클로스트리디오이드 디피실을 위한 애벌레 제브라피쉬 감염 모델 개발

요약

여기에 제시된 것은 미세 주입 및 비침습적 미세가브지에 의한 형광성 표지 혐기성 C. difficile로 얼룩말 유충을 감염하는 안전하고 효과적인 방법입니다.

초록

클로스트리디오이드 디피실 감염(CDI)은 미국에서 가장 흔한 의료 관련 위장 감염 중 하나로 간주됩니다. C. difficile에 대하여 타고난 면역 반응은 기술되었습니다, 그러나 CDI에 있는 호중구 및 대식세포의 정확한 역할은 보다 적게 이해됩니다. 현재 연구에서는, Danio rerio (zebrafish) 애벌레는 생체 내에서 이러한 선천적 면역 세포의 행동과 협력을 이미징하기 위한 C. difficile 감염 모델을 확립하는 데 사용됩니다. C. difficile을모니터링하기 위해 형광 염료를 사용하는 라벨링 프로토콜이 확립되었습니다. 국소화된 감염은 제브라피시 장관에서 활발하게 자라며 CDI의 장 상피 손상을 모방하는 C. difficile이라는 라벨이 붙은 마이크로주입에 의해 달성됩니다. 그러나, 이 직접적인 감염 프로토콜은 침략적이고 실험 결과에 영향을 미칠 수 있는 현미경 상처를 일으키는 원인이 됩니다. 따라서, 더 비침습적 마이크로게이지 프로토콜은 여기에 기술된다. 이 방법은 열린 입을 통해 삽관에 의해 제브라피시 유충의 장으로 직접 C. difficile 세포의 전달을 포함한다. 이 감염 방법은 C. difficile의자연 감염 경로를 밀접하게 모방합니다.

서문

C. difficile는 그람 양성, 포자 형성, 혐기성 및 위장관에서 의 심한 감염의 주요 원인인 독소 생성 간균^1. CDI의 전형적인 현상은 설사, 복부 고통 및 치명적인 pseudomembranous 대장염을 포함하고, 때때로 죽음으로 이끌어 낼 수 있습니다^1,2. 증거는 호스트 면역 반응이 이 질병의 진행 그리고 결과 둘 다에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다^3. 면역 반응 이외에, 토착 창자 microbiota는 CDI^4의개시 그리고 병인을 위해 결정적이다. 지난 10 년 동안, CDI의 케이스의 수와 사망률은 C. difficile (BI/NAP1/027)의 hypervirulent 긴장의 출현 때문에 현저하게 증가했습니다^5,6. 근본적인 면역 기계장치의 더 나은 이해 및 CDI 도중 microbiota의 역할은 이 전염병의 더 나은 통제를 가능하게 하는 새로운 치료 발달 및 어드밴스로 이끌어 낼 것입니다.

햄스터 및 마우스와 같은 몇몇 동물 모델은 C. difficile^7,8에대하여 면역 방어에 대한 통찰력을 제공하기 위하여 개발되었습니다. 그러나, 선천성 면역 세포의 역할은 여전히 제대로 이해되지 못하며, 특히 선천성 면역 세포 행동은 주로 조직학적 분석 또는 시험관 내 배양 세포로부터 유래되기 때문에. 따라서, 살아있는 척추동물 유기체의 내부 C. difficile에 대한 선천적인 면역 반응을 밝히기 위해 투명한 제브라피시 모델을 확립하는 것은 그러한 연구를 용이하게 할 것이다. Zebrafish 유충은 기능성 선천성 면역 계통을 가지고 있지만, 수정 후 4-6주까지 적응면역계가^{결여되어 있다 9.} 이 독특한 특징은 제브라피쉬 애벌레를 CDI에서 선천적인 면역 세포의 고립된 반응과 기능을 연구하는 훌륭한 모델로 만듭니다.

이 보고서는 대식세포와 호중구와 같은 C. difficile과 선천적인 면역 세포 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 제브라피쉬 애벌레를 사용하는 새로운 방법을 설명합니다. 첫째, C. difficile 접종 및 염색을 포함하는 국소화된 미세 주입 프로토콜이 제시된다. 생체 내 공초점 시간 경과 이미징을 사용하여 감염 부위를 향한 호중구 및 대식세포의 반응이 기록되고 호중구 및 대식세포에 의한 박테리아의 식세포가 관찰됩니다. 그러나, 주사 자체가 조직 손상을 일으키고^{박테리아(10)와}무관하게 백혈구의 모집을 유도하는 것으로 보고되었다. 따라서, 제브라피시 유충의 장으로 C. 디피실을 전달하는 비침습적 마이크로개지 프로토콜이 이어서 기술된다. 이전 연구는 토착 위장 미생물C. difficile의식민지에 대 한 호스트를 보호 하는 것을 입증^{했다 11.} 따라서, 그놈제브라피쉬 유충은 또한 ^12개의감염된 제브라피시를 걸리기 위해 사용된다. 그 후, 장 해부는 실행 가능한 C. difficile을 복구하고 제브라피시 장관에서 자신의 존재의 기간을 확인하기 위해 수행됩니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 동물 작업은 법적 규정(EU-지침 2010/63, 라이센스 AZ 325.1.53/56.1-TUBS 및 라이센스 AZ 33.9-42502-04-14/1418)에 따라 수행되었습니다.

1. 저융액 아가로즈, 젤 플레이트 및 미세 주입 /미세 가게이 지 바늘의 준비

1. 용해 0.08 g의 저용융 아가로즈(재료표,아가로즈 A2576) 10 mL의 30% 다니요 배지 (0.12 mM MgSO_4,0.18 mM Ca [NO₃]_2),0.21 mM KCl, 1.5 mM HEPES (pH = 7.2), 및 17.4 mM NaCl, 0.8 % 용액을 얻기 위해 실온 (RT)에 저장.
   참고: 아가로즈농도가 높거나 낮게 사용하실 수 있습니다. 그러나, 고형화 하는 데 필요한 시간은 아가로즈의 다른 브랜드에 대 한 변화, 심지어 동일한 농도에서.
2. 유리 모세 혈관에서 미세 주입 및 미세 가게이 바늘을 준비하십시오(재료 표).
   1. 다음 설정으로 마이크로파이펫 풀러를 사용하십시오 (단위는 여기에 사용되는 풀러에 특정합니다. 재료 표참조): 미세 사출 바늘 (공기 압력 = 500; 열 = 400; 당김 = 125; 속도 = 75; 시간 = 150); 및 마이크로 게이지 바늘 (공기 압력 = 500; 열 = 400; 당김 = 100; 속도 = 75; 시간 = 150). 마이크로 로더 팁을 사용하여 3 μL의 뉴클레아제 프리_{H2 O를}당겨진 바늘에 적재하십시오.
   2. 바늘을 인젝터에 넣고 제대로 고정하십시오. 주사에 적합한 각도로 바늘을 조정합니다. 사이 주입 압력을 설정 600-900 미세 주입 바늘에 대 한 hPa 와 200-300 위봉 바늘에 대 한 hPa.
   3. 교정 슬라이드의 검은 색 원에 미네랄 오일 한 방울을 놓습니다. 미세 한 집게를 사용 하 여 바늘의 끝을 잘라. 미네랄 오일에 한 방울을 주입하여 물방울의 크기를 측정하십시오.
   4. 미세 주입의 경우 주입 시간을 조정하여 0.10-0.12 mm의 물방울을 얻습니다.이 물방울은 0.5-1.0 nL의 부피와 같습니다. 마이크로 게이지의 경우 직경이 0.18-0.20 mm인 물방울을 구하면 3-5 nL의 부피와 같습니다.
3. 1.5% 아가로즈 플레이트를아가로즈(재료표,8050)로 10cm 페트리 접시에 30% 다니오의 배지에 마이크로가게이지 몰드로 플라스틱 몰드로 준비한다. 필요할 때까지 탈수하지 않도록 4°C에서 보관하십시오. 실험 전에 RT 또는 28°C로 따뜻하게 합니다.

2. 형광 염료로 C. 디피실 및 포자의 준비 및 라벨링

1. 형광 염료(재료 표)의1 mM 재고 용액을 준비합니다. 염료는 분말의 50 μg aliquots에서 판매되기 때문에, 1 mM의 재고 농도를 얻기 위하여 유리병에 DMSO의 69 μL를 추가합니다.
2. 1mMM 스톡 용액 의 2 μL을 원심분리튜브에 DMSO 18μL에 첨가하여 형광 염료의 100 μM 작동 용액을 준비하고 잘 혼합한다.
3. 배양 C. 디피실(R20291, 리보타입 027 균주)은 밤새 흔들리지 않고 혐기성 후드에서 플레이트로부터 2~3개의 콜로니와 함께 BHIS 액상 배지의 10 mL을 접종함으로써. BHIS는 0.5% (v) 효모 추출물과 0.1% (v) L-시스테인으로 보충된 BHI입니다. DdH₂O의 10 mL에 L-시스테인 1 g을 용해시키고 여과에 의해 살균한 다음, 오토클레이브 배지에 첨가하여 1 g/L. 플레이트의 최종 농도를 얻어 오토클레이브를 하기 전에 배지에 15 g/L 한천을 첨가하여 제조하였다. C. 디피실의 선택적 배합은 chromID C. 디피실 플레이트(물자표)를사용하여 수행된다.
4. 형광 염료로 염색 C. 디피실
   1. 수확 C. 1.0-1.2의 OD_600에서 difficile 및 1x PBS의 1 mL로 1 x 세척 (RT에서 3 분 동안 5,000 x g). 1 x PBS의 1 mL에서 다시 일시 중단합니다.
   2. 형광 염료의 작동 용액 3 μL을 박테리아 현탁액 1 mL에 추가합니다. 어둠 속에서 RT에서 15 분 동안 샘플을 배양하십시오. 염색된 C. difficile을 1 mL PBS로 한 번 세척하여 잔류 염료를 제거하고 1.0의 OD_600으로 1x PBS에서 다시 일시 중단합니다(1.0 OD_600은 대략 10⁸ cfu/mL에 해당합니다).

3. 얼룩말 물고기 애벌레에 스테인드 C. difficile의 주입

1. 20-30 제브라피시 유충을 5일 후 수정 후(5 dpf라고 함)에서 0.02%-0.04% 트리카인(트리카인 분말을 이중 증류수에 용해하고 pH =7로 조정)을 30% Danieau's medium에 30% 사출. 마취된 애벌레를 신선한 10cm 페트리 접시로 옮기고 다니오의 배지를 30% 이상 제거합니다.
2. 제브라피시 유충에 0.8% 낮은 용융 아가로스를 떨어뜨려 덮습니다. 애벌레를 측면 위치로 부드럽게 조정합니다. 페트리 접시를 얼음 위에 30-60초 동안 놓아 서 녹는 아가로즈가 굳어지도록 합니다. 아가로즈를 덮기 위해 0.02%-0.04%의 트리카인을 함유한 30% 다니요 배지를 첨가합니다.
3. 사출 용액을 준비합니다. 주사 과정을 시각화하기 위해 염료 염색 C. difficile 접종의 9 μL에 PBS 용액에 0.5 % 페놀 적색의 1 μL을 추가합니다.
4. 마이크로 로더를 사용하여 주입 용액으로 교정 된 미세 주입 바늘을로드하십시오. 로드된 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하고 입체 현미경 아래에 놓습니다.
5. 600-900 hPa 사이의 사출 압력을 조정합니다. 주사 시간을 0.1-0.3s로 설정하여 0.5-1.0 nL를 얻습니다. 미소매니터의 바늘을 내장된 애벌레를 가리키는 ~45° 각도로 설정합니다.
6. 바늘 끝을 비뇨 생식기 기공 에 가까운 위장관 위에 놓습니다. 아가로스를 통해 다음 바늘 끝으로 근육을 관통, 다음 장 내강구에 삽입 하 고 주입 0.5-1.0 C. difficile의nL. 형광 현미경을 사용하여 주입된 유충을 모니터링하고 공초점 이미징을 위해 적절하게 주입된 유충을 픽업합니다.

4. 노토바이오틱제지브라피쉬 유충의 생성

1. 잘 확립 된 자연 사육 방법을 사용하여 노토 바이오 틱 얼룩말 배아를 생성하고, 포함: 시험관 내 수정, 항생제 함유 배지 (1 μg / mL 암포테리신 B, 10 μg / mL 카나마이신 및 20 μg / mL ampicillin), 0.1 % wt / vol 폴리 비닐 피롤리돈 - 요오드 (PVP-I) 용액으로 세척, 및 배아배양¹2 배양 배양
2. 모든 그놈 제브라피쉬 유충을 5 dpf 까지 또는 육계 직전까지 그놈바이오틱 조건하에서 유지하십시오. 게이지 후, 제브라피시 유충은 표준 인큐베이터로 옮겨지지만 멸균 된 30 % 다니오 의 배지.

5. 게브라피시 애벌레의 가가지

1. 1.2단계에서 기재된 바와 같이 마이크로게이지 바늘을 교정한다.
2. 바늘을 미네랄 오일 한 방울로 교정 슬라이드에 배치하여 바늘 끝의 직경을 측정합니다. 팁의 직경이 30-40 μm이고, 무딘, 매끄러운지 확인하십시오. 날카롭거나 거친 바늘을 버리십시오.
   참고 : 바늘의 날카로운 가장자리는 빠른 불타는에 의해 무딘 될 수 있습니다.
3. 3.3단계에서 설명한 대로 게이지 용액을 준비한다.
4. 3.4단계에서 설명한 바와 같이 바늘을 미세조작기 위에 적재하고 장착한다. 마이크로 조작기를 조정하여 바늘을 45° 각도로 배치합니다.
5. 3.1단계에서 언급된 제브라피쉬 유충을 마취한다. 유충이 움직이지 않을 때, 파스퇴르 피펫을 사용하여 마이크로 게이지 몰드의 홈으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 메우게 한다
6. 제브라피시 유충에 0.8% 낮은 용융 아가로스를 떨어뜨려 덮습니다. 홈의 45° 각도에서 머리를 똑바로 향하게 하고 홈 벽에 꼬리를 대고 애벌레를 부드럽게 조정합니다. 머리의 각도가 거의 동일한지 확인하여 게이지 바늘의 각도와 정렬되도록 하십시오. 30-60 s에 대 한 얼음에 microgavage 금형을 배치, 낮은 용융 agarose 고응화 하기 위해 유충의 위치를 안정화 하기 위해.
7. 200-300 hPa 사이의 사출 압력을 조정합니다. C. 디피실의 3-5 nL의 주입 체적을 얻기 위해 주사 시간을 0.1-0.3 s로 설정합니다.
8. 부드럽게 아가로즈를 통해 바늘을 조작 한 다음 제브라피시 유충의 입으로, 식도를 통해. 바늘의 끝이 전방 장 전구 안쪽에 있으면, 박테리아를 풀어 놓기 위하여 주입 페달을 누릅니다. 전달 된 볼륨으로 장의 내강을 채웁니다. 식도 나 클로아카에서 넘치게하지 마십시오. 제브라피시 입에서 바늘을 부드럽게 꺼냅니다.
9. 위관에 따라, 먼저 애벌레를 들어 올려 아가로스를 절단하여 유연한 마이크로 로더 팁으로 아가로즈에서 감염된 제브라피시 유충을 구출합니다. 이 애벌레를 멸균 된 30 % 다니오 배지로 옮김. 애벌레를 멸균 배지로 두 번 헹구는다. 애벌레를 신선한 10cm 페트리 접시로 옮김. 애벌레는 최대 11 dpf까지 유지될 것이다.

6. 주입된 제브라피시 유충의 공초점 현미경 분석

1. 제브라피쉬 유충을 마취시키는 것은 3.1단계를 지칭한다. 이미징 챔버라고 도는 구멍에 부착 된 유리 슬라이드와 35mm 페트리 접시의 바닥에 구멍을 확인합니다. 30% Danieau의 배지의 적당한 양으로 화상 진찰 실의 바닥에 배아를 전송하십시오.
2. 마취 된 애벌레를 덮기 위해 1 % 낮은 용융 아가로스의 200-300 μL을 추가하십시오. 거꾸로 된 공초점 현미경이 사용되기 때문에, 유리 슬라이드에 대해 애벌레의 감염된 부위를 가능한 한 가깝게 놓습니다.
3. 아가로즈가 얼음위에 굳어지게 하면 30~60초동안 아가로즈를 30% 다니요의 0.02%-0.04%의 트리카인으로 담그게 한다.
4. 유충을 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로이미지(재료 표).

7. 가능한 C. difficile를 복구 하기 위해 애벌레 얼룩말 창 자의 해 부

1. 세균 부하를 분석 하기 위해 애벌레에서 위장을 분리. 먼저 제브라피쉬 유충을 0.4% 트리카인으로 안락사시합니다.
2. 제브라피쉬를 멸균 된 1 x PBS로 간략하게 헹구고 신선한 아가로즈 접시로 옮김하십시오.
3. 제브라피시 해부
   1. 제브라피시 유충의 등지트렁크에 바늘을 머리에 삽입하여 제브라피시를 고정시되이 시다. 랜싯으로 아가미 뒤의 머리를 제거합니다.
   2. 등도 트렁크의 중간에 두 번째 바늘을 삽입합니다. 제브라피시의 복부에 세 번째 바늘을 삽입하고 몸 구멍에서 내장을 당깁니다.
      참고: 손상되지 않은 내장을 분리하려면 극도의 주의가 필요합니다. 그렇게하기 어려운 경우, 나머지 내부 장기에서 장의 나머지 부분을 분리하기 위해 추가 당김을 수행하십시오.
   3. 미세 주입 바늘을 사용하여 10-15 개의 내장을 1x PBS의 200 μL 멸균을 포함하는 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김.
   4. 조직을 방해하고 균질제를 준비하는 유봉으로 내장을 균질화하십시오. 유봉이 튜브의 바닥에 도달하여 모든 창자를 완전히 방해하도록하십시오.
4. 혐기성 챔버에서 타우로콜레이트(TCA, C. difficile 포자의 발아제)의 유무에 관계없이 D-시클로딘 및 세폭시틴을 함유하는 C. difficile 사육 배지에서 균질화를 배양한다.
5. 37 °C에서 48 시간 동안 혐기성 플레이트를 배양합니다.
6. 16S rRNA-PCR에 대 한 박테리아 배양을 사용 합니다.
   1. H₂O의 50 μL에서 식민지를 다시 중단하고 95 °C에서 15 분 동안 끓입니다. 원심분리(RT에서 2분 동안 14,000rpm)에 의한 용해 된 파편을 펠렛하고 C. difficile-특정프라이머 (Cdiff16Sfw : 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3')를 사용하여 PCR 반응의 25 μL에서 템플릿으로 상급물질의 2 μL을 사용합니다. Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
   2. 액체 배양균을 사용할 때, 배양 1 mL을 수확하고 1 mL의 PBS (RT에서 2 분 동안 14,000 rpm)로 한 번 씻으하십시오. H2_Odd의 100 μL에서 펠릿을 다시 중단하고 위에서 수행한 것처럼 취급한다. 세균 성 콜로니를 더욱 특성화하기 위해 BHIS- 또는 크로미드 플레이트(재료 표)에줄무늬를 지정합니다.

   

결과

C. difficile는 엄격하게 혐기성입니다, 그러나 형광성 단백질의 발색단은 일반적으로 성숙하기 위하여 산소를 요구합니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 형광염료를 활발히 성장시킨 살아있는 C. 디피실 세포를 염색하는 데 사용되었다(R20291, 리보형 027 균주; 그림 1A). Gal4/UAS 시스템을 사용하여, mpeg1.1 또는 lyZ 프로모터가 Gal4 의존적 ?...

토론

제시된 방법은 주사 및 마이크로게이지^10,14를모두 수행함으로써 제브라피시 유충을 감염시키기 위한 기존의 접근법을 수정하고 확장한다. 또한 제브라피시 유충^22를사용하여 혐기성 병원체를 연구하는 접근법을 입증한다. 또한, 이 프로토콜은 CDI시 및 제브라피시에서 C. 디피실의 식민지화 시 생체 내 선천성 면역 세포 반응의 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576	Ultra-low gelling agarose
Agarose low-melting (LM)	Pronadisa	8050	It is used in agarose plates
BacLight Red Bacterial Stain	Thermo Fisher Scientific	B35001	Fluorescent dye
Brain-Heart-Infusion Broth	Carl Roth GmbH	X916.1
Brass (wild-type)			deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines
Calcium nitrate (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396
Capillary Glass	Harvard Apparatus	30-0019	Injection needles
Clostridioides difficile			R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	open-source platform		Image processing
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
Horizontal needle puller	Sutter instrument Inc	P-87
L-cysteine	Sigma-Aldrich	168149
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Image processing
Magnesium sulfate (MgSO4)	Carl Roth GmbH	P026
Micro injector	eppendorf	5253000017
Microinjection molds	Adaptive Science Tools	TU1
Leica SP8 confocal microscope	Leica
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P0290
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH	5346
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265
Taurocholate	Carl Roth GmbH	8149
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3			stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3			stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Yeast extract	BD Bacto	212750