Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

البروتوكول الحالي يضع طريقة صارمة وقابلة للاستنساخ للقياس الكمي للتغيرات المفصلية المورفولوجية التي تصاحب هشاشة العظام. تطبيق هذا البروتوكول يمكن أن تكون ذات قيمة في رصد تطور المرض وتقييم التدخلات العلاجية في هشاشة العظام.

Abstract

واحدة من اضطرابات المفاصل الأكثر انتشارا في الولايات المتحدة, هشاشة العظام (OA) يتميز انحطاط التدريجي من الغضروف المفصلي, في المقام الأول في مفاصل الورك والركبة, مما يؤدي إلى آثار كبيرة على تنقل المريض ونوعية الحياة. حتى الآن، لا توجد علاجات علاجية موجودة لOA قادرة على إبطاء أو منع انحطاط الغضاريف. في الوقت الحاضر ، هناك مجموعة واسعة من الأبحاث الجارية لفهم علم الأمراض OA واكتشاف النهج العلاجية الجديدة أو العوامل التي يمكن أن تبطئ بكفاءة ، ووقف ، أو حتى عكس OA. وبالتالي ، من الأهمية بمكان أن يكون هناك نهج كمي وقابل للتكرار لتقييم التغيرات المرضية المرتبطة بـ OA بدقة في غضروف المفاصل ، وعظم السينونوف ، والعظم تحت الشبون. حاليا، يتم تقييم شدة OA والتقدم في المقام الأول باستخدام جمعية أبحاث هشاشة العظام الدولية (OARSI) أو أنظمة التهديف مانكين. على الرغم من أهمية أنظمة التسجيل هذه ، فهي شبه كمية ويمكن أن تتأثر بذاتية المستخدم. والأهم من ذلك، أنها تفشل في تقييم دقيق، ولكن المهم، التغيرات في الغضاريف خلال حالات المرض في وقت مبكر أو مراحل العلاج المبكر. يستخدم البروتوكول الذي نصفه هنا نظام برمجيات النسيجية المحوسبة وشبه الآلية لإنشاء منهجية كمية موحدة وصارمة وقابلة للاستنساخ لتقييم التغييرات المشتركة في OA. يقدم هذا البروتوكول إضافة قوية إلى الأنظمة الحالية ويسمح بالكشف بشكل أكثر كفاءة عن التغيرات المرضية في المفصل.

Introduction

واحدة من اضطرابات المفاصل الأكثر انتشارا في الولايات المتحدة, يتميز OA من الانحطاط التدريجي للغضروف المفصلي, في المقام الأول في مفاصل الورك والركبة, مما يؤدي إلى آثار كبيرة على تنقل المريض ونوعية الحياة1,2,3. الغضروف المفصلي هو النسيج الضام المتخصص للمفاصل اليوميات مصممة لتقليل الاحتكاك، وتسهيل الحركة، وتحمل ضغط مشترك4. يتكون الغضروف المفصلي من مكونين أساسيين: chondrocytes ومصفوفة خارج الخلية. Chondrocytes هي المتخصصة، والخلايا النشطة استقلابيا التي تلعب دورا أساسيا في تطوير وصيانة وإصلاح المصفوفة خارج الخلية4. تضخم Chondrocyte (CH) هي واحدة من العلامات المرضية الرئيسية لتطوير OA. ويتميز بزيادة حجم الخلوية، وانخفاض إنتاج بروتيجليكان، وزيادة إنتاج الغضروف مصفوفة الانزيمات المهينة التي تؤدي في نهاية المطاف إلى انحطاط الغضاريف5،6،7. وعلاوة على ذلك، التغيرات المرضية في العظام تحت الشوندري وsynovium من المفصل تلعب دورا هاما في التنمية OA والتقدم8،9،10،11،12. حتى الآن، لا توجد علاجات علاجية موجودة تمنع انحطاط الغضاريف1،,2،,3،,13،,14. وبالتالي ، هناك أبحاث مستمرة واسعة النطاق تهدف إلى فهم علم الأمراض OA واكتشاف النهج العلاجية الجديدة التي هي قادرة على إبطاء أو حتى وقف OA. وبناءعلى ذلك ، هناك حاجة متزايدة إلى نهج كمي واستنساخي يتيح التقييم الدقيق للتغيرات المرضية المرتبطة بـ OA في الغضروف والسينوفيوم والعظام تحت الشبكفية.

حاليا، يتم تقييم شدة OA والتقدم في المقام الأول باستخدام OARSI أو مانكين سجل النظم15. ومع ذلك ، فإن أنظمة التسجيل هذه هي شبه كمية فقط ويمكن أن تتأثر بذاتية المستخدم. والأهم من ذلك، أنها تفشل في تقييم دقيق التغيرات الطفيفة التي تحدث في المفصل أثناء المرض أو استجابة للتلاعب الجيني أو التدخل العلاجي. هناك تقارير متفرقة في الأدب تصف التحليلات الهستومومترية للغضروف، السينوفيديوم، أو العظام تحت التشبوندرية16،17، 18،,1919،20،21. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص في بروتوكول مفصل لإجراء تحليل دقيق واستنساخ يُستنسخ من كل هذه المكونات المشتركة، مما يخلق حاجة غير ملباة في الميدان.

لدراسة التغيرات المرضية في OA باستخدام التحليل الهسي، استخدمنا نموذج الماوس OA الجراحية للحث OA عن طريق زعزعة استقرار الغضروف المفصلي (DMM). من بين النماذج الراسخة من المورين OA ، تم اختيار DMM لدراستنا لأنه ينطوي على آلية أقل صدمة للإصابة22،23،24،25،26. بالمقارنة مع إصابة الأربطة الغضدية (MLI) أو إصابة الرباط الصليبي الأمامي (ACLI) العمليات الجراحية ، تشجع DMM على تقدم أكثر تدريجيًا لـ OA ، على غرار تطور OA في البشر22،24،25،26. تم قتل الفئران بعد اثني عشر أسبوعا من جراحة DMM لتقييم التغيرات في الغضروف المفصلي، والعظام تحت الجلد، والسروفيوم.

والهدف من هذا البروتوكول هو وضع نهج موحد وصارم وكمية لتقييم التغييرات المشتركة المصاحبة لتقييم التقييمات.

Protocol

تم شراء الفئران C57BL/6 الذكور البالغ من العمر اثني عشر أسبوعًا من مختبرات جاكس. تم إيواء جميع الفئران في مجموعات من 3-5 فئران لكل قفص معزول صغير في غرفة مع جدول زمني 12 ساعة ضوء / الظلام. تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقًا لدليل المعهد الوطني للصحة (NIH) لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة ولاية بنسلفانيا.

1. ما بعد الصدمة هشاشة العظام (PTOA) نموذج الجراحية

  1. تُسَخُّر الفئران باستخدام الكيتامين (100 ملغم/كغ)/xylazine (10 ملغم/كغ) عبر الحقن داخل البيرينيتونية، وإدارة البوبرينورفين (1 ملغم/كغ) عن طريق الحقن داخل البيريمنية لتخفيف الألم، وحلاقة الشعر فوق الركبة. تحقق من عدم وجود منعكس دواسة قبل بدء الجراحة.
  2. إجراء زعزعة الاستقرار في جراحة الغضروف المفصلي (DMM) كما وصفت سابقا22,23.
    ملاحظة: يرجى الرجوع إلى جلاسون وآخرون وسينغ وآخرون للحصول على معلومات بروتوكول جراحي أكثر تفصيلاً22،,23.
    1. قم بإجراء شق طولي بطول 3 مم من الرضفة القاصية إلى هضبة الساق القريبة من مفصل الركبة اليمنى. استخدام خياطة لإزاحة وتر الرضفة.
    2. فتح الكبسولة المشتركة الوسطي إلى وتر وتحريك وسادة الدهون infrapatellar لتصور منطقة intercondylar، الغضروف المفصلي الوسطي، والرباط الغضروفي23.
    3. Transect الرباط الوسطي ليكمل DMM وزعزعة الاستقرار المشتركة22,23. أغلق موقع الشق بالدبابيس أو الغرز.
  3. إجراء عمليات جراحية صورية بعد إجراء مماثل، ولكن دون استئصال الرباط المنسي الوسطي.
    ملاحظة: تم عشوائية الفئران لتلقي إما DMM أو جراحة صورية. وفقا للأدب نشرت سابقا, الفئران تطوير PTOA كبيرة 12 أسابيع بعد جراحة DMM22,23,24.

2. القتل الرحيم الماوس وجمع العينة

  1. القتل الرحيم للفأرة
    1. بعد اثني عشر أسبوعا من DMM، وحقن الفئران باستخدام الكيتامين (100 ملغ / كغ) / xylazine (10 ملغ / كغ) مزيج عن طريق الحقن داخل perperitoneal.
    2. إجراء شق خط الوسط من خلال الجلد على طول الصدر وتراجع القفص الصدري لفضح القلب لالتثبيت التهوى27.
      ملاحظة: راجع مرجع غيج وآخرون للحصول على معلومات إضافية حول بروتوكول تثبيت القوارض المناسبة وكذلك تصوير الفيديو لتجميع المعدات المناسبة والإجراءات27.
    3. إعداد جهاز التروية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    4. القتل الرحيم للفأرة عن طريق تبرّر الهيبارين المالحة عبر البطين الأيسر حتى يتم مسح الدم ويصبح الكبد شاحباً. Perfuse الماوس مع 10٪ محايدة مؤقتا formalin حتى يتم تحقيق تثبيت الماوس كاملة.
      ملاحظة: الماوس perالتير بنجاح سوف تصبح قاسية. متوسط وقت التروية باستخدام نظام المضخة الآلي هو 5-7 دقيقة.
  2. جمع العينات وإعدادها
    1. عزل الركبتين عن طريق قطع العظام في منتصف عظم الفخذ ومنتصف الساق وتشريح الأنسجة العضلية المحيطة بها.
    2. مواصلة التثبيت عن طريق تخزين مفاصل الركبة في 10٪ محايدة مؤقتا formalin في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة، ثم في 4 درجة مئوية لمدة 6 أيام.
    3. Decalcify العظام عن طريق تخزين العينة في EDTA العازلة إزالة الكسالة لمدة 1 أسبوع في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز خفيف28. تغيير حل المخزن المؤقت التنكس كل 3 أيام.
      ملاحظة: تم إعداد عازل إزالة الكسالات عن طريق إذابة 140 غرام من رباعي الصوديوم EDTA فائق النقاء في محلول 850 مل من الماء المقطر بالإضافة إلى 15 مل من حمض الخليك الجليدي. وكان الحاجز درجة الحموضة المعادلة إلى 7.6 عن طريق إضافة dropwise من حمض الخليك الجليدي إلى الحل. عند الوصول إلى درجة الحموضة = 7.6 ، تم إحضار المخزن المؤقت إلى 1 لتر من الحجم الإجمالي مع الماء المقطر. تم إعداد عازل إزالة الكسبالة الطازج ة واستخدامها في غضون أسبوع واحد من التحضير.
    4. غسل الركبتين مع الإيثانول 50٪، ثم 70٪ الإيثانول لمدة 15 دقيقة لكل منهما، ثم عملية لتضمين.
      ملاحظة: تم تنفيذ معالجة نقل السوائل من قبل النواة الجزيئية وعلم الأمراض الهيستوم في مركز ميلتون S. Hershey الطبي في ولاية بنسلفانيا. استشر نواة علم الأنسجة في المؤسسة للحصول على توصيات حول معالجة العينات المثلى.
    5. تضمين الركبتين الماوس في البارافين مع الجانب الأوساط ية من المفصل التي تواجه السطح السفلي للكتلة البارافين. تطبيق ضغط طفيف على الجانب الساقي من المفصل أثناء التضمين لضمان الأسطح الظنجية والفخذ هي أقرب إلى نفس الطائرة ممكن.

3. Microtome أقسام واختيار الشرائح

  1. المقاطع الميكروتومية
    1. استخدام مقابض ضبط الطائرة على حامل كتلة microtome لضمان مواجهة السليم للكتلة عينة.
    2. مواجهة كتلة البارافين بحيث يظهر الجانب القاصي من عظم الفخذ ، والمنطقة القريبة من الساق ، والقرون الأمامية والخلفية للغضروف المفصلي الوسطي في نفس المستوى لجمع القسم(الشكل التكميلي 1A). ابدأ في جمع المقاطع على الشرائح عندما تبدأ القرون الأمامية والخلفية للغضروف المفصلي الوسطي في الانفصال عن بعضها البعض.
    3. تأكد من ظهور الساق وعظم الفخذ والمنيسي في نفس المستوى من خلال مقارنة أحجام البنية. يجب أن يكون عظم الساق وعظم الفخذ من حجم مماثل ، مع كل من القرون المنسية مماثلة في الحجم والشكل(الشكل التكميلي 1A). إذا كان الهيكل يبدو كبيرًا جدًا بالمقارنة مع نظيره، فهذا يشير إلى الحاجة إلى مواجهة إضافية. الأهم من ذلك، تأكد من أن الفضاء المشترك لا يزال سليما.
    4. خذ أقسام الغَبَاق من الرّجَة المُضمّنة من الراكِضات البارافين من خلال حجرة المفصل الوسطي في أقسام 5 ميكرومتر، واجمع الأقسام على الشرائح. جمع ما يقرب من 30 أقسام لكل كتلة البارافين.
  2. تحديد الشريحة
    1. حدد ثلاثة أقسام تمثيلية بفارق 50 ميكرومتر لكل عينة بدءًا من القسم الخامس (أي الشرائح 5 و15 و25). سيتم استخدام الشرائح المختارة للتلطيخ اللاحق ، وتسجيل OARSI ، وتحليل الهستومورفومتر.
      ملاحظة: من كتلة مع 30 مقطعًا إجماليًا، حدد الشرائح من البداية (الشرائح 5-10)، والوسطى (الشرائح 15-20)، ونهاية (الشرائح 25-30) من المجموعة من أجل تمثيل العينة بأكملها بوضوح. حدد الشرائح من مستويات مماثلة من العمق بين العينات.

4. الهيماتوكسيلين، سافرانين أورانج، وتلطيخ الأخضر السريع

  1. Deparaffinize الشرائح المحددة مع ثلاثة تغييرات من الزيلين. هيدرات الشرائح مع تغييرين من الإيثانول 100٪، تغييرين من الإيثانول 95٪، وتغيير واحد من الإيثانول 70٪.
  2. وصمال الشرائح بالهيماتوسكلين لمدة 7 دقيقة ثم اغسل بالماء الجاري لمدة 10 دقيقة. وصمة عار مع الأخضر السريع لمدة 3 دقيقة وشطفها في 1.0% حمض الخليك الجليدي لمدة 10 s. Stain مع سافرانين-O لمدة 5 دقيقة وشطفها بسرعة عن طريق غمس حمض الخليك الجليدي بنسبة 0.5%.
  3. شطف الشرائح في تغييرين من الماء المقطر والسماح للهواء الجاف.
  4. مسح الشرائح في ثلاثة تغييرات من الزيلين لمدة 5 دقيقة كل ثم جبل مع وسائل الإعلام تصاعد القائم على xylene وcoverslip.
    ملاحظة: الهيماتوكسيلين بمثابة وصمة عار نووية لتحديد مناطق نخاع العظام. يستخدم سافرانين-O لتلطيخ الغضروف، البروتوغليكان، الموسين، وحبيبات الخلايا الصاري. يستخدم سريع الأخضر كمضاد للعظام.

5. تصوير الشرائح

  1. صور الشرائح الملطخة Safranin-O وFast Green باستخدام كاميرا متوفرة متصلة بالمجهر وبرامج التصوير المستندة إلى الكمبيوتر.
  2. فتح برنامج التصوير (انظر جدول المواد)وترتيب منطقة مفصل الركبة ذات الاهتمام (ROI) في وسط نافذة التصوير. إذا كنت تستخدم مرحلة شريحة المجهر الدوراني، فقم بمحاذاة الشريحة بحيث يمتد سطح الساق على عرض المحور الأفقي لمنطقة التصوير.
  3. تعيين توازن اللون الأبيض للكاميرا قبل البدء في تصوير مجموعة من العينات(الشكل التكميلي 2). صورة المقصورة المشتركة في كل من التكبير 4x و 10x، وضمان أن يتم تضمين كل من سطح عظم الساق والفخذ المفصلي وعظم تحت الظني داخل كل من صور ROIs(الشكل التكميلي 1A، B). حفظ الصور لكل من المستويات الثلاثة المحددة لاستخدامها في تسجيل OARSI.
    ملاحظة: سيعتمد تعيين توازن اللون الأبيض للكاميرا على أنظمة البرامج والكاميرا المستخدمة. بشكل عام، انتقل إلى علامة التبويب الكاميرا أو قائمة التصوير الرئيسية ومرر لأسفل لتعيين توازن اللون الأبيض. حدد تعيين توازن اللون الأبيض وينبغي أن يظهر مؤشر صغير أو رمز(الشكل التكميلي 2A). باستخدام المؤشر، حدد منطقة داخل الصورة/العينة خالية من البقع، مثل مساحة المفصل، لتعيين توازن اللون الأبيض.

6. هشاشة العظام جمعية البحوث الدولية (OARSI) سجل15

  1. عشوائية الشرائح الثلاثة المختارة سافرانين-O والأخضر السريع الملون من جميع العينات.
  2. أداء OARSI سجل بطريقة عمياء مع ثلاثة مراقبين. لفترة وجيزة، عرض صورة واحدة في وقت واحد في ترتيب عشوائي والسماح لثلاثة مراقبين لتسجيل كل صورة، وربط إلى واحد من المستويات الثلاثة المحددة لكل عينة.
    ملاحظة: يرجى الرجوع إلى جدول تسجيل OARSI للحصول على أوصاف تفصيلية لجدول التقدير15.
  3. حساب متوسط النقاط لكل قسم باستخدام درجات فردية من كل مراقب. تحديد متوسط درجة لكل عينة عن طريق أخذ متوسط درجة الأقسام التمثيلية الثلاثة.

7- التحليل الهيسمورفومتري

ملاحظة: يتم عرض صور حية لمفصل الركبة على شاشة تعمل باللمس باستخدام كاميرا المجهر، ويتم استخدام قلم لتتبع ROIs يدويًا. تقوم الخوارزميات المدمجة لبرنامج قياس الهيستومومتر بتحديد المعلمات المحددة (انظر البروتوكول أدناه) في ROIs المحددة. الأهم من ذلك، يتم استخدام نفس Safranin-O وأقسام ملونة سريعة الخضراء المستخدمة في تسجيل OARSI لتحليل الهستورفومتر.

  1. إعداد البرامج وإعداد القياس
    1. قم بتشغيل المجهر والكاميرا والكمبيوتر وشاشة اللمس. انقر على أيقونة البرنامج لإطلاق البرنامج. ضع الشريحة على مرحلة المجهر للعرض.
    2. مركز العينة داخل إطار القياس. تأكد من تعيين شبكة القياس إلى التكبير المناسب لمطابقة الهدف المستخدم على المجهر(الشكل التكميلي 3).
    3. انتقل إلى علامة التبويب "الملف" في أعلى الشاشة ومرر لأسفل إلى قراءة الإعدادات. افتح إطار الإعدادات وحدد ملف الإعدادات المناسبة للمعلمات المراد قياسها.
    4. حدد المعلمة التي سيتم قياسها من القائمة على الجانب الأيمن من الشاشة(الشكل التكميلي 3). استخدم المؤشر القلمي أو الماوس لتتبع الصور وفقًا للخطوات الموضحة أدناه من أجل قياس ROIs نسيجي محدد. عند الانتهاء من كل قياس، انقر على اليمين لإنهاء القياس والاستمرار في المعلمة التالية.
      ملاحظة: يتم إنشاء قائمة المعلمات التي سيتم قياسها من خلال ملف تفضيل متميز يتم إعداده بالتشاور مع شركة البرامج بغرض قياس ROIs الموصوفة. يرجى الاطلاع على المناقشة لمزيد من التفاصيل حول الإعداد الكامل.
    5. أكمل جميع القياسات ثم انتقل إلى علامة التبويب بيانات الملخص في الجزء السفلي من شاشة البرنامج(الشكل التكميلي 3). انقر على نافذة الشاشة، اضغط على مفتاح إدراج على لوحة المفاتيح أو نسخ البيانات ولصقها في جدول بيانات منفصل.
      ملاحظة: إجراء تحليل الهستومومتر بطريقة عشوائية وعمياء. بعد الانتهاء من جميع قياسات المعلمة لجميع العينات، قم بتنظيم البيانات ومتوسط القياسات من الشرائح الثلاث من كل عينة.
  2. قياسات مناطق الغضاريف الكلية والكلسية وغير المعكلة
    ملاحظة: استخدم برنامج متوفر تجاريًا (راجع جدول المواد)لتنفيذ هذه الخطوات. يرجى الاطلاع على الشكل التكميلي 1B،C للتوضيح حول مناطق الغضاريف ، والتقاطعات ، ومناطق العظام تحت الشوندرام التي تمت مناقشتها في جميع أنحاء هذا القسم.
    1. رسم خط عبر الحافة المتفوقة من سطح غضروف الساق حيث يلتقي الغضروف الفضاء المشترك. رسم خط ثان عند تقاطع شوندرو سوسيوس حيث يلتقي الغضروف المتكلس بالعظم تحت التشوندرية(الشكل 1B). استخدام وظيفة منطقة البرنامج للحصول تلقائيا على قياس منطقة الغضاريف الإجمالية.
    2. رسم خط على طول علامة المد والجزر، وهو خط يحدث بشكل طبيعي يفصل بين المناطق المتكلسة وغير calcified من الغضاريف. رسم خط ثان عند تقاطع شوندرو سوسيوس حيث يلتقي الغضروف المتكلس بالعظم تحت التشوندرية(الشكل 1B). استخدام وظيفة منطقة البرنامج للحصول تلقائيا على قياس منطقة الغضاريف متكلس.
    3. حساب منطقة الغضاريف غير calcified عن طريق طرح منطقة الغضاريف المتكلسة من منطقة الغضاريف الإجمالية(الشكل 1B).
  3. تحديد عدد chondrocyte والنمط الظاهري
    1. إنشاء وظائف عد منفصلة داخل الإعدادات في برنامج قياس الأنسجة للتمييز بين إنتاج المصفوفة والمصفوفة غير المنتجة chondrocytes(الشكل 1B).
    2. تحديد عدد المصفوفات المنتجة أو التي لا تنتج chondrocytes باستخدام القلم لجعل نقطة صغيرة على كل chondrocyte التعبير عن النمط الظاهري المحدد(الشكل 1B).
      ملاحظة: عد الخلايا وفقا لنوع الظاهري ة إما مصفوفة المنتجة (أي Safranin-O تلطيخ قوية) أو مصفوفة غير المنتجة (أي خافت جدا أو لا Safranin-O تلطيخ).
  4. قياس محيط سطح المفصلي الظنبي
    1. قياس محيط سطح المفصلي الظني المطلق عن طريق تتبع خط عبر سطح غضروف الظني ، وتحديد الرجفان الفردية بعناية(الشكل 1C).
    2. رسم خط ثان على طول علامة المد لتكون بمثابة رقابة داخلية للطائرة من كل قسم(الشكل 1C).
    3. احسب مؤشر الرجفان السطحي المفصلي للزعب عن طريق تقسيم محيط سطح المفصلي الظنبي على محيط علامة المد.
      ملاحظة: محيط Tidemark عموما متساوية عبر العينات، وبالتالي فإن الفرق في محيط السطح المفصلي بين صور وDMM كان عموما صغيرة سواء تم استخدام محيط مطلق أو مؤشر الرجفان.
  5. قياس مناطق فضاء العظام والنخاع تحت الشبك
    1. قياس مساحة النخاع تحت النخاع باستخدام وظيفة المنطقة من خلال تحديد المناطق في المنطقة تحت الشمشية الملطخة بالهيماتوكسيلين فقط (أي سلبية للأخضر السريع) لتحديد إجمالي مساحة النخاع داخل العظام تحت الشمش. رسم خطوط حول محيط هذه المناطق لتحديد المساحة الإجمالية لجميع مساحة النخاع داخل عظم القبة(الشكل 2B).
    2. قياس إجمالي المنطقة تحت الشوندرية باستخدام وظيفة المنطقة عن طريق تحديد المنطقة بين تقاطع شوندرو osseous والحدود العليا للوحة النمو ، وتمتد بشكل لاحق إلى مناطق العظم والعظام الخلفية الأمامية(الشكل 2B).
    3. حساب منطقة العظام تحت الchondral عن طريق طرح مساحة نخاع العظم تحت الشوندري من المنطقة الكلية تحت الchondral(الشكل 2B,C).
  6. قياس المناطق الأمامية والخلفية للعظام
    1. لقياس منطقة العظام ، تتبع العظام الأمامية والخلفية للعظم القريب باستخدام وظيفة المنطقة (الشكل 2B،E،F).
      ملاحظة: Osteophytes هي إسقاطات عظمية تتشكل بين الغضروف المفصلي ولوحة النمو أو الأمامي أو الخلفي إلى المنطقة تحت الشبورة. يتم تحديد مناطق العظام على الجانبين الأمامي والخلفي من الساق عن طريق تتبع المنطقة الأمامية أو الخلفية إلى العظام تحت الجمجمة. يتم تحديد التقاطع بين العظم والعظم تحت التشبوندري بوضوح من خلال خط من الخلايا تمتد من الغضروف المفصلي إلى لوحة النمو. يتم تعريف التقاطع بين العظم والجيوب الأنفية عن طريق الانتقال بين الأنسجة العظمية والليفية.
  7. قياس سمك الزليلي
    1. قياس سمك الفخذ الزليلي في الربور باستخدام وظيفة المنطقة عن طريق رسم خط من نقطة الإدراج الداخلية للسينوفييوم الرعنة على عظم الفخذ نحو نقطة تعلقه على الغضروف المفصلي(الشكل 3B).
    2. رسم خط ثان من الإدراج الخارجي للسمنيوم على عظم الفخذ نحو تعلقه بالغضروف المفصلي(الشكل 3B).
    3. حساب سمك الزليلي عن طريق تقسيم المنطقة الزليلية الإجمالية على المحيط الزليلي.

8 - التحليل الإحصائي

  1. جمع المعلمات المقاسة ومتوسط النتائج من الأقسام التمثيلية الثلاثة لكل عينة. قم بتحليل البيانات باستخدام اختبار t للطالب غير المقترن لمقارنة مجموعتين أو ANOVA في اتجاه واحد لمقارنة ثلاث مجموعات أو أكثر.
  2. عرض البيانات كما يعني ± الخطأ القياسي للمتوسط.
    ملاحظة: تحققت الأهمية الإحصائية في p ≤ 0.05.

النتائج

ينتج عن OA الناجم عن DMM انحطاط الغضروف المفصلي وفقدان chondrocyte
أدى OA الناجم عن DMM إلى زيادة درجة OARSI مقارنة بالفئران الصورية ، التي تتميز بوضوح بتآكل السطح وفقدان الغضاريف(الشكل 1A،D). اكتشف بروتوكول قياس الهيستومورفوتومي المفصل هنا العديد من التغييرات المرت...

Discussion

وقد عززت البحوث الأخيرة هشاشة العظام فهمنا للكلام المتبادل بين الأنسجة المختلفة داخل المفصل والدور الذي يلعبه كل نسيج في بدء المرض أو التقدم8,9,10,35,36. وبناء على ذلك، أصبح من الواضح أن تقييم زراعة الأوا...

Disclosures

اي

Acknowledgements

نود أن ننوه بمساعدة موظفي قسم الطب المقارن ونواة الجزيئات وعلم الأمراض الهيستوباثفية في مركز ميلتون S. Hershey الطبي في ولاية بنسلفانيا. مصادر التمويل: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF منحة أبحاث التهاب المفاصل (F.K.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Buffered Formalin PhosphateFisher ChemicalSF100-20For sample fixation following harvest
Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)Fisher ChemicalA38S-212For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining
Cintiq 27QHD Creative Pen DisplayWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchFor histomorphometric analysis and imaging
Cintiq Ergo standWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchFor histomorphometric analysis and imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%Acros OrganicsAC446080010For Decalcification Buffer preparation
Fast Green stainSIGMA Life SciencesF7258For sample staining
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher12-550-15For sample section collection
HistoPrep XyleneFisherbrandHC-700-1GALFor sample deparrafinization and staining
Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and BaseFisher15-182-701AFor sample processing and embedding
HP Z440 WorkstationHPProduct number: Y5C77US#ABAFor histomorphometric analysis and imaging
Manual Rotary MicrotomeLeicaRM 2235For sample sectioning
Marking pensLeica3801880For sample labeling, cassettes and slides
OLYMPUS BX53 MicroscopeOLYMPUShttps://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/For histomorphometric analysis and imaging
OLYMPUS DP 73 Microscope CameraOLYMPUShttps://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)
ORION STAR A211 pH meterThermo ScientificSTARA2110For Decalcification Buffer preparation
OsteoMeasure SoftwareOsteoMetricshttps://www.osteometrics.com/index.htmFor histomorphometric measurement and analysis
Perfusion Two Automated Pressure Perfusion systemLeicaModel # 39471005For mouse knee harvest
PRISM 7 SoftwareGraphPadInstitutional Access AccountStatistical Analysis
Safranin-O stainSIGMA Life SciencesS8884For sample staining
ThinkBoneStage - Rotating Microscope StageThink Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.phpFor histomorphometric analysis and imaging
Wacom Pro Pen StylusWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchFor histomorphometric analysis and imaging
Weigerts Iron Hematoxylin AFisher5029713For hematoxylin staining
Weigerts Iron Hematoxylin BFisher5029714For hematoxylin staining

References

  1. Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
  2. Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
  3. Lorenz, J., Grässel, S., Singh, S., Coppola, V. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2004).
  4. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  5. Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
  6. Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
  7. Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
  8. Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
  9. Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
  10. Martel-Pelletier, J., et al. Osteoarthritis. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16072 (2016).
  11. Goldring, M. B., Otero, M. Inflammation in osteoarthritis. Current Opinion in Rheumatology. 23 (5), 471 (2011).
  12. Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
  13. Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  14. Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
  15. Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
  16. Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
  17. O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
  18. Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
  19. Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
  20. Pastoureau, P., Chomel, A., DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. 101, 79-91 (2004).
  21. McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
  22. Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  23. Singh, S. R., Coppola, V. . Mouse Genetics: Methods and Protocols. , (2004).
  24. Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
  25. Culley, K. L., Westendorf, J., van Wijnen, A., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. 1226, 143-173 (2015).
  26. Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  28. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
  29. Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
  30. Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
  31. Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
  32. Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
  33. Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
  34. De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
  35. Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
  36. Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43 (2011).
  37. Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  38. Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
  39. Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
  40. Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
  41. Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
  42. Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
  43. Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
  44. Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159 DMM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved