.5% （w/v） 酵母提取物和 0.1% （w/v） L-半胱氨酸.将1克L-半胱氨酸溶解在10 mL ddH₂O中，然后通过过滤进行灭菌，然后加入高压灭菌介质，以获得1克/升的最终浓度。使用铬化C. 衍射板 （材料表） 进行C. 衍射的选择性培养。
4. 用荧光染料染色C.困难
   1. 在 OD₆₀₀的 1.0×1.2 下收获C. 困难，用 1 mL 的 1x PBS洗涤 1x（RT 时为 3 分钟）。在 1 x PBS 的 1 mL 中重新悬浮。
   2. 将荧光染料的工作溶液加入1mL的细菌悬浮液中。在黑暗中在RT孵育样品15分钟。用 1 mL PBS 清洗染色的 C.困难，以去除残留染料，并在 1x PBS 中重新悬浮到 1.0 的 OD_600（1.0 OD₆₀₀大约相当于 10⁸ cfu/mL）。

3. 将染色的C.困难注射到斑马鱼幼虫中

1. 麻醉 20-30 斑马鱼幼虫在5天受精后（这里称为5 dpf）与0.02%-0.04%三丁酸（三丁基粉末溶解在双蒸馏水中，并调整到pH = pH = pH = 7与1M Tris-HCL溶液）在30%达尼奥的中等+10分钟之前注射。将麻醉幼虫转移到新鲜的10厘米培养皿中，并去除任何超过30%的Daniau的培养物。
2. 将0.8%的低融化琼脂蔗放在斑马鱼幼虫上覆盖。轻轻地将幼虫调整到横向位置。将培养皿放在冰上30-60s，让低熔化的甘蔗凝固。加入30%的Daniau的介质，含有0.02%~0.04%三角肌，以覆盖角质。
3. 准备注射液。在PBS溶液中加入1μL的0.5%苯酚红，加入9μL的染料染色C.衍射接种中，以可视化注射过程。
4. 使用微装载机使用注射液加载经过校准的显微注射针。将装载的针头安装到微型操作器上，并将其置于立体显微镜下。
5. 调整 600~900 hPa 之间的喷射压力。将喷射时间设置为 0.1~0.3 s 以获得 0.5*1.0 nL。将针放在微操作器中，以 [45°]角指向嵌入的幼虫。
6. 将针尖放在靠近泌尿生殖毛孔的胃肠道上方。穿刺通过角胶然后肌肉与针尖，然后插入到肠道流明和注射0.5~1.0 nL的C.困难。使用荧光显微镜监测注射的幼虫，并拾起正确注射的幼虫进行共聚焦成像。

4. 一代诺多生物斑马鱼幼虫

1. 使用成熟的自然繁殖方法生成诺基生物斑马鱼胚胎， 包括:体外受精，用含抗生素的培养基（1微克/mL氨基林B，10微克/mL卡那霉素和20微克/mL氨基霉素），用0.1%wt/vol聚氯乙烯-碘（PVP-I）溶液清洗，并在细胞培养罩¹²中孵育胚胎。
2. 在诺生物菌条件下，将所有诺生物斑马鱼幼虫保持至5 dpf或在加夫之前。加夫脑后，斑马鱼幼虫将被转移到标准孵化器中，但具有无菌的30%达尼瑙的培养基。

5. 斑马鱼幼虫的觅食

1. 校准微加口针，如步骤 1.2 所述。
2. 将针放在用一滴矿物油的校准幻灯片上，测量针尖的直径。确保尖端直径为 30~40 μm，钝器和光滑。丢弃锋利或粗糙的针头。
   注:快速燃烧可以钝化针头的锋利边缘。
3. 如步骤 3.3 中所述，准备 gavage 解决方案。
4. 如步骤 3.4 所述，将针头装载到微操作器上。调整微操作器以将针定位为 45° 角。
5. 麻醉步骤3.1中提到的斑马鱼幼虫。当幼虫停止移动时，使用巴斯德移液器将它们转移到微藻模具的凹槽中。
6. 将0.8%的低融化琼脂蔗放在斑马鱼幼虫上覆盖。在凹槽中，头部朝直地直立，凹槽中的尾部与凹槽壁对着，轻轻调整幼虫。确保磁头的角度大致相同，以便它们与盖形针的角度对齐。将微藻模放在冰上30-60s，使低熔化的甘蔗凝固，以稳定幼虫的位置。
7. 调整 200~300 hPa 之间的喷射压力。将注射时间设置为 0.1~0.3 s，以获得 3~5 nL 的C. 困难。
8. 轻轻地操作针通过琼脂，然后进入斑马鱼幼虫的口，通过食道。一旦针头在前肠球内，按注射踏板释放细菌。用传递的体积填充肠道的流明。不要让它溢出食道或氯卡。轻轻地从斑马鱼的嘴里取出针头。
9. 之后，用灵活的微装载机尖端将受感染的斑马鱼幼虫从角质动物中拯救，先将琼脂动物切开，然后抬起幼虫。将这些幼虫转移到无菌的30%达尼瑙的介质中。用无菌介质冲洗幼虫两次。将幼虫转移到新鲜的10厘米培养皿中。幼虫将维持多达11 dpf。

6. 注射斑马鱼幼虫的共聚焦显微镜分析

1. 麻醉斑马鱼幼虫是指步骤3.1。在 35 mm 培养皿的底部打一个洞，并连接在孔上的玻璃滑块，称为成像室。将胚胎转移到成像室的底部，用足够量的30%的Daniau的培养基。
2. 加入200~300μL 1%低熔化甘蔗，以覆盖麻醉幼虫。由于使用倒置共聚焦显微镜，因此尽可能将幼虫的受感染区域放在玻璃滑动上。
3. 让角质在冰上凝固30-60s。用30%的达瑙含有0.02%-0.04%三叶草的30%的甘蔗将甘蔗浸没。
4. 用共聚焦激光扫描显微镜（材料表）对幼虫进行成像。

7. 解剖幼虫斑马鱼肠以恢复可存活的C.困难

1. 从幼虫中分离胃肠道，分析细菌负荷。首先用0.4%三叶草对斑马鱼幼虫进行安乐死。
2. 用无菌的1x PBS短暂冲洗斑马鱼，并将其转移到新鲜的琼脂色盘。
3. 斑马鱼的解剖
   1. 将针插入靠近头部的斑马鱼幼虫的背箱中，以固定斑马鱼。用柳叶刀取下刺后的头部。
   2. 将第二针插入背干中间。将第三针插入斑马鱼的腹部，将肠子从体腔中拉出。
      注意:需要极度小心才能隔离完整的肠道。如果很难做到这一点，执行额外的拉扯，以分离肠的其余部分从剩余的内脏器官。
   3. 使用显微注射针将10~15个肠子转移到含有200μL无菌1x PBS的1.5 mL管中。
   4. 使肠道与虫子同质化，以破坏组织并准备均质物。确保虫子到达管的底部，以完全扰乱所有肠道。
4. 在厌氧室中孵育含有D-环素和西福西丁的C.困难饲养培养基中，无论是否含陶罗菌酸盐（TCA，C.困难孢子的发芽物）。
5. 在37°C下厌氧孵育板48小时。
6. 使用细菌培养 16S rRNA-PCR。
   1. 在_H2O的50 μL中重新悬浮菌群，在95°C下煮沸15分钟。 通过离心（14，000 rpm，RT时2分钟）将碎屑压碎，并使用2μL的上清液作为模板，在25μL的PCR反应中使用C.衍射-特异性底漆（C.衍射-特异性底漆（Cdiff16Sfw:5'GTG AGC CAG TAC 3';Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3'）。
   2. 当使用液体培养菌时，收获1mL培养液，用1mL的PBS清洗一次（14，000 rpm，RT时2分钟）。将颗粒重新悬浮在 H₂O_dd的 100 μL L 中，并如上所述处理。为了进一步描述细菌菌落，在BHIS或铬质板（材料表）上条纹。

   

结果

梭子是严格无氧的，但荧光蛋白的色度通常需要氧气才能成熟。为了克服这个问题，荧光染料被用来染色活的C.困难细胞，这些细胞正在积极生长（R20291，核糖核酸型027菌株;图 1A.使用Gal4/UAS系统，生成稳定的转基因斑马鱼线进行活成像，其中mpeg1.1或lyZ启动子以Gal4依赖性的方式驱动巨噬细胞和中性粒细胞中EGFP荧光蛋白的表达。

讨论

提出的方法修改和扩展了现有的方法，通过执行注射和微藻^10，14感染斑马鱼幼虫。它还演示了一种研究斑马鱼幼虫²²厌氧病原体的方法。此外，该议定书还有助于分析CDI和斑马鱼中C.困难的体内先天免疫细胞反应。该方法可重复，易于在常规实验室或临床环境中进行。

监测白细胞的C.困难的噬菌体， ?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576	Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM)	Pronadisa	8050	It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial Stain	Thermo Fisher Scientific	B35001	Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion Broth	Carl Roth GmbH	X916.1
Brass (wild-type)			deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396
Capillary Glass	Harvard Apparatus	30-0019	Injection needles
Clostridioides difficile			R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	open-source platform		Image processing
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
Horizontal needle puller	Sutter instrument Inc	P-87
L-cysteine	Sigma-Aldrich	168149
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Image processing
Magnesium sulfate (MgSO4)	Carl Roth GmbH	P026
Micro injector	eppendorf	5253000017
Microinjection molds	Adaptive Science Tools	TU1
Leica SP8 confocal microscope	Leica
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P0290
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH	5346
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265
Taurocholate	Carl Roth GmbH	8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3			stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3			stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Yeast extract	BD Bacto	212750