手术小鼠模型中骨关节炎的标准化形态学评价

摘要

目前的议定书建立了一个严格和可重复的方法，定量与骨关节炎的形态关节变化。该协议的应用对于监测骨关节炎的疾病进展和评估治疗干预具有价值。

摘要

骨关节炎（OA）是美国最常见的关节疾病之一，其特征是关节软骨逐渐退化，主要发生在髋关节和膝关节，对患者的流动性和生活质量造成重大影响。迄今为止，目前还没有能够减缓或抑制软骨退化的OA治疗。目前，有广泛的正在进行的研究，以了解OA病理学，并发现新的治疗方法或代理，可以有效地减缓，停止，甚至反向OA。因此，关键是要有一个定量和可重复的方法，以准确评估OA相关的病理变化在关节软骨，软骨，和下骨骨。目前，OA严重性和进展主要使用国际骨关节炎研究学会（OARSI）或曼金评分系统进行评估。尽管这些评分系统非常重要，但它们是半定量的，并且可能受用户主观性的影响。更重要的是，在早期疾病状态或早期治疗阶段，它们未能准确评估软骨的微妙但重要的变化。我们在这里描述的协议使用计算机化半自动的形态学软件系统来建立标准化、严格和可重复的定量方法，用于评估OA的联合变化。该协议为现有系统提供了强大的补充，并可以更有效地检测关节中的病理变化。

引言

OA是美国最常见的关节疾病之一，其特征是关节软骨逐渐退化，主要在髋关节和膝关节，对患者的流动性和生活质量产生显著影响^{11，2，3。2,3}关节软骨是二关节的专用结缔组织，旨在最大限度地减少摩擦、促进运动和承受关节压缩^4。关节软骨由两个主要成分组成:软骨细胞和细胞外基质。软细胞是专门、代谢活性细胞，在细胞外基质⁴的开发、维护和修复中起着主要作用。软骨细胞肥大 （CH） 是 OA 发育的主要病理体征之一。其特征是细胞体积增加，蛋白酶产量减少，软骨基质降解酶的产量增加，最终导致软骨退化^{55，6，7。6,7}此外，关节下骨和关节的病理变化在OA^,9,10,11,发育和进展^中起^{重要作用。}迄今为止，目前还没有抑制软骨退化的疗法^{11、2、3、13、14。2,3,13,14}因此，有广泛的正在进行的研究，旨在了解OA病理学和发现新的治疗方法，能够减慢，甚至停止OA。因此，越来越需要定量和可重复的方法，以便准确评估关节软骨、阴骨和下骨的OA相关病理变化。

目前，OA 严重性和进展主要使用 OARSI 或曼金评分系统¹⁵进行评估。然而，这些计分系统只是半定量的，并且可能受用户主观性的影响。更重要的是，它们未能准确评估在疾病期间关节或对基因操纵或治疗干预的反应的细微变化。文献中有零星的报告，描述软骨、阴囊或下骨的形态学分析16、17、18、19、20、21。^{16,17,18,19,20,21}然而，对于所有这些关节成分进行严格和可重复的形态分析的详细协议仍然缺乏，这在现场造成了未满足的需求。

为了研究OA的病理变化，使用组织学分析，我们使用手术OA小鼠模型诱导OA通过中膜半月板（DMM）的不稳定。在已建立的鼠OA模型中，DMM被选作我们的研究，因为它涉及伤害的创伤性较小机制22、23、24、25、26。^{22,23,24,25,26}与男性韧带损伤（MLI）或前十字韧带损伤（ACLI）手术相比，DMM促进OA的逐步进展，类似于OA在人类^{22，24，25，2624,25,26}的发育²²。小鼠在DMM手术后12周被安乐死，以评估关节软骨、下骨和阴离子的变化。

该协议的目标是建立一个标准化、严格和定量的方法，以评估随 OA 附带的联合更改。

研究方案

十二周大的雄性C57BL/6小鼠是从Jax实验室购买的。所有小鼠都被安置在每微隔离器笼子里3~5只老鼠的组，在一个12小时深沉的房间里。所有动物程序均根据国家卫生研究所（NIH）实验室动物护理和使用指南执行，并经宾夕法尼亚州立大学动物护理和使用委员会批准。

1. 创伤后骨关节炎（PTOA）手术模式

1. 通过腹内注射，用氯胺酮（100毫克/千克）/xylazine（10mg/kg）组合麻醉小鼠，通过腹内注射施用丁丙诺啡（1mg/kg），以缓解疼痛，并扫描膝盖上的头发。在开始手术之前，检查是否缺乏踏板反射。
2. 执行破坏中膜半月板（DMM）手术的不稳定，如先前描述的^{2222，23。23}
   注:请参阅Glasson等人和辛格等人的参考资料，了解更详细的手术方案信息^{22、23。22,}
   1. 从右膝关节的远端骨裂到近端骨高原，进行3毫米纵向切口。使用缝合线来取代跟腱。
   2. 打开关节胶囊中质到肌腱和移动红外体脂肪垫可视化的间孔区域，中膜半月线，和半月韧带^23。
   3. 横断体韧带完成DMM和不稳定的关节^{22，23。22,}用订书钉或缝合线关闭切口部位。
3. 按照类似的程序进行假手术，但不分期进行内侧韧带。
   注:小鼠被随机随机接受DMM或假手术。根据先前发表的文献，小鼠在DMM手术12周后出现显著的PTOA222、23、24。^22,23,24

2. 小鼠安乐死和样品收集

1. 老鼠安乐死
   1. DMM后12周，通过腹内注射，用氯胺酮（100毫克/千克）/xylazine（10mg/kg）组合麻醉小鼠。
   2. 使一个中线切口通过皮肤沿胸部和收回肋骨笼暴露心脏灌注^27。
      注:有关适当啮齿动物固定的协议以及适当设备组装和程序^{的视频描述27，}请参阅Gage等人的参考。
   3. 根据制造商的协议设置灌注装置。
   4. 通过左心室渗透肝素盐水，使小鼠安乐死，直到血液被清除，肝脏变苍白。用 10% 的中性缓冲形式注入鼠标，直到完成鼠标固定。
      注:成功注入鼠标将变得僵硬。使用自动泵系统的平均灌注时间为 5-7 分钟。
2. 样品收集和准备
   1. 通过在股骨中和中头骨处切割骨骼来分离膝盖，并解剖周围的肌肉组织。
   2. 通过在室温下将膝关节储存在10%中性缓冲形式内，然后在4°C下连续6天，继续固定。
   3. 标记骨骼，通过将样品储存在EDTA脱钙缓冲液中1周，在室温下，在微温下^，28。每 3 天更改一次标记缓冲溶液。
      注:脱钙缓冲液通过溶解140克超纯EDTA四钠，在850mL蒸馏水溶液中加上15 mL的冰醋酸。通过在溶液中滴下添加冰醋酸，缓冲液被pH平衡到7.6。达到 pH = 7.6 后，缓冲液与蒸馏水的总体积达到 1 L。脱化缓冲液是新鲜准备的，在准备后1周内使用。
   4. 用50%乙醇清洗膝盖，然后每洗15分钟乙醇，然后加工嵌入。
      注:流体转移处理由宾夕法尼亚州米尔顿·赫希医疗中心的分子和组织病理学核心进行。有关最佳样品处理的建议，请咨询机构的能力学核心。
   5. 将鼠标膝盖嵌入石蜡中，将关节的中段面朝向石蜡块的底部表面。在嵌入过程中，对接头的胎面施加轻微压力，以确保头骨和股骨表面尽可能接近同一平面。

3. 微托姆切片和幻灯片选择

1. 微托姆切片
   1. 使用微缩块支架上的平面调节旋钮，确保样品块的正确面对。
   2. 面对石蜡块，使股骨的远端面、头骨的近端区域以及中腹半月板的前角和后角出现在同一平面上，用于截面收集（补充图 1A）。当中月板的前角和后角开始相互分离时，开始收集幻灯片上的部分。
   3. 通过比较结构尺寸，确保头骨、股骨和月虫在同一平面上出现。头骨和股骨的大小应相当，两个月角在大小和形状上相似（补充图1A）。如果结构与其结构相比显得太大，则表明需要额外的面。重要的是，确认关节空间保持不变。
   4. 在 5 μm 部分中接合，通过中室接取石蜡嵌入小鼠膝盖的凹陷部分，并收集幻灯片上的部分。收集每个石蜡块约30个部分。
2. 幻灯片选择
   1. 从第五节开始的每个样本（即幻灯片 5、15 和 25）为每个样本选择三个 50 μm 的代表性部分。所选幻灯片将用于后续染色、OARSI 评分和态学分析。
      注:从包含 30 个总部分的块中，从设置的开头（幻灯片 5-10）、中间（幻灯片 15+20）和结束（幻灯片 25-30）中选择幻灯片，以便清楚地表示整个样本。从样本之间的相似深度级别选择幻灯片。

4. 赫马托西林、萨夫拉宁橙和快速绿色染色

1. 使用三次二甲苯更改对所选幻灯片进行去石蜡化。用两种变化来补充滑水，包括100%乙醇、两次95%乙醇的变化和一次70%乙醇的变化。
2. 用血氧林染色滑轨7分钟，然后用自来水冲洗10分钟。用快速绿色染色3分钟，用1.0%的冰醋酸冲洗10秒。用Safranin-O染色5分钟，然后迅速冲洗，浸入0.5%的冰醋酸。
3. 用两种蒸馏水冲洗滑轨，让空气干燥。
4. 在三次二甲苯变化中清除幻灯片 5 分钟，然后用基于二甲苯的安装介质和盖玻片安装。
   注:血氧素是识别骨髓区域的核污点。Safranin-O 用于染色软骨、蛋白酶、霉素和乳腺颗粒。快速绿色用作骨骼的反面。

5. 滑动成像

1. 使用连接到显微镜和基于计算机的成像软件的可用相机拍摄 Safranin-O 和快速绿色彩色幻灯片。
2. 打开成像软件（参见材料表），并在成像窗口中心安排感兴趣的膝关节区域 （ROI）。如果使用旋转显微镜滑动阶段，则对齐幻灯片，使头骨表面跨越成像区域水平轴的宽度。
3. 在开始成像一组样本之前设置摄像机的白平衡（补充图 2）。以 4 倍和 10 倍的放大倍数对关节室进行成像，确保骨骼和股骨表面和骨骼下骨都包含在每个图像 RO 中（补充图 1A 、B）。保存用于 OARSI 评分的三个选定级别中的每个级别的图像。
   注: 设置摄像机的白平衡取决于所使用的软件和摄像机系统。通常，导航到"相机"选项卡或主成像菜单，然后向下滚动设置为"设置白平衡"。选择"设置白平衡"，应显示一个小光标或图标（补充图 2A）。使用光标，选择图像/样本中无污渍的区域（如关节空间）来设置白平衡。

6. 国际骨关节炎研究学会（OARSI）得分¹⁵

1. 随机化所有样品中选定的三张萨夫拉宁-O和快速绿色染色幻灯片。
2. 与三名观察者以盲目的方式进行 OARSI 评分。简而言之，以随机顺序一次显示一个图像，并允许三个观察者对每个图像进行评分，并关联于为每个样本选择的三个级别之一。
   注:有关分级等级^表15的详细说明，请参阅 OARSI 评分表。
3. 使用每个观察者的单个分数计算每个部分的平均得分。通过取三个代表部分的平均得分来确定每个样本的平均得分。

7. 形态分析

注:使用显微镜相机在触摸屏监视器上查看膝关节的实时图像，并使用手写笔手动跟踪 RO。组织学软件的内置算法量化了定义的 ROIs 中的指定参数（请参阅下面的协议）。重要的是，OARSI评分中使用的相同Safranin-O和快速绿色染色部分用于形态学分析。

1. 软件设置和测量准备
   1. 打开显微镜、相机、计算机和触摸屏监视器。单击软件图标启动软件程序。将幻灯片放在显微镜舞台上观看。
   2. 将样品居中到测量窗口内。确保测量网格设置为适当的放大倍率，以匹配显微镜上使用的目标（补充图 3）。
   3. 转到屏幕顶部的"文件"选项卡，向下滚动到"读取设置"。打开"设置"窗口并选择要测量的参数的适当设置文件。
   4. 从屏幕右侧列表中选择要测量的参数（补充图 3）。使用手写笔或鼠标光标根据下面描述的步骤跟踪图像，以便测量特定的组织 ROI。完成每次测量后，右键单击以结束测量并继续下一个参数。
      注: 要测量的参数列表是通过与软件公司协商建立的用于测量所述 RO 的独特的首选项文件创建的。有关完整设置的详细信息，请参阅讨论。
   5. 完成所有测量，然后导航到软件屏幕底部的"摘要数据"选项卡（补充图 3）。单击屏幕窗口，点击键盘上的"插入"键或复制数据并将其粘贴到单独的电子表格中。
      注:以随机和盲目的方式执行态学分析。完成所有样品的所有参数测量后，组织数据，并对每个样本的三张幻灯片中的测量值进行平均。
2. 总、钙化和未钙化软骨区域的测量
   注: 使用市售软件（参见材料表）执行这些步骤。有关本节讨论的软骨区域、结点和下骨区域的澄清，请参阅补充图 1B、C。
   1. 在软骨与关节空间相交的骨质软骨表面的上边缘绘制一条线。在骨质软骨与下骨相交的软骨交汇处绘制第二条线（图1B）。使用软件区域功能自动获取软骨面积总测量。
   2. 沿着潮汐标记绘制一条线，这是一条自然发生的线，分离软骨的钙化和未钙化区域。在骨质软骨与下骨相交的软骨交汇处绘制第二条线（图1B）。使用软件区域功能自动获得钙化软骨面积测量。
   3. 通过从总软骨面积中减去钙化软骨面积来计算未加垢软骨面积（图1B）。
3. 确定软骨素数和表型
   1. 在组织学软件中的设置中创建单独的计数函数，以区分矩阵生成和矩阵非生成软骨（图 1B）。
   2. 通过使用手写笔在每个表达指定表型的软骨素上做一个小点，确定产生或不生产软糖的矩阵数量（图1B）。
      注:根据细胞表型将细胞计数为生成基质（即强 Safranin-O 染色）或基质不生成（即非常微弱或无 Safranin-O 染色）。
4. 头骨表面周长的测量
   1. 通过追踪横跨骨软骨表面的一条线，仔细定义单个颤动（图1C），测量绝对的骨骼表面周长。
   2. 沿潮汐标记绘制第二条线，作为每个部分平面的内部控制（图 1C）。
   3. 通过将头骨关节表面周长除以潮标周长来计算头骨表面颤动指数。
      注:在样本之间，潮标周长通常相等，因此无论使用绝对周长还是颤动指数，假和DMM之间的关节表面周周之间的差异通常很小。
5. 下骨和骨髓空间区域的测量
   1. 使用"区域"功能测量下丘拉底骨髓空间区域，仅勾勒出子骨素区域中沾有血氧素的区域（即快速绿色为负），以确定下丘德拉骨内的总骨髓空间区域。在这些区域的周长周围绘制线，以确定骨骼下所有骨髓空间的总面积（图2B）。
   2. 利用区域函数测量总子骨素区域，勾勒出骨质结与生长板的上边界之间的区域，横向延伸到前骨质和后骨质区域（图2B）。
   3. 通过从总子骨骼面积中减去下骨骼空间区域来计算下骨骼面积（图2B，C）。C
6. 前骨和后骨质区域的测量
   1. 要测量骨质区域，请使用"区域"函数（图 2B、EE、F）跟踪近端骨的骨质和后骨质。
      注:骨质是骨投影，形成在关节软骨和生长板之间，前或后到下骨节区域。头骨前侧和后侧的骨骼区域通过追踪前部或后部到下骨骼来确定。骨质骨骼和下骨骨的结点由从关节软骨延伸到生长板的细胞线清楚地划定。骨质和硅酸的结点由骨组织与纤维组织之间的过渡定义。
7. 分体厚度的测量
   1. 使用"区域"函数测量前股骨的系状厚度，从股骨上前侧联体插入点向月月板上的附件点绘制一条线（图 3B）。
   2. 从股骨上阴音的外插中绘制第二条线，使其附着在半月板上（图3B）。
   3. 通过将总音新星面积除以六诺夫体周长来计算 synovial 厚度。

8. 统计分析

1. 收集测量的参数，并为每个样本从三个代表性部分对结果进行平均。使用未配对的学生 t 检验分析数据，以比较两个组或单向 ANOVA 以比较三个或多个组。
2. 将数据显示为均值 = 均值的标准误差。
   注:统计显著性在 p = 0.05 处达到。

结果

DMM诱导OA导致关节软骨退化和软骨损失
DMM引起的OA导致OARSI评分与假小鼠相比增加，其显著特征是表面侵蚀和软骨损失（图1A，D）。D这里详述的通体方案，发现多项OA相关变化，包括软骨总面积减少及未加垢软骨面积减少（图1A、B、E、G）;Figure 1ABEG减少总软骨素数;并且，重要的是，产生?...

讨论

最近的骨关节炎研究加深了我们对关节内不同组织之间的交叉以及每个组织在疾病启动或进展中的作用的理解^{8、9、10、35、36。9,10,35,368}因此，很明显，OA的评估不应局限于软骨分析，还应包括对下骨和软骨的分析。尽管如此，关节软骨一直是OA^{15，37，38,...}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher Chemical	SF100-20	For sample fixation following harvest
Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)	Fisher Chemical	A38S-212	For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining
Cintiq 27QHD Creative Pen Display	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	For histomorphometric analysis and imaging
Cintiq Ergo stand	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	For histomorphometric analysis and imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%	Acros Organics	AC446080010	For Decalcification Buffer preparation
Fast Green stain	SIGMA Life Sciences	F7258	For sample staining
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher	12-550-15	For sample section collection
HistoPrep Xylene	Fisherbrand	HC-700-1GAL	For sample deparrafinization and staining
Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base	Fisher	15-182-701A	For sample processing and embedding
HP Z440 Workstation	HP	Product number: Y5C77US#ABA	For histomorphometric analysis and imaging
Manual Rotary Microtome	Leica	RM 2235	For sample sectioning
Marking pens	Leica	3801880	For sample labeling, cassettes and slides
OLYMPUS BX53 Microscope	OLYMPUS	https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/	For histomorphometric analysis and imaging
OLYMPUS DP 73 Microscope Camera	OLYMPUS	https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/	For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)
ORION STAR A211 pH meter	Thermo Scientific	STARA2110	For Decalcification Buffer preparation
OsteoMeasure Software	OsteoMetrics	https://www.osteometrics.com/index.htm	For histomorphometric measurement and analysis
Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system	Leica	Model # 39471005	For mouse knee harvest
PRISM 7 Software	GraphPad	Institutional Access Account	Statistical Analysis
Safranin-O stain	SIGMA Life Sciences	S8884	For sample staining
ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage	Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)	http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php	For histomorphometric analysis and imaging
Wacom Pro Pen Stylus	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	For histomorphometric analysis and imaging
Weigerts Iron Hematoxylin A	Fisher	5029713	For hematoxylin staining
Weigerts Iron Hematoxylin B	Fisher	5029714	For hematoxylin staining