Valutazione istomormetrica standardizzata dell'osteoartrite in un modello di topo chirurgico

Riepilogo

L'attuale protocollo stabilisce un metodo rigoroso e riproducibile per la quantificazione dei cambiamenti articolari morfologici che accompagnano l'osteoartrite. L'applicazione di questo protocollo può essere utile per monitorare la progressione della malattia e valutare gli interventi terapeutici nell'osteoartrite.

Abstract

Uno dei disturbi articolari più diffusi negli Stati Uniti, l'osteoartrite (OA) è caratterizzata da una progressiva degenerazione della cartilagine articolare, principalmente nelle articolazioni dell'anca e del ginocchio, che si traduce in impatti significativi sulla mobilità del paziente e sulla qualità della vita. Ad oggi, non esistono terapie curative esistenti per l'OA in grado di rallentare o inibire la degenerazione della cartilagine. Attualmente, c'è una vasta serie di ricerche in corso per comprendere la patologia OA e scoprire nuovi approcci terapeutici o agenti che possono rallentare in modo efficiente, fermare o addirittura invertire OA. Pertanto, è fondamentale avere un approccio quantitativo e riproducibile per valutare con precisione i cambiamenti patologici associati all'OA nella cartilagine articolare, nel sinovio e nell'osso subcondrale. Attualmente, la gravità e la progressione dell'OA sono valutate principalmente utilizzando l'Osteoarthritis Research Society International (OARSI) o i sistemi di punteggio Mankin. Nonostante l'importanza di questi sistemi di punteggio, sono semiquantitativi e possono essere influenzati dalla soggettività dell'utente. Ancora più importante, non riescono a valutare con precisione sottili, ma importanti, cambiamenti nella cartilagine durante gli stati della malattia precoce o le fasi di trattamento precoce. Il protocollo qui descritto utilizza un sistema software istomorfometrico computerizzato e semiautomatizzato per stabilire una metodologia quantitativa standardizzata, rigorosa e riproducibile per la valutazione dei cambiamenti congiunti nell'OA. Questo protocollo presenta una potente aggiunta ai sistemi esistenti e consente un rilevamento più efficiente dei cambiamenti patologici nel giunto.

Introduzione

Uno dei disturbi articolari più diffusi negli Stati Uniti, OA è caratterizzato da una progressiva degenerazione della cartilagine articolare, principalmente nelle articolazioni dell'anca e del ginocchio, che si traduce in impatti significativi sulla mobilità del paziente e sulla qualità della vita^1,2,3. La cartilagine articolare è il tessuto connettivo specializzato delle articolazioni diartrodiali progettato per ridurre al minimo l'attrito, facilitare il movimento e sopportare la compressione articolare⁴. La cartilagine articolare è composta da due componenti primari: condrociti e matrice extracellulare. I condrociti sono cellule specializzate, metabolicamente attive che svolgono un ruolo primario nello sviluppo, manutenzione, e riparazione della matrice extracellulare⁴. L'ipertrofia condromita (CH) è uno dei principali segni patologici dello sviluppo dell'OA. È caratterizzato da un aumento delle dimensioni del cellulare, diminuzione della produzione proteoglicana e aumento della produzione di enzimi che degradano la matrice della cartilagine che alla fine portano alla degenerazione della cartilagine^5,6,7. Inoltre, i cambiamenti patologici nell'osso subcondrale e nel sinovio del giunto svolgono un ruolo importante nello sviluppo e nella progressione^{dell'OA 8,9,10,11,12}. Ad oggi, non esistono terapie curative esistenti che inibiscono la degenerazione della cartilagine^1,2,3,13,14. Così, c'è una vasta ricerca in corso che mira a capire la patologia OA e scoprire nuovi approcci terapeutici che sono in grado di rallentare o addirittura fermare OA. Di conseguenza, c'è una crescente necessità di un approccio quantitativo e riproducibile che consenta una valutazione accurata dei cambiamenti patologici associati all'OA nella cartilagine, nel sinovium e nell'osso subcondrale dell'articolazione.

Attualmente, la gravità e la progressione dell'OA vengono valutate principalmente utilizzando i sistemi di punteggio OARSI o Mankin¹⁵. Tuttavia, questi sistemi di punteggio sono solo semiquantitativi e possono essere influenzati dalla soggettività dell'utente. Ancora più importante, non riescono a valutare con precisione i cambiamenti sottili che si verificano nell'articolazione durante la malattia o in risposta alla manipolazione genetica o a un intervento terapeutico. Ci sono sporadiche relazioni nella letteratura che descrivono le analisi istomormetriche della cartilagine, del sinovio o dell'osso subcondrale^16,17,18,19^,2020,21. Tuttavia, manca ancora un protocollo dettagliato per l'analisi istomorfometrica rigorosa e riproducibile di tutti questi componenti articolari, creando un bisogno insoddisfatto nel campo.

Per studiare i cambiamenti patologici nell'OA utilizzando l'analisi istomorfometrica, abbiamo usato un modello di topo chirurgico OA per indurre l'OA attraverso la destabilizzazione del menisco mediale (DMM). Tra i modelli consolidati di murine OA, DMM è stato selezionato per il nostro studio perché coinvolge un meccanismo meno traumatico di lesione^{22,23,24,25,26}. Rispetto agli interventi chirurgici a imumento meniscale-ligamentoso (MLI) o alle lesioni da legamento crociato anteriore (ACLI), DMM promuove una progressione più graduale dell'OA, simile allo sviluppo di OA negli esseri umani^22,24,25,26. I topi sono stati eutanasia dodici settimane dopo l'intervento chirurgico DMM per valutare i cambiamenti nella cartilagine articolare, nell'osso subcondrale e nel sinovium.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un approccio standardizzato, rigoroso e quantitativo per valutare i cambiamenti congiunti che accompagnano l'OA.

Protocollo

I topi C57BL/6 di 12 settimane sono stati acquistati da Jax Labs. Tutti i topi erano alloggiati in gruppi di 3-5 topi per gabbia micro-isolatore in una stanza con un programma di 12 h luce /scuro. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo la Guida del National Institute of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvate dall'Animal Care and Use Committee della Pennsylvania State University.

1. Modello chirurgico di osteoartrite post-traumatica (PTOA)

1. Anestesizzare i topi utilizzando una combinazione di ketamina (100 mg/kg)/xylazina (10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale, somministrazione di buprenorphine (1 mg/kg) tramite iniezione intraperitale per alleviare il dolore e radersi i capelli sul ginocchio. Verificare la mancanza di un riflesso pedale prima di iniziare l'intervento chirurgico.
2. Eseguire la destabilizzazione della chirurgia del menisco mediale (DMM) come descritto in precedenza^22,23.
   NOTA: Si prega di fare riferimento a Glasson et al. e Singh et al. riferimenti per informazioni più dettagliate protocollo chirurgico^22,23.
   1. Fare un'incisione longitudinale di 3 mm dalla rotula distale all'altopiano tibiale prossimale dell'articolazione del ginocchio destro. Utilizzare una sutura per sposto il tendine rotuleo.
   2. Aprire la capsula articolare mediale al tendine e spostare il tampone di grasso infraptellare per visualizzare la regione intercondilar, il menisco mediale e il legamento meniscotibiale²³.
   3. Trasmettere il legamento meniscotibiale mediale per completare il DMM e destabilizzare l'articolazione^22,23. Chiudere il sito di incisione con graffette o suture.
3. Eseguire interventi chirurgici fittizi seguendo una procedura simile, ma senza transezione del legamento meniscotibiale mediale.
   NOTA: I topi sono stati randomizzati per ricevere un intervento chirurgico DMM o farsa. Secondo la letteratura pubblicata in precedenza, i topi sviluppano significativa PTOA 12 settimane dopo l'intervento chirurgico DMM^22,23,24.

2. Eutanasia del topo e raccolta di campioni

1. Eutanasia del topo
   1. Dodici settimane dopo il DMM, anestesizzare i topi utilizzando una combinazione di ketamina (100 mg/kg)/xylazina (10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale.
   2. Fare un'incisione mediana attraverso la pelle lungo il torace e ritrarre la gabbia toracica per esporre il cuore per la fissazione perfusione²⁷.
      NOTA: Fare riferimento al riferimento Gage et al. per ulteriori informazioni sul protocollo per una corretta fissazione dei roditori, nonché la rappresentazione video dell'assemblaggio e delle procedure dell'apparecchiatura corretta²⁷.
   3. Impostare l'apparato perfusione secondo il protocollo del produttore.
   4. Eutanasia il topo perfondendo la salina eparinizzata attraverso il ventricolo sinistro fino a quando il sangue non viene eliminato e il fegato diventa pallido. Perfecone il mouse con il 10% di formalina neutra memorizzata nel buffer fino a raggiungere la fissazione completa del mouse.
      NOTA: Un mouse perfuso con successo diventerà rigido. Il tempo medio di perfusione utilizzando il sistema di pompaggio automatico è di 5–7 min.
2. Raccolta e preparazione dei campioni
   1. Isolare le ginocchia tagliando l'osso a metà femore e metà tibia e sezionare il tessuto muscolare circostante.
   2. Continuare la fissazione conservando le articolazioni del ginocchio in formali tamponati neutri del 10% a temperatura ambiente per 24 h, quindi a 4 gradi centigradi per 6 giorni.
   3. Decalcizzare l'osso conservando il campione nel buffer di decalcificazione EDTA per 1 settimana a temperatura ambiente con lieve agitazione²⁸. Modificare la soluzione del buffer di decalcificazione ogni 3 giorni.
      NOTA: il buffer di decalcificazione è stato preparato sciogliendo 140 g di tetrasodio EDTA ultrapuro in una soluzione di 850 mL di acqua distillata più 15 mL di acido acetico glaciale. Il buffer è stato equilibrato in pH a 7,6 mediante aggiunta goccia per sboccolare dell'acido acetico glaciale alla soluzione. Una volta raggiunto il pH 7,6, il tampone è stato portato a 1 l volume totale con acqua distillata. Buffer di decalcificazione è stato preparato fresco e utilizzato entro 1 settimana dalla preparazione.
   4. Lavare le ginocchia con il 50% di etanolo, poi 70% etanolo per 15 min ciascuno, quindi elaborare per l'incorporamento.
      NOTA: l'elaborazione del trasferimento dei fluidi è stata eseguita dal Molecular and Histopathology Core del Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Consultare il nucleo istologico dell'istituto per consigli sull'elaborazione ottimale dei campioni.
   5. Incorporare le ginocchia del topo in paraffina con l'aspetto mediale dell'articolazione rivolta verso la superficie inferiore del blocco di paraffina. Applicare una leggera pressione sul lato tibiale dell'articolazione durante l'incorporamento per garantire che le superfici tibiali e femorali siano il più vicino possibile allo stesso piano.

3. Sezionamento microtome e selezione delle diapositive

1. Sezionamento microtome
   1. Utilizzare le manopole di regolazione del piano sul supporto del blocco del microtoma per garantire una corretta facciata del blocco del campione.
   2. Affrontare il blocco di paraffina in modo che l'aspetto distale del femore, regione prossimale della tibia e corna anteriori e posteriori del menisco mediale appaiono nello stesso piano per la raccolta di sezioni (Figura supplementare 1A). Inizia a raccogliere sezioni sui vetrini quando le corna anteriori e posteriori del menisco mediale iniziano a separarsi l'una dall'altra.
   3. Assicurarsi che la tibia, il femore e il menisci appaiano sullo stesso piano confrontando le dimensioni della struttura. La tibia e il femore devono essere di dimensioni comparabili, con entrambe le corna meniscali simili per dimensioni e forma (Figura supplementare 1A). Se una struttura appare troppo grande rispetto alla sua controparte, ciò indica che è necessario un fronte aggiuntivo. È importante sottolineare che lo spazio articolare rimane intatto.
   4. Prendere le sezioni sagittali delle ginocchia del topo in paraffina attraverso il vano giunto mediale in sezioni da 5 m e raccogliere le sezioni sui vetrini. Raccogliere circa 30 sezioni per blocco di paraffina.
2. Selezione diapositiva
   1. Selezionare tre sezioni rappresentative a 50 m di distanza per ogni campione a partire dalla quinta sezione (cioè diapositive 5, 15 e 25). Le diapositive selezionate verranno utilizzate per la successiva colorazione, il punteggio OARSI e l'analisi histomorfometrica.
      NOTA: da un blocco con 30 sezioni totali, selezionare le diapositive dall'inizio (diapositive 5-10), al centro (diapositive 15–20) e alla fine (diapositive 25-30) del set per rappresentare chiaramente l'intero campione. Selezionare diapositive da livelli di profondità simili tra i campioni.

4. Colorazione ematossitale, Safranin Arancione e Verde veloce

1. Deparaffina le diapositive selezionate con tre modifiche di xilene. Idratare i vetrini con due cambiamenti di etanolo al 100%, due cambi del 95% di etanolo e un cambio del 70% di etanolo.
2. Macchiagli gli scivoli con ematossilina per 7 min poi lava con acqua corrente per 10 min.
3. Sciacquare i vetrini in due cambi di acqua distillata e lasciare asciugare l'aria.
4. Sgombrare le diapositive in tre cambi di xilene per 5 min ciascuno poi montare con supporti di montaggio basati su xilene e un coverslip.
   NOTA: L'ematossia serve come macchia nucleare per identificare le aree del midollo osseo. Safranin-O è usato per macchiare cartilagine, proteoglicani, muchino e granuli di mastocio. Fast Green è usato come contromacchia per l'osso.

5. Immagini scorrevoli

1. Immagine delle diapositive colorate Safranin-O e Fast Green utilizzando una telecamera disponibile collegata a un microscopio e software di imaging basato su computer.
2. Aprire il software di imaging (vedere Tabella dei materiali) e disporre la regione di interesse dell'articolazione del ginocchio (ROI) al centro della finestra di imaging. Se si utilizza uno stadio di scorrimento del microscopio rotazionale, allineare la diapositiva in modo che la superficie tibiale si estenda per tutta la larghezza dell'asse orizzontale della regione di imaging.
3. Impostare il bilanciamento del bianco della fotocamera prima di iniziare a visualizzare un insieme di campioni (Supplementary Figure 2). Immagine del raggruppamento del giunto con ingrandimento sia 4x che 10x, assicurando che sia la superficie articolare tibiale che quella articolare femorale e l'osso subcondrale tibiale siano inclusi all'interno di ciascuna delle ROI dell'immagine (Figura supplementare 1A, B). Salvare le immagini per ciascuno dei tre livelli selezionati da utilizzare per il punteggio OARSI.
   NOTA: l'impostazione del bilanciamento del bianco della fotocamera dipenderà dal software e dai sistemi di fotocamera in uso. In genere, passare alla scheda Fotocamera o al menu Principale di imaging e scorrere verso il basso fino a Imposta bilanciamento bianco. Selezionare Imposta bilanciamento bianco per visualizzare un cursore o un'icona di piccole dimensioni (Figura supplementare 2A). Utilizzando il cursore, selezionare un'area all'interno dell'immagine/campione privo di macchie, ad esempio lo spazio del giunto, per impostare il bilanciamento del bianco.

6. Osteoartrite ricerca internazionale (OARSI) punteggio¹⁵

1. Randomizzare le tre diapositive colorate Safranin-O e Fast Green selezionate da tutti i campioni.
2. Esegui il punteggio OARSI in modo cieco con tre osservatori. In breve, visualizzare un'immagine alla volta in ordine casuale e consentire a tre osservatori di segnare ogni immagine, correlando a uno dei tre livelli selezionati per ogni campione.
   NOTA: Si prega di fare riferimento alla tabella dei punteggi OARSI per una descrizione dettagliata della scala di classificazione¹⁵.
3. Calcola il punteggio medio per ogni sezione utilizzando i punteggi individuali di ogni osservatore. Determinare il punteggio medio per campione prendendo il punteggio medio delle tre sezioni rappresentative.

7. Analisi istomortrametrica

NOTA: le immagini dal vivo dell'articolazione del ginocchio vengono visualizzate su un monitor touchscreen utilizzando una fotocamera al microscopio e uno stilo viene utilizzato per tracciare manualmente i ROI. Gli algoritmi incorporati del software histomorfometria quantificano i parametri specificati (vedere Protocollo di seguito) nei ROI definiti. È importante sottolineare che le stesse sezioni colorate Safranin-O e Fast Green utilizzate nel punteggio OARSI vengono utilizzate per l'analisi istomorfometrica.

1. Configurazione del software e preparazione della misurazione
   1. Attiva microscopio, fotocamera, computer e monitor touchscreen. Fare clic sull'icona del software per avviare il programma software. Posizionare il vetrino sullo stadio del microscopio per la visualizzazione.
   2. Centrare il campione all'interno della finestra di misurazione. Assicurarsi che la griglia di misurazione sia impostata sull'ingrandimento corretto in modo che corrisponda all'obiettivo utilizzato al microscopio (Figura supplementare 3).
   3. Passare alla scheda File nella parte superiore dello schermo e scorrere verso il basso fino a Leggi impostazioni. Aprire la finestra Impostazioni e selezionare il file di impostazioni appropriato per i parametri da misurare.
   4. Selezionare il parametro da misurare dall'elenco sul lato destro dello schermo (Supplementary Figure 3). Utilizzare lo stilo o il cursore del mouse per tracciare le immagini in base ai passaggi descritti di seguito per misurare specifici RO dei tessuti. Al termine di ogni misurazione, fare clic con il pulsante destro del mouse per terminare la misurazione e passare al parametro successivo.
      NOTA: L'elenco dei parametri da misurare viene creato attraverso un file di preferenze distinto che viene impostato in consultazione con la società di software allo scopo di misurare i ROI descritti. Si prega di consultare la discussione per ulteriori dettagli sulla configurazione completa.
   5. Completare tutte le misurazioni e passare alla scheda Dati di riepilogo nella parte inferiore della schermata del software ( Figurasupplementare 3). Fare clic sulla finestra dello schermo, premere il tasto Inserisci sulla tastiera o copiare e incollare i dati in un foglio di calcolo separato.
      NOTA: Eseguire l'analisi istomorfometrica in modo randomizzato e accecato. Dopo aver completato tutte le misurazioni dei parametri per tutti i campioni, organizzare i dati e calcolare la media delle misurazioni delle tre diapositive di ogni campione.
2. Misure delle aree cartilagini totali, calcificate e non calcolate
   NOTA: utilizzare un software disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) per eseguire questi passaggi. Vedere Figura supplementare 1B,C per chiarimenti sulle regioni della cartilagine, le giunzioni e le regioni ossee subcondriali discusse in questa sezione.
   1. Disegnare una linea attraverso il bordo superiore della superficie della cartilagine tibiale dove la cartilagine incontra lo spazio articolare. Disegnare una seconda linea in corrispondenza della giunzione condro-osseo dove la cartilagine calcificata incontra l'osso subcondrale (Figura 1B). Utilizzare la funzione Area software per ottenere automaticamente la misurazione dell'area cartilaginea totale.
   2. Disegnare una linea lungo il segno di marea, una linea naturale che separa le regioni calcificate e non calcificate della cartilagine. Disegnare una seconda linea in corrispondenza della giunzione condro-osseo dove la cartilagine calcificata incontra l'osso subcondrale (Figura 1B). Utilizzare la funzione Area software per ottenere automaticamente la misurazione dell'area della cartilagine calcificata.
   3. Calcolare l'area della cartilagine non calcolata sottraendo l'area della cartilagine calcificata dall'area totale della cartilagine (Figura 1B).
3. Determinazione del numero di condrociti e del fenotipo
   1. Creare funzioni di conteggio separate all'interno delle impostazioni del software histomorphometry per distinguere la produzione di matrici e i condrociti non producibili a matrice (Figura 1B).
   2. Determinare il numero di matrici che producono o non producono condrociti utilizzando lo stilo per fare un piccolo punto su ogni condrocito che esprime il fenotipo specificato (Figura 1B).
      NOTA: Contare le cellule in base al loro fenotipo come matrice che produce (cioè, forte colorazione Safranin-O) o matrice non producendo (cioè, molto debole o nessuna colorazione Safranin-O).
4. Misurazione del perimetro della superficie articolare tibiale
   1. Misurare il perimetro assoluto della superficie articolare tibiale tracciando una linea attraverso la superficie della cartilagine tibiale, definendo attentamente le fibrillazioni individuali (Figura 1C).
   2. Disegnare una seconda linea lungo il tidemark per fungere da controllo interno per il piano di ogni sezione (Figura 1C).
   3. Calcolare l'indice di fibrillazione della superficie articolare tibiale dividendo il perimetro della superficie articolare tibiale per il perimetro del marchio di marea.
      NOTA: i perimetri Tidemark sono generalmente uguali tra i campioni, quindi la differenza nei perimetri della superficie articolare tra finzione e DMM era generalmente piccola indipendentemente dal fatto che venisse utilizzato l'indice assoluto di perimetro o fibrillazione.
5. Misurazione delle aree dello spazio subcondrale e del midollo
   1. Misurare l'area dello spazio del midollo subcondro utilizzando la funzione Area delineando le regioni nella regione subcondrale macchiate solo con ematossia (cioè negativo per Fast Green) per determinare l'area totale dello spazio del midollo all'interno dell'osso subcondrale. Disegnare linee intorno al perimetro di queste aree per determinare l'area totale di tutto lo spazio del midollo all'interno dell'osso subcondrale tibiale (Figura 2B).
   2. Misurare l'area subcondrale totale utilizzando la funzione area delineando la regione tra la giunzione condro-osseo e il bordo superiore della piastra di crescita, che si estende lateralmente alle regioni degli osteofiti anteriori e posteriori (Figura 2B).
   3. Calcolare l'area dell'osso subcondrale sottraendo l'area dello spazio del midollo osseo subdolo dall'area subcondrale totale (Figura 2B,C).
6. Misurazione delle aree osteofite anteriori e posteriori
   1. Per misurare l'area osteofite, tracciare l'osteofite anteriore e posteriore della tibia prossimale utilizzando la funzione Area (Figura 2B,E,F).
      NOTA: gli osteofiti sono proiezioni ossee che si formano tra la cartilagine articolare e la piastra di crescita, anteriore o posteriore alla regione subcondrale. Le aree osteofite sui lati anteriori e posteriori della tibia sono determinate tracciando l'area anteriore o posteriore all'osso subcondrale. La giunzione tra gli osteofiti e l'osso subcondrale è chiaramente delineata da una linea di celle che si estende dalla cartilagine articolare alla piastra di crescita. La giunzione tra osteofite e sinovio è definita da una transizione tra tessuto osseo e tessuto fibroso.
7. Misurazione dello spessore sinoviale
   1. Misurare lo spessore sinoviale femorale anteriore utilizzando la funzione Area disegnando una linea dal punto di inserimento interno del sinovio anteriore sul femore verso il suo punto di attacco sul menisco (Figura 3B).
   2. Disegnare una seconda linea dall'inserimento esterno del sinovio sul femore verso il suo attaccamento al menisco (Figura 3B).
   3. Calcolare lo spessore sinoviale dividendo l'area sinoviale totale per il perimetro sinoviale.

8. Analisi statistica

1. Raccogliere i parametri misurati e calcolare la media dei risultati delle tre sezioni rappresentative per ogni campione. Analizzare i dati utilizzando un test t di Student non accoppiato per confrontare due gruppi o ANOVA unidirezionali per confrontare tre o più gruppi.
2. Visualizzare i dati come media : errore standard di media.
   NOTA: La rilevanza statistica è stata raggiunta a 0,05.

Risultati

L'OA indotta da DMM si traduce in degenerazione della cartilagine articolare e perdita di condrociti
L'OA indotto da DMM ha determinato un aumento del punteggio OARSI rispetto ai topi farsi, caratterizzati distintamente dall'erosione superficiale e dalla perdita della cartilagine (Figura 1A,D). Il protocollo histomorphometry qui descritto ha rilevato diverse modifiche associate all'OA, tra cui una diminuzione dell'area totale della cartilagine e nell'area...

Discussione

Recenti ricerche sull'osteoartrite hanno migliorato la nostra comprensione del crosstalk tra i diversi tessuti all'interno dell'articolazione e il ruolo di ogni tessuto nell'inizio o nella progressione della malattia^8,9,10^,3535,36. Di conseguenza, è diventato evidente che la valutazione dell'OA non dovrebbe limitarsi all'analisi della cartilagine, ma dovrebbe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher Chemical	SF100-20	For sample fixation following harvest
Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)	Fisher Chemical	A38S-212	For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining
Cintiq 27QHD Creative Pen Display	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	For histomorphometric analysis and imaging
Cintiq Ergo stand	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	For histomorphometric analysis and imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%	Acros Organics	AC446080010	For Decalcification Buffer preparation
Fast Green stain	SIGMA Life Sciences	F7258	For sample staining
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher	12-550-15	For sample section collection
HistoPrep Xylene	Fisherbrand	HC-700-1GAL	For sample deparrafinization and staining
Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base	Fisher	15-182-701A	For sample processing and embedding
HP Z440 Workstation	HP	Product number: Y5C77US#ABA	For histomorphometric analysis and imaging
Manual Rotary Microtome	Leica	RM 2235	For sample sectioning
Marking pens	Leica	3801880	For sample labeling, cassettes and slides
OLYMPUS BX53 Microscope	OLYMPUS	https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/	For histomorphometric analysis and imaging
OLYMPUS DP 73 Microscope Camera	OLYMPUS	https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/	For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)
ORION STAR A211 pH meter	Thermo Scientific	STARA2110	For Decalcification Buffer preparation
OsteoMeasure Software	OsteoMetrics	https://www.osteometrics.com/index.htm	For histomorphometric measurement and analysis
Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system	Leica	Model # 39471005	For mouse knee harvest
PRISM 7 Software	GraphPad	Institutional Access Account	Statistical Analysis
Safranin-O stain	SIGMA Life Sciences	S8884	For sample staining
ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage	Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)	http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php	For histomorphometric analysis and imaging
Wacom Pro Pen Stylus	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	For histomorphometric analysis and imaging
Weigerts Iron Hematoxylin A	Fisher	5029713	For hematoxylin staining
Weigerts Iron Hematoxylin B	Fisher	5029714	For hematoxylin staining