Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי יוצר שיטה קפדנית ומתוכנות לכמת של שינויים מורפולוגיים המלווים אוסטיאוארתריטיס. יישום פרוטוקול זה יכול להיות בעל ערך בניטור התקדמות המחלה והערכת התערבויות טיפוליות אוסטיאוארתריטיס.

Abstract

אחת ההפרעות המשותפת הנפוצות ביותר בארצות הברית, אוסטיאוארתריטיס (OA) מאופיין על ידי ניוון פרוגרסיבי של סחוס משני, בעיקר הירך ואת המפרקים בברך, אשר התוצאה משפיע משמעותית על ניידות המטופל איכות החיים. עד כה, אין טיפולים מרפא קיימים עבור OA מסוגל להאט או לעכב ניוון הסחוס. כיום, יש גוף נרחב של מחקר מתמשך להבין פתולוגיה OA לגלות גישות טיפוליות הרומן או סוכנים שיכולים ביעילות להאט, לעצור, או אפילו הפוכה OA. לפיכך, חיוני לקבל גישה כמותית ומשובת להעריך במדויק שינויים פתולוגיים המשויכים OA הסחוס המפרק, synovium, ו subchondral bone. כיום, חומרת OA והתקדמות מוערך בעיקר באמצעות החברה מחקר אוסטיאוארתריטיס הבינלאומי (OARSI) או מנצ מערכות הניקוד. למרות החשיבות של מערכות הניקוד הללו, הן כמותיים למחצה ויכולות להיות מושפעות מסובייקטיביות של המשתמש. חשוב מכך, הם לא מצליחים להעריך במדויק מעודן, אך חשובות, שינויים בסחוס במהלך מצבי המחלה המוקדמים או שלבי הטיפול המוקדמים. הפרוטוקול שאנו מתארים כאן משתמש במערכת תוכנה ממוחשבת וחצי אוטומטית ליצירת מתודולוגיה כמותית מתוקננת ומחמירה להערכת שינויים משותפים ב OA. פרוטוקול זה מציג תוספת רבת עוצמה למערכות הקיימות ומאפשר זיהוי יעיל יותר של שינויים פתולוגיים במפרק.

Introduction

אחת ההפרעות המשותפת הנפוצות ביותר בארצות הברית, OA מאופיין על ידי ניוון פרוגרסיבי של סחוס משני, בעיקר הירך ואת מפרקי הברך, אשר תוצאות השפעות משמעותיות על ניידות המטופל איכות החיים1,2,3. סחוס מעבר העור הוא רקמת החיבור המקצועית של המפרקים diarthrodial נועד למזער את החיכוך, להקל על התנועה, ולסבול דחיסה משותפת4. הסחוס הראשי מורכב משני מרכיבים עיקריים: כונדרוציטים ו מטריקס מסחטות. כונדרוציטים הם התמחה, metabolically תאים פעילים המשחק תפקיד עיקרי בפיתוח, תחזוקה, ותיקון של מטריצה החילוץ4. היפרפרס כונדרוציטים (CH) הוא אחד הסימנים הפתולוגיים העיקריים של התפתחות OA. הוא מאופיין על ידי גודל הסלולר גדל, ירידה בייצור פרוטאוגליקן, וייצור מוגבר של אנזימים מכמטריקס משפיל הסחוס כי בסופו של דבר להוביל את ניוון הסחוס5,6,7. עוד, שינויים פתולוגיים בעצם subchondral ו synovium של משותף לשחק תפקיד חשוב בפיתוח OA התקדמות8,9,10,11,12. עד כה, אין טיפולים מרפא קיימים המעעכב את ניוון הסחוס1,2,3,13,14. לפיכך, יש מחקר מתמשך נרחב שמטרתו להבין מחלות OA ולגלות גישות טיפוליות הרומן כי הם מסוגלים להאט או אפילו לעצור OA. לפיכך, יש צורך הולך וגובר לגישה כמותית ומשתנה המאפשר הערכה מדויקת של שינויים פתולוגיים OA הקשורים הסחוס, synovium, ו subchondral bone של המפרק.

כיום, חומרת OA והתקדמות מוערך בעיקר באמצעות מערכות הניקוד OARSI או Mankin15. עם זאת, מערכות הניקוד הללו הן רק חצי כמותית ויכולות להיות מושפעות מסובייקטיביות משתמשים. חשוב מכך, הם נכשלים בהערכת מדויק של שינויים עדינים המתרחשים במפרק במהלך המחלה או בתגובה מניפולציה גנטית או התערבות טיפולית. ישנם דיווחים מאוד בספרות המתארת ניתוחים היסטומריים של הסחוס, סינובינום, או subchondral bone16,17,18,19,20,21. עם זאת, פרוטוקול מפורט לניתוח היסטראומטרי קפדני ומעמיק של כל הרכיבים המשותפים הללו עדיין חסר, ויוצר צורך בלתי מתקיים בתחום.

כדי ללמוד שינויים פתולוגיים ב OA באמצעות ניתוח histomorphometric, השתמשנו במודל העכבר OA כירורגית כדי לגרום OA באמצעות חוסר יציבות של מניסקוס המדילי (dmm). בין המודלים הקימו של מורנה OA, dmm נבחר עבור המחקר שלנו כי זה כרוך מנגנון פחות טראומטי של פציעה22,23,24,25,26. בהשוואה ל-meniscal-ligamentous פציעה (mli) או פציעה ברצועה הצולבת הקדמית (acli) ניתוחים, dmm מקדם התקדמות הדרגתית יותר של OA, דומה לפיתוח oa בבני אדם22,24,25,26. עכברים הורדמים 12 שבועות לאחר ניתוח DMM להערכת שינויים הסחוס הפרקולארית, subchondral bone, ו synovium.

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור גישה סטנדרטית, קפדנית וכמותית להערכת שינויים משותפים המלווים OA.

Protocol

בן שתים עשרה שבועות C57BL עכברים שנרכשו ממעבדות ג'אקס. כל העכברים שוכנו בקבוצות של 3 – 5 עכברים לכל כלוב מיקרו מבודדת בחדר עם לוח זמנים של 12 שעות אור/כהה. כל ההליכים בעלי חיים בוצעו על פי המדריך הלאומי לבריאות (NIH) מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמש באוניברסיטת פנסילבניה סטייט.

1. המודל הכירורגי פוסט טראומטי (PTOA)

  1. עכברים מכהים באמצעות קטמין (100 מ"ג/ק"ג)/xylazine (10 מ"ג/ק"ג) שילוב באמצעות הזרקת תוך הצפק, מנהל בופרמורפין (1 מ"ג/ק"ג) באמצעות הזרקה תוך הצפק להקלה על הכאב, ולגלח את השיער מעל הברך. בדוק אם העדר רפלקס פדלים לפני תחילת הניתוח.
  2. לבצע חוסר יציבות של כירורגיה של מניסקוס (dmm) כמתואר בעבר22,23.
    הערה: אנא פנה לגלאססון ואח ' ולסינג ואח '. הפניות למידע על פרוטוקול כירורגי מפורט יותר22,23.
    1. לעשות חתך האורך 3 מ"מ מן הפרק המרוחק אל הרמה האבובית התיכון של המפרק בברך הימנית. השתמש בתפר כדי לתפוס. את גיד הפצ'יני
    2. פתח את הקפסולה המשותפת האמצעי לגיד ולהעביר את משטח שומן התשתית כדי להמחיש את האזור intercondylar, המדיסקוס מניסקוס, ורצועה ממנבשוקה23.
    3. כדי להשלים את היציבות. בפרק22,23 סגור את אתר החתך. עם סיכות או תפרים
  3. לבצע ניתוחים מזויפים בעקבות הליך דומה, אך ללא היפוך של הרצועה המדיאלי האמצעי.
    הערה: עכברים היו אקראיים לקבל או ניתוח DMM או הדמה. על פי הספרות שפורסמה בעבר, עכברים לפתח משמעותית ptoa 12 שבועות לאחר ניתוח dmm22,23,24.

2. המתת-חסד של העכבר ומדגם אוסף

  1. המתת חסד
    1. שנים עשר שבועות לאחר DMM, עכברים מורדם באמצעות קטמין (100 mg/ק"ג)/xylazine (10 מ"ג/ק"ג) שילוב באמצעות הזרקת בצפק פנימי.
    2. הפוך את קו האמצע לחתך דרך העור לאורך בית החזה ולסגת את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב עבור קיבעון זלוף27.
      הערה: עיין ב-Gage et al. התייחסות למידע נוסף על הפרוטוקול עבור קיבעון מכרסם הנכון, כמו גם את התיאור וידאו של ההרכבה ציוד תקין והליכים27.
    3. הגדר את מכשיר המיזוג לפי פרוטוקול היצרן.
    4. המתת החסד של העכבר על-ידי מבשם מלוחים heparinized דרך החדר השמאלי עד שהדם מתנקה והכבד הופך חיוור. מבשם עכבר עם 10% המאגר ניטרלי פורמלין עד קיבוע העכבר המלא מושגת.
      הערה: עכבר שבעל מעשה בהצלחה יהיה נוקשה. זמן הפרזיה הממוצע באמצעות מערכת המשאבה האוטומטית הוא 5 – 7 דקות.
  2. איסוף והכנה לדוגמה
    1. לבודד את הברכיים על ידי חיתוך העצם באמצע הירך באמצע השוקה ולנתח את רקמת השריר שמסביב.
    2. המשך את הקיבעון על-ידי אחסון מפרקי הברך ב-10% פורמאלין ניטרלי באגירה בטמפרטורת החדר עבור 24 שעות, ואז ב 4 ° c עבור 6 ימים.
    3. Decalcify העצם על ידי אחסון המדגם מאגר decalcify EDTA עבור שבוע 1 בטמפרטורת החדר עם טלטול מתון28. שינוי הפתרון של מאגר decalcification כל 3 ימים.
      הערה: מאגר decalcification הוכן על ידי המסת 140 g של בדיקת ה-edta באלקטרופורזה בתמיסה של 850 mL של מים מזוקקים בתוספת 15 מ ל של חומצה אצטית קרחוני. המאגר היה pH ל7.6 על ידי הוספת dropwise של חומצה אצטית קרחוני לפתרון. לאחר הגעה ל-pH = 7.6, המאגר הובא ל-1 כולל נפח L עם מים מזוקקים. מאגר decalcification היה מוכן טרי והשתמשו בתוך 1 שבוע של הכנה.
    4. לשטוף את הברכיים עם 50% אתנול, אז 70% אתנול עבור 15 דקות כל אחד, לאחר מכן תהליך להטבעה.
      הערה: עיבוד העברת נוזלים בוצע על ידי הליבה המולקולרית וההיסטולוגיה במרכז הרפואי של פן סטייט מילטון ס. הרשי. עיין בליבת היסטולוגיה של המוסד לקבלת המלצות על עיבוד לדוגמה אופטימלי.
    5. להטביע את הברכיים העכבר בתוך פרפין עם ההיבט המדיאלי של המפרק מול המשטח התחתון של בלוק פרפין. הפעילו לחץ קל על הצד הטאלי של המפרק במהלך ההטבעה כדי להבטיח שמשטחים משטחי הירך והעורק יהיו קרובים לאותו מישור ככל האפשר.

3. בנייה מיקרוטומה ובחירת שקופיות

  1. הסטום
    1. השתמש בידיות הכוונון של המטוס על מחזיק הבלוק של המיקרוטומה כדי להבטיח את הכיוון הנכון של בלוק המדגם.
    2. התמודד עם בלוק הפרפין כך שהפן המרוחק של עצם הירך, האזור הקדמי של השוקה, והקרניים הקדמיות והאחוריים של מניסקוס מופיעים באותו מישור לאוסף המקטעים (איור משלים 1a). התחל לאסוף קטעים על השקופיות כאשר הקרניים הקדמיות והאחוריים של המדיסקוס מתחילות להפריד זה מזה.
    3. ודא כי שוקה, עצם הירך, ו menisci מופיעים באותו מישור על ידי השוואת גודל המבנה. השוקה ועצם הירך אמורים להיות בגודל דומה, והקרניים המדומות בגודל ובצורה (איור משלים 1A). אם מבנה מופיע גדול מדי בהשוואה לעמיתו, הדבר מצביע על כך שיש צורך בהתמודדות נוספת. חשוב לוודא שהשטח המשותף. נותר ללא פגע
    4. לקחת קטעים משונן של פרפין ברכיים עכבר מוטבע דרך תא משותף המדיאלי בסעיפים 5 יקרומטר ולאסוף את הסעיפים על השקופיות. לאסוף כ 30 סעיפים לכל בלוק פרפין.
  2. בחירת שקופיות
    1. בחר שלושה סעיפים מייצגים 50 יקרומטר מלבד עבור כל מדגם החל מהחלק החמישי (כלומר, שקופיות 5, 15, ו -25). שקופיות נבחרות ישמשו עבור כתמים מאוחרים יותר, הבקיע OARSI, וניתוח histomorphometric.
      הערה: מבלוק עם 30 מקטעים כולל, בחר שקופיות מתחילת (שקופיות 5-10), אמצע (שקופיות 15-20) והקצה (שקופיות 25 – 30) של הערכה כדי לייצג בבירור את המדגם כולו. בחר שקופיות מרמות דומות של עומק בין דגימות.

4. המטאוקסילין, Safranin תפוז, מכתים ירוק מהיר

  1. דפפיזציה השקופיות הנבחרות עם שלושה שינויים של xylene. מימה את השקופיות עם שני שינויים של 100% אתנול, שני שינויים של 95% אתנול, ושינוי אחד של 70% אתנול.
  2. הכתם את השקופיות עם המטאוקסילין עבור 7 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים זורמים עבור 10 דקות. כתם עם ירוק מהיר עבור 3 דקות ולשטוף ב 1.0% חומצה אצטית קרחוני עבור 10 s. כתם עם Safranin-O עבור 5 דקות לשטוף במהירות על ידי טבילה ב 0.5% חומצה אצטית קרחוני.
  3. שטפו שקופיות בשני שינויים של מים מזוקקים והרשו לאוויר להתייבש.
  4. ברור שקופיות בשלושה שינויים של קסילן עבור 5 דקות כל לאחר מכן לטעון עם קסילן מבוססי מדיה הרכבה ו coverslip.
    הערה: המטאוקסילין משמש ככתם גרעיני לזיהוי אזורי מח עצם. Safranin-O משמש כדי להכתים את הסחוס, הפרוטגליקנים, mucin, ו בגרגרים תא תורן. ירוק מהיר משמש ככתם נגדי לעצם.

5. שקופית הדמיה

  1. התמונה Safranin-O ו-Fast שקופיות מוכתם ירוק באמצעות מצלמה זמינה המצורפת מיקרוסקופ ותוכנת דימות מבוססי מחשב.
  2. פתח את תוכנת הדימות (ראה טבלת חומרים) וסדר את אזור הברך המשותף של הריבית (ROI) במרכז חלון ההדמיה. אם נעשה שימוש בשלב שקופית המיקרוסקופ הסיבוב, יישר את השקופית כך שמשטח המים המקיף את רוחב הציר האופקי של אזור ההדמיה.
  3. קבעו את האיזון הלבן של המצלמה לפני שמתחילים לצלם סדרה של דוגמאות (איור משלים 2). תמונה תא משותף בהגדלה 4x ו-10x, להבטיח כי הן המשטח השני של העצמות והירך ואת העצם subchondral בתוך כל אחד מה, כלולים בכל אחת מתמונות ROIs (איור משלים 1A, B). שמור תמונות עבור כל אחת משלוש הרמות שנבחרו לשימוש עבור הבקיע OARSI.
    הערה: הגדרת האיזון הלבן של המצלמה תהיה תלויה במערכות התוכנה והמצלמה המשמשות. בדרך כלל, נווט ללשונית המצלמה או לתפריט ההדמיה הראשי וגלול למטה כדי לקבוע איזון לבן. בחר ' קבע איזון לבן ' וסמן קטן או סמל יופיע (איור משלים 2 א). באמצעות הסמן, בחר אזור בתוך התמונה/מדגם שאינו נקי מכתמים, כגון המרחב המשותף, כדי לקבוע את האיזון הלבן.

6. אוסטיאוארתריטיס החברה מחקר בינלאומי (OARSI) הבקיע15

  1. באקראי את שלושת Safranin-O ומהיר ירוק מחליק שקופיות מכל הדגימות.
  2. בצע הבקיע OARSI באופן עיוור עם שלושה משקיפים. בקצרה, להציג תמונה אחת בכל פעם בסדר אקראי ולאפשר שלושה משקיפים להבקיע כל תמונה, הקשורות לאחת משלוש רמות שנבחרו עבור כל מדגם.
    הערה: עיין בטבלת הניקוד של OARSI לקבלת תיאורים מפורטים של סולם הציונים15.
  3. לחשב את הציון הממוצע עבור כל מקטע באמצעות ציונים בודדים מכל משקיף. לקבוע את הציון הממוצע לכל מדגם על-ידי נקיטת הציון הממוצע של שלושת הסעיפים הנציג.

7. ניתוח היפוסטומטרי

הערה: תמונות בשידור חי של מפרק הברך מוצגים בצג מסך מגע באמצעות מצלמת מיקרוסקופ, ומשמש לאיתור ידני של ה-ROIs. אלגוריתמים מוכללים של תוכנת ההיסטוממטריה מכמת את הפרמטרים שצוינו (ראה פרוטוקול להלן) ב-ROIs המוגדר. חשוב מכך, אותו Safranin-O ו-מהיר ומוכתם ירוק מקטעים המשמשים בניקוד OARSI משמשים לניתוח histomorphometric.

  1. התקנת תוכנה והכנת מדידה
    1. הפעל מיקרוסקופ, מצלמה, מחשב, מסך מגע. לחץ על אייקון התוכנה כדי להפעיל את תוכנת התוכנה. הצב את השקופית על הבמה במיקרוסקופ לצפייה.
    2. מרכוז הדגימה בתוך חלון המדידה. ודא שרשת המדידה מוגדרת להגדלה הנכונה כדי להתאים למטרה הנמצאת בשימוש במיקרוסקופ (איור משלים 3).
    3. עבור אל הכרטיסיה קובץ בחלק העליון של המסך וגלול מטה כדי לקרוא את הגדרות. פתח את חלון ההגדרות ובחר את קובץ ההגדרות המתאים כדי למדוד את הפרמטרים.
    4. בחר את הפרמטר שיש למדוד מהרשימה בצד ימין של המסך (איור משלים 3). השתמש בעט העט או בסמן העכבר כדי לעקוב אחר תמונות בהתאם לשלבים המתוארים להלן כדי למדוד ROIs רקמות ספציפיות. בסיום המדידה, לחץ לחיצה ימנית כדי לסיים את המדידה ולהמשיך לפרמטר הבא.
      הערה: רשימת הפרמטרים שיש למדוד נוצרת באמצעות קובץ העדפה ייחודי המוגדר בהתייעצות עם חברת התוכנה למטרת מדידת ROIs המתואר. נא עיין בדיון לקבלת פרטים נוספים בנוגע לכיוונון המלא.
    5. השלם את כל המדידות ולאחר מכן נווט אל הכרטיסיה נתוני תקציר בחלק התחתון של מסך התוכנה (איור משלים 3). לחץ על חלון המסך, הכה את מקש Insert במקלדת או העתק והדבק את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני נפרד.
      הערה: בצע ניתוח histomorphometric באופן אקראי ועיוור. לאחר השלמת כל מדידות הפרמטרים עבור כל הדגימות, ארגן את הנתונים והממוצע את המידות משלוש השקופיות מכל מדגם.
  2. מדידות של אזורי הסחוס הכולל, מסויד ובלתי מסויד
    הערה: השתמש בתוכנה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי לבצע שלבים אלה. נא עיין באיור המשלים 1b,C לבירור על אזורי סחוס, צמתים ואזורי עצם subchondral שנדונו במהלך סעיף זה.
    1. לצייר קו על פני הקצה העליון של משטח הסחוס של האזור שבו הסחוס פוגש את החלל המשותף. צייר קו שנייה ב-צ'ונdro-osseous הצומת שבו הסחוס מסתיירת פוגש את העצם subchondral (איור 1B). השתמש בפונקציה אזור התוכנה כדי לקבל באופן אוטומטי את מדידת אזור הסחוס הכולל.
    2. צייר קו לאורך tidemark, קו טבעי המפריד בין אזורים מסויד ובלתי מסויד של סחוס. צייר קו שנייה ב-צ'ונdro-osseous הצומת שבו הסחוס מסתיירת פוגש את העצם subchondral (איור 1B). השתמש בפונקציה של אזור התוכנה כדי להשיג באופן אוטומטי את המדידה של אזור הסחוס מסויד.
    3. לחשב את אזור הסחוס בלתי מסויד על ידי הפחתת אזור הסחוס מסויד מאזור הסחוס הכולל (איור 1B).
  3. קביעת מספר כונדרוציטוט ופנוטיפ
    1. צור פונקציות מספור נפרדות בתוך ההגדרות בתוכנת ההיסטומוריקה כדי להבחין בהפקת המטריצה ובמטריצה שאינה מייצרת כונדרוציטים (איור 1B).
    2. לקבוע את מספר מטריצות לייצר או לא לייצר כונדרוציטים באמצעות העט כדי לעשות נקודה קטנה על כל כונדרוציט המבטא את הפנוטיפ שצוין (איור 1B).
      הערה: מונה תאים לפי פנוטיפים שלהם כמו מטריצה לייצר (כלומר, Safranin-O חזק כתמים) או מטריצה לא מייצר (כלומר, קלוש מאוד או לא Safranin-O כתמים).
  4. מדידת היקף המשטח התחתי
    1. מדוד את היקף המשטח האבסולוטי המוחלט על ידי מעקב אחר קו על פני פני השטח של הסחוס העצמי, בזהירות הגדרת fibrillations הפרט (איור 1C).
    2. צייר שורה שנייה לאורך המשטח כדי לשמש כפקד פנימי למישור של כל מקטע (איור 1C).
    3. לחשב את מדד המשטח הפרשולי של האזור על-ידי חלוקת השטח החיצוני של המשטח באזור ההיקפי.
      הערה: tidemark הפרימטר הם בדרך כלל שווים על פני דגימות, כך ההבדל במשטח הפרקיות טרים בין המזויף ו-dmm היה בדרך כלל קטן אם היקף מוחלט או מדד פרפור שימשו.
  5. המדידה של העצם הsubchondral ואזורי החלל מח
    1. למדוד את אזור החלל מח subchondral באמצעות הפונקציה אזור על ידי חלוקה לרמות באזור subchondral ויטראז ' עם המטאוקסילין בלבד (כלומר, שלילי ירוק מהיר) כדי לקבוע את שטח החלל במח הכולל בתוך העצם subchondral. לצייר קווים סביב ההיקף של אזורים אלה כדי לקבוע את השטח הכולל של כל מרחב במח בתוך subchondral bone העצם (איור 2B).
    2. למדוד את האזור subchondral הכולל באמצעות הפונקציה שטח על ידי חלוקה לרמות של האזור בין הצומת צ'וננדרו-osseous ואת הגבול העליון של צלחת הצמיחה, הרחבת השוליים לאזורים של האוסטאופטים הקדמי והאחורי (איור 2B).
    3. לחשב את אזור העצם subchondral על ידי הפחתת אזור מח עצם subchondral שטח מאזור subchondral הכולל (איור 2B,C).
  6. מדידת האזורים האחוריים והאחורי
    1. כדי למדוד את האזור האוסטאופתים, עקוב אחר האוסטאופטים הקדמי והאחורי של השוקה הקדמית באמצעות הפונקציה area (איור 2b,E,F).
      הערה: האוסטאופטאים הם התחזיות הגרמיות היוצרות בין הסחוס הקדמי לבין לוחית הצמיחה, הקדמית או האחורי לאזור הsubchondral. אזורים אוסטאופבים על הצדדים הקדמי והאחורי של השוקה נקבעים על ידי מעקב אחר האזור הקדמי או האחורי של העצם subchondral. הצומת בין העצמות האוסטאופניים והעצם הsubchondral מוקף באופן ברור על-ידי קו של תאים החורגים מהסחוס האומנותי ועד לצלחת הצמיחה. הצומת בין האוסטאופה והסיננובינום מוגדר על ידי מעבר בין רקמות גרמיות וסיבי.
  7. מדידה של עובי אמתחת
    1. למדוד את עובי מערכת הירך הקדמית באמצעות הפונקציה אזור על ידי ציור קו מנקודת ההכנסה הפנימית של אמתחת הקדמי על עצם הירך לקראת נקודת ההחזקה שלה על מניסקוס (איור 3b).
    2. צייר קו שני מן הכניסה החיצונית של הסיננוביאום על עצם הירך לכיוון ההחזקה שלה למנסקוס (איור 3B).
    3. לחשב את עובי אמתחת ידי חלוקת האזור אמתחת הכולל על ידי היקף אמתחת.

8. אנליזה סטטיסטית

  1. לאסוף את הפרמטרים נמדד ממוצע התוצאות של שלושת הסעיפים נציג עבור כל מדגם. נתח את הנתונים באמצעות מבחן t של סטודנט שאינו משויך כדי להשוות בין שתי קבוצות או ANOVA בכיוון אחד כדי להשוות שלוש קבוצות או יותר.
  2. הצג את הנתונים כממוצע השגיאה הסטנדרטית ±.
    הערה: משמעות סטטיסטית הושגה ב p ≤ 0.05.

תוצאות

DMM-המושרה תוצאות OA בניוון הסחוס הפרקולארית והפסד כונדרוציטוט
OA המושרה DMM הביא לציון OARSI גדל לעומת עכברים מזויפים, מאופיין בבירור על ידי שחיקת פני השטח ואובדן הסחוס (איור 1A,D). פרוטוקול histomorphometry מפורט כאן זיהה כמה שינויים OA הקשורים, כולל ירידה באזור הסחוס ה...

Discussion

מחקר אוסטיאוארתריטיס האחרונות הגדילו את ההבנה שלנו של הוצלב בין הרקמות השונות בתוך המפרק ואת התפקיד כל רקמה משחק חניכה המחלה או התקדמות8,9,10,35,36. בהתאם, זה הפך ברור כי הערכה של OA לא צריך להיות מוגבל נית?...

Disclosures

לא

Acknowledgements

ברצוני להכיר בעזרתם של צוות המחלקה לרפואה השוואתית והליבה המולקולרית וההיסטולוגיה במרכז הרפואי פן מילטון ס. הרשי. מקורות מימון: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (סיר f סאוויני), דלקת מפרקים אנRF מחקר מענק (סיר f סאוויני).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Buffered Formalin PhosphateFisher ChemicalSF100-20For sample fixation following harvest
Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)Fisher ChemicalA38S-212For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining
Cintiq 27QHD Creative Pen DisplayWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchFor histomorphometric analysis and imaging
Cintiq Ergo standWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchFor histomorphometric analysis and imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%Acros OrganicsAC446080010For Decalcification Buffer preparation
Fast Green stainSIGMA Life SciencesF7258For sample staining
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher12-550-15For sample section collection
HistoPrep XyleneFisherbrandHC-700-1GALFor sample deparrafinization and staining
Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and BaseFisher15-182-701AFor sample processing and embedding
HP Z440 WorkstationHPProduct number: Y5C77US#ABAFor histomorphometric analysis and imaging
Manual Rotary MicrotomeLeicaRM 2235For sample sectioning
Marking pensLeica3801880For sample labeling, cassettes and slides
OLYMPUS BX53 MicroscopeOLYMPUShttps://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/For histomorphometric analysis and imaging
OLYMPUS DP 73 Microscope CameraOLYMPUShttps://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)
ORION STAR A211 pH meterThermo ScientificSTARA2110For Decalcification Buffer preparation
OsteoMeasure SoftwareOsteoMetricshttps://www.osteometrics.com/index.htmFor histomorphometric measurement and analysis
Perfusion Two Automated Pressure Perfusion systemLeicaModel # 39471005For mouse knee harvest
PRISM 7 SoftwareGraphPadInstitutional Access AccountStatistical Analysis
Safranin-O stainSIGMA Life SciencesS8884For sample staining
ThinkBoneStage - Rotating Microscope StageThink Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.phpFor histomorphometric analysis and imaging
Wacom Pro Pen StylusWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchFor histomorphometric analysis and imaging
Weigerts Iron Hematoxylin AFisher5029713For hematoxylin staining
Weigerts Iron Hematoxylin BFisher5029714For hematoxylin staining

References

  1. Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
  2. Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
  3. Lorenz, J., Grässel, S., Singh, S., Coppola, V. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2004).
  4. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  5. Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
  6. Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
  7. Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
  8. Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
  9. Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
  10. Martel-Pelletier, J., et al. Osteoarthritis. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16072 (2016).
  11. Goldring, M. B., Otero, M. Inflammation in osteoarthritis. Current Opinion in Rheumatology. 23 (5), 471 (2011).
  12. Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
  13. Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  14. Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
  15. Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
  16. Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
  17. O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
  18. Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
  19. Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
  20. Pastoureau, P., Chomel, A., DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. 101, 79-91 (2004).
  21. McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
  22. Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  23. Singh, S. R., Coppola, V. . Mouse Genetics: Methods and Protocols. , (2004).
  24. Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
  25. Culley, K. L., Westendorf, J., van Wijnen, A., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. 1226, 143-173 (2015).
  26. Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  28. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
  29. Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
  30. Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
  31. Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
  32. Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
  33. Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
  34. De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
  35. Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
  36. Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43 (2011).
  37. Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  38. Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
  39. Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
  40. Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
  41. Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
  42. Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
  43. Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
  44. Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159DMMhistomorphometry

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved