Entwicklung eines Larval Zebrafish Infection Model für Clostridioides difficile

Zusammenfassung

Präsentiert hier ist eine sichere und effektive Methode, um Zebrafischlarven mit fluoreszierend markierten anaeroben C. difficile durch Mikroinjektion und nichtinvasive Mikrogavage zu infizieren.

Zusammenfassung

Clostridioides difficile Infektion (CDI) gilt als eine der häufigsten Gesundheits-assoziierten Magen-Darm-Infektionen in den Vereinigten Staaten. Die angeborene Immunantwort gegen C. difficile wurde beschrieben, aber die genauen Rollen von Neutrophilen und Makrophagen in CDI sind weniger verstanden. In der aktuellen Studie werden Danio rerio (Zebrafisch) Larven verwendet, um ein C. difficile Infektionsmodell für die Abbildung des Verhaltens und der Zusammenarbeit dieser angeborenen Immunzellen in vivo zu etablieren. Zur Überwachung von C. difficilewurde ein Etikettierungsprotokoll mit einem Fluoreszenzfarbstoff eingerichtet. Eine lokalisierte Infektion wird durch Mikroinjektion mit der Bezeichnung C. difficile erreicht, die aktiv im Darmtrakt des Zebrafisches wächst und die Darmepithelschäden bei CDI imitiert. Dieses direkte Infektionsprotokoll ist jedoch invasiv und verursacht mikroskopische Wunden, die experimentelle Ergebnisse beeinflussen können. Daher wird hier ein nichtinvasiveres Mikrogavage-Protokoll beschrieben. Die Methode beinhaltet die Abgabe von C. difficile Zellen direkt in den Darm von Zebrafischlarven durch Intubation durch den offenen Mund. Diese Infektionsmethode imitiert eng den natürlichen Infektionsweg von C. difficile.

Einleitung

C. difficile ist ein grampositiver, sporenbildender, anaerobeundischer und toxinproduzierender Bacillus, der die Hauptursache für schwere Infektionen im Magen-Darm-Trakt^{ist 1}. Typische Symptome von CDI sind Durchfall, Bauchschmerzen und tödliche pseudomembranöse Kolitis, und es kann manchmal zum Tod führen^1,2. Es gibt Beweise dafür, dass Immunantworten des Wirts eine entscheidende Rolle sowohl für das Fortschreiten als auch für das Ergebnis dieser Krankheit spielen³. Neben der Immunantwort ist die einheimische Darmmikrobiota entscheidend für den Beginn und die Pathogenese von CDI⁴. In den letzten zehn Jahren haben sowohl die Zahl der Fälle als auch die Sterblichkeitsrate von CDI aufgrund der Entstehung eines hypervirulenten Stammes von C. difficile (BI/NAP1/027)^5,6signifikant zugenommen. Ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Immunmechanismen und der Rolle der Mikrobiota während der CDI wird zu neuen therapeutischen Entwicklungen und Fortschritten führen und eine bessere Bekämpfung dieser Epidemie ermöglichen.

Mehrere Tiermodelle, wie Hamster und Maus, wurden entwickelt, um Einblicke in die Immunabwehr gegen C. difficile^7,8zu geben. Die Rolle angeborener Immunzellen ist jedoch noch immer wenig verstanden, zumal das angeborene Verhalten von Immunzellen hauptsächlich aus histologischer Analyse oder kultivierten Zellen in vitro abgeleitet wird. Daher wird die Einrichtung eines transparenten Zebrafischmodells, um die angeborene Immunantwort auf C. difficile innerhalb eines lebenden Wirbeltierorganismus zu enthüllen, solche Studien erleichtern. Zebrafischlarven haben ein funktionelles angeborenes Immunsystem, aber ihnen fehlt das adaptive Immunsystem bis 4-6 Wochen nach der Befruchtung⁹. Diese einzigartige Eigenschaft macht Zebrafischlarven zu einem ausgezeichneten Modell, um die isolierte Reaktion und Funktion angeborener Immunzellen in CDI zu untersuchen.

Dieser Bericht beschreibt neue Methoden mit Zebrafischlarven, um die Wechselwirkungen zwischen C. difficile und angeborenen Immunzellen, wie Makrophagen und Neutrophilen, zu untersuchen. Zunächst wird ein lokalisiertes Mikroinjektionsprotokoll vorgestellt, das C. difficile Inoculum und Färbung enthält. Mit in vivo konfokale Zeitraffer-Bildgebung wird die Reaktion von Neutrophilen und Makrophagen auf die Infektionsstelle aufgezeichnet, und die Phagozytose von Bakterien durch Neutrophile und Makrophagen wird beobachtet. Es wurde jedoch berichtet, dass die Injektion selbst Gewebeschäden verursacht und zur Rekrutierung von Leukozyten unabhängig von den Bakterien^{führt 10}. Daher wird anschließend ein nichtinvasives Mikrogavage-Protokoll beschrieben, um C. difficile in den Darm von Zebrafischlarven zu liefern. Frühere Studien haben gezeigt, dass einheimische gastrointestinale Mikrobiota einen Wirt vor der Kolonisierung von C. difficile¹¹schützen. Daher werden gnotobiotische Zebrafischlarven auch verwendet, um die Zebrafische, die infiziert sind, zu prädisponieren ¹². Danach wird die Darmsektion durchgeführt, um lebensfähige C. difficile zu erholen und die Dauer ihrer Anwesenheit in Zebrafisch-Darmtrakten zu validieren.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den gesetzlichen Bestimmungen durchgeführt (EU-Richtlinie 2010/63, Lizenz AZ 325.1.53/56.1-TUBS und Lizenz AZ 33.9-42502-04-14/1418).

1. Herstellung von niedrigschmelzenden Agarose-, Gelplatten- und Mikroinjektions-/Mikrogavagenadeln

1. 0,08 g niedrigschmelzende Agarose (Materialtabelle, Agarose A2576) in 10 ml von 30% Danieau-Medium (0,12 mM MgSO₄, 0,18 mM Ca [NO₃]₂), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) und 17,4 mM NaCl, bei Raumtemperatur (RT) gelagert, um eine 0,8%-Lösung zu erhalten.
   HINWEIS: Es können höhere oder niedrigere Konzentrationen von Agarose verwendet werden. Allerdings variiert die erforderliche Zeit zur Erstarrung für verschiedene Marken von Agarose, auch bei der gleichen Konzentration.
2. Vorbereiten von Mikroinjektions- und Mikrogavagenadeln aus Glaskapillaren (Materialtabelle).
   1. Verwenden Sie einen Micropipette-Puller mit den folgenden Einstellungen (beachten Sie, dass Einheiten spezifisch für den hier verwendeten Puller sind; siehe Tabelle der Materialien):Mikroinjektionsnadeln (Luftdruck = 500; Hitze = 400; Ziehen = 125; Geschwindigkeit = 75; Zeit = 150); und Mikrogavage Nadeln (Luftdruck = 500; Wärme = 400; Ziehen = 100; Geschwindigkeit = 75; Zeit = 150). Verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um 3 l nukleasefrei_H2O in die gezogene Nadel zu laden.
   2. Führen Sie die Nadel in den Injektor ein und befestigen Sie sie richtig. Stellen Sie die Nadel auf einen geeigneten Injektionswinkel ein. Stellen Sie den Einspritzdruck zwischen 600–900 hPa für Mikroinjektionsnadel und 200–300 hPa für Gavage-Nadel ein.
   3. Legen Sie einen Tropfen Mineralöl auf den schwarzen Kreis des Kalibrierschlittens. Verwenden Sie feine Zangen, um die Spitze der Nadel zu beschneiden. Injizieren Sie einen Tropfen in das Mineralöl, um die Größe des Tröpfchens zu messen.
   4. Passen Sie bei der Mikroinjektion die Injektionszeit an, um ein Tröpfchen mit einem Durchmesser von 0,10–0,12 mm zu erhalten, was einem Volumen von 0,5–1,0 nL entspricht. Für Mikrogavage erhalten Sie ein Tröpfchen mit einem Durchmesser von 0,18–0,20 mm, was einem Volumen von 3–5 nL entspricht.
3. Bereiten Sie eine 1,5 % Agaroseplatte mit Agarose(Tisch der Materialien, 8050) in einer 10 cm Petrischale in 30% Danieaus Medium mit einer Kunststoffform als Mikrogavage-Form vor. Bei 4 °C lagern, um eine Austrocknung zu verhindern, bis sie benötigt wird. Vor dem Experiment auf RT oder 28 °C erwärmen.

2. Herstellung und Kennzeichnung von C. difficile und Sporen mit fluoreszierendem Farbstoff

1. Bereiten Sie eine 1 mM Stammlösung eines Fluoreszenzfarbstoffs vor (Materialtabelle). Da der Farbstoff in 50 g Aliquots Pulver verkauft wird, fügen Sie der Durchstechflasche 69 l DMSO hinzu, um eine Lagerkonzentration von 1 mM zu erhalten.
2. Bereiten Sie eine 100-M-Arbeitslösung des Fluoreszenzfarbstoffs vor, indem Sie in einem Zentrifugenrohr eine 18-L-L-Lösung von 1 m M zu 18 l DMSO hinzufügen und gut mischen.
3. Culture C. difficile (R20291, ein Ribotyp 027 Stamm) durch Impfung von 10 ml BHIS flüssigem Medium mit zwei bis drei Kolonien von einem Teller in einer anaeroben Haube ohne über Nacht zu schütteln. BHIS wird BHI mit 0,5% (w/v) Hefeextrakt und 0,1% (w/v) L-Cystein ergänzt. 1 g L-Cystein in 10 ml ddH₂O auflösen und durch Filtration sterilisieren, dann dem autoklavierten Medium hinzufügen, um eine Endkonzentration von 1 g/L zu erhalten. Platten werden durch Zugabe von 15 g/L Agar-Agar vor dem Autoklavieren hergestellt. Die selektive Kultivierung von C. difficile erfolgt unter Verwendung von chromID C. difficile Platten (Tabelle der Materialien).
4. Färbung C. difficile mit dem fluoreszierenden Farbstoff
   1. C. difficile bei einem OD₆₀₀ von 1.0–1.2 und waschen 1x mit 1 ml 1x PBS (5.000 x g für 3 min bei RT). Resuspend in 1 ml von 1 x PBS.
   2. Fügen Sie 3 l Arbeitslösung des Fluoreszenzfarbstoffs in 1 ml Bakteriensuspension hinzu. Inkubieren Sie die Probe für 15 min bei RT im Dunkeln. Waschen Sie die gebeizte C. difficile einmal mit 1 ml PBS, um Restfarbstoff zu entfernen und in 1x PBS auf eine OD₆₀₀ von 1,0 (1,0 OD₆₀₀ entspricht etwa 10⁸ cfu/ml).

3. Injektion von Stained C. difficile in Zebrafischlarven

1. Anästhetisieren Sie 20–30 Zebrafischlarven an 5 Tagen nach der Befruchtung (hier als 5 dpf bezeichnet) mit 0,02%–0,04% Tricain (Tricainpulver wird in doppeldestilliertem Wasser gelöst und auf pH = 7 mit 1 M Tris-HCL-Lösung eingestellt) in 30% Danieaus Medium 10 min vor Injektion. Die anästhesierten Larven in eine frische 10 cm Petrischale geben und überschüssiges 30% Danieaus Medium entfernen.
2. Legen Sie einen Tropfen von 0,8% niedrig schmelzende Agarose auf die Zebrafischlarven zu decken. Stellen Sie die Larven vorsichtig auf eine seitliche Position ein. Legen Sie die Petrischale für 30-60 s auf Eis, damit sich die niedrig schmelzende Agarose erstarren lässt. Fügen Sie 30% Danieaus Medium mit 0,02%–0,04% Tricain hinzu, um die Agarose abzudecken.
3. Bereiten Sie die Injektionslösung vor. Fügen Sie 1 l 0,5% Phenolrot in PBS-Lösung in 9 l des farbstoffgefärbten C. difficile inoculum hinzu, um den Injektionsprozess zu visualisieren.
4. Laden Sie eine kalibrierte Mikroinjektionsnadel mit der Injektionslösung mit einem Mikrolader. Montieren Sie die geladene Nadel auf einen Mikromanipulator und positionieren Sie sie unter einem Stereomikroskop.
5. Stellen Sie den Einspritzdruck zwischen 600–900 hPa ein. Stellen Sie die Injektionszeit auf 0,1–0,3 s ein, um 0,5–1,0 nL zu erhalten. Stellen Sie die Nadel im Mikromanipulator in einem Winkel von 45° in Richtung der eingebetteten Larven ein.
6. Legen Sie die Nadelspitze über den Magen-Darm-Trakt in der Nähe der Urogenitalpore. Durch Agarose dann den Muskel mit der Nadelspitze durchbohren, dann in das Darmlumen einsetzen und 0,5–1,0 nL C. difficileinjizieren. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die injizierten Larven zu überwachen und die richtig injizierten Larven für die konfokale Bildgebung aufzunehmen.

4. Erzeugung von gnotobiotischen Zebrafischlarven

1. Verwenden Sie die etablierte natürliche Züchtungsmethode, um gnotobiotische Zebrafischembryonen zu erzeugen, einschließlich: In-vitro-Fertilisation, Waschen mit antibiotikahaltigem Medium (1 g/ml-Amphotericin B, 10 g/ml Kanamycin und 20 g/ml Ampicillin), Waschen mit 0,1% Gew/Vol-Polyvinylpyrrolidon-Jod (PVP-I) Und Inkubation der Embryonen in einer Zellkulturhaube¹².
2. Pflegen Sie alle gnotobiotischen Zebrafischlarven unter gnotobiotischen Bedingungen bis 5 dpf oder kurz vor der Gavage. Nach der Gavage werden Zebrafischlarven in einen Standard-Inkubator überführt, jedoch mit sterilem 30% Danieau-Medium.

5. Gavage von Zebrafisch Larven

1. Kalibrieren Sie die Mikrogavage-Nadel wie in Schritt 1.2 beschrieben.
2. Messen Sie den Durchmesser der Nadelspitze, indem Sie die Nadel mit einem Tropfen Mineralöl auf einem Kalibrierschlitten platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Spitze einen Durchmesser von 30 bis 40 m, stumpf und glatt hat. Entsorgen Sie die scharfen oder rauen Nadeln.
   HINWEIS: Scharfe Kanten von Nadeln können durch schnelles Flammen abgestumpft werden.
3. Bereiten Sie die gavage-Lösung wie in Schritt 3.3 beschrieben vor.
4. Laden und montieren Sie die Nadel auf einen Mikromanipulator, wie in Schritt 3.4 beschrieben. Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass die Nadel in einem 45°-Winkel positioniert wird.
5. Anästhesisieren Sie die Zebrafischlarven, auf die in Schritt 3.1 Bezug genommen wird. Wenn sich die Larven nicht mehr bewegen, übertragen Sie sie mit einer Pasteurpipette in die Nut einer Mikrogavage-Form.
6. Legen Sie einen Tropfen von 0,8% niedrig schmelzende Agarose auf die Zebrafischlarven zu decken. Stellen Sie die Larven vorsichtig mit Köpfen an, die in 45°-Winkeln in der Nut aufrecht ausgerichtet sind, und Schwänzen an der Wand der Nut. Stellen Sie sicher, dass die Winkel der Köpfe ungefähr gleich sind, so dass sie mit dem Winkel der Gavage-Nadeln ausgerichtet sind. Legen Sie die Mikrogavage-Form für 30-60 s auf Eis, so dass die niedrig schmelzende Agarose erstarren kann, um die Positionen der Larven zu stabilisieren.
7. Stellen Sie den Einspritzdruck zwischen 200–300 hPa ein. Stellen Sie die Injektionszeit auf 0,1–0,3 s ein, um ein Injektionsvolumen von 3–5 nL C. difficile zu erhalten.
8. Betätigen Sie die Nadel vorsichtig durch die Agarose und dann in den Mund von Zebrafischlarven, durch die Speiseröhre. Sobald sich die Spitze der Nadel in der vorderen Darmlampe befindet, drücken Sie das Injektionspedal, um die Bakterien freizusetzen. Füllen Sie das Lumen des Darms mit dem gelieferten Volumen. Lassen Sie es nicht von der Speiseröhre oder Kloake überlaufen. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus dem Mund des Zebrafisches.
9. Nach dem Gavage die infizierten Zebrafischlarven mit einer flexiblen Mikroladerspitze aus der Agarose retten, indem Sie die Agarose zunächst wegschneiden und dann die Larven anheben. Übertragen Sie diese Larven in sterile 30% Danieaus Medium. Spülen Sie die Larven zweimal in sterilem Medium. Die Larven in eine frische 10 cm Petrischale geben. Die Larven werden für bis zu 11 dpf gehalten.

6. Konfokale Mikroskopieanalyse von injizierten Zebrafischlarven

1. Anästhesisieren Zebrafischlarven bezogen sich auf Schritt 3.1. Machen Sie ein Loch in den Boden einer 35 mm Petrischale mit einem Glasschlitten, der an der Bohrung befestigt ist, die als Bildkammer bezeichnet wird. Übertragen Sie Embryonen mit einer ausreichenden Menge von 30% Danieaus Medium auf den Boden der Bildkammer.
2. Fügen Sie 200–300 l mit 1% niedrigschmelzender Agarose hinzu, um die anästhesierten Larven abzudecken. Da ein invertiertes konfokales Mikroskop verwendet wird, legen Sie den infizierten Bereich der Larven so nah wie möglich gegen die Glasrutsche.
3. Lassen Sie die Agarose auf Eis für 30-60 s erstarren. Tauchen Sie die Agarose mit 30% Danieaus enthalten0%02%–0,04% Tricain.
4. Stellen Sie die Larven mit einem konfokalen Laserscanmikroskop (Materialtabelle) auf.

7. Dissektion von Larval Zebrafisch Darm lebensfähig C. difficile

1. Isolieren Sie Magen-Darm-Trakte von Larven, um die bakterielle Belastung zu analysieren. Beginnen Sie mit der Einschlässung von Zebrafischlarven mit 0,4 % Tricain.
2. Den Zebrafisch kurz mit sterilem 1x PBS abspülen und auf eine frische Agaroseplatte geben.
3. Zerlegung von Zebrafischen
   1. Legen Sie eine Nadel in den Rückenstamm von Zebrafischlarven in der Nähe des Kopfes, um den Zebrafisch zu immobilisieren. Entfernen Sie den Kopf hinter den Kiemen mit einer Lanze.
   2. Setzen Sie die zweite Nadel in die Mitte des Rückenstamms ein. Setzen Sie die dritte Nadel in den Bauch des Zebrafisches und ziehen Sie den Darm aus der Körperhöhle.
      HINWEIS: Es ist äußerste Sorgfalt erforderlich, um den intakten Darm zu isolieren. Wenn es schwierig ist, dies zu tun, führen Sie zusätzliche Züge durch, um den Rest des Darms von den verbleibenden inneren Organen zu trennen.
   3. Verwenden Sie eine Mikroinjektionsnadel, um 10–15 Darm in ein 1,5 ml-Rohr zu übertragen, das 200 l steril mit 1x PBS enthält.
   4. Homogenisieren Sie den Darm mit einem Stößel, um das Gewebe zu stören und Homogenate vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass der Stößel den Boden des Rohres erreicht, um alle Eingeweide vollständig zu stören.
4. Inkubieren Sie die Homogenate in C. difficile Aufzuchtmedium, das D-Cycloserin und Cefoxitin enthält, mit oder ohne Taurocholat (TCA, ein Keimmittel von C. difficile sporen) in einer anaeroben Kammer.
5. Inkubieren Sie die Platte anaerob für 48 h bei 37 °C.
6. Verwenden Sie die Bakterienkultur für 16S rRNA-PCR.
   1. Setzen Sie eine Kolonie in 50 l_h2O aus und kochen Sie sie bei 95 °C für 15 min. Pellet die lysierten Ablagerungen durch Zentrifugation (14.000 U/min für 2 min bei RT) und verwenden Sie 2 l des Überstandes als Vorlage in 25 l PCR-Reaktion mit C. difficile-spezifischenPrimern (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
   2. Wenn Bakterien aus flüssiger Kultur verwendet werden, 1 ml Kultur ernten und einmal mit 1 ml PBS (14.000 Rpm für 2 min bei RT) waschen. Das Pellet in 100 l_h2O_dd wieder aufhängen und wie oben durchgeführt behandeln. Um die Bakterienkolonien weiter zu charakterisieren, streifen Sie auf einer BHIS- oder ChromID-Platte (Materialtabelle).

   

Ergebnisse

C. difficile ist streng anaerobe, aber das Chromophor von fluoreszierenden Proteinen erfordert in der Regel Sauerstoff zu reifen. Um dieses Problem zu überwinden, wurde ein fluoreszierender Farbstoff verwendet, um lebende C. difficile Zellen zu färben, die aktiv wuchsen (R20291, ein Ribotyp 027 Stamm; Abbildung 1A). Mit dem Gal4/UAS-System wurden stabile transgene Zebrafischlinien für die Live-Bildgebung erzeugt, bei denen die mpeg1.1- oder ...

Diskussion

Die vorgestellten Methoden modifizieren und erweitern einen bestehenden Ansatz zur Infektion von Zebrafischlarven durch Injektion und Mikrogavage^10,14. Es zeigt auch einen Ansatz zur Untersuchung anaerobe Krankheitserreger mit Zebrafischlarven²². Darüber hinaus erleichtert das Protokoll die Analyse angeborener Immunzellreaktionen in vivo nach CDI und nach Deronisation von C. difficile bei Zebrafischen. Die Methode ist reproduzier...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576	Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM)	Pronadisa	8050	It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial Stain	Thermo Fisher Scientific	B35001	Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion Broth	Carl Roth GmbH	X916.1
Brass (wild-type)			deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396
Capillary Glass	Harvard Apparatus	30-0019	Injection needles
Clostridioides difficile			R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	open-source platform		Image processing
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
Horizontal needle puller	Sutter instrument Inc	P-87
L-cysteine	Sigma-Aldrich	168149
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Image processing
Magnesium sulfate (MgSO4)	Carl Roth GmbH	P026
Micro injector	eppendorf	5253000017
Microinjection molds	Adaptive Science Tools	TU1
Leica SP8 confocal microscope	Leica
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P0290
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH	5346
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265
Taurocholate	Carl Roth GmbH	8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3			stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3			stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Yeast extract	BD Bacto	212750