Avaliação histomorfométrica padronizada da osteoartrite em um modelo de rato cirúrgico

Resumo

O protocolo atual estabelece um método rigoroso e reprodutível para quantificação de alterações articulares morfológicas que acompanham a osteoartrite. A aplicação deste protocolo pode ser valiosa no monitoramento da progressão da doença e na avaliação de intervenções terapêuticas na osteoartrite.

Resumo

Uma das doenças articulares mais prevalentes nos Estados Unidos, a osteoartrite (OA) é caracterizada pela degeneração progressiva da cartilagem articular, principalmente nas articulações do quadril e do joelho, o que resulta em impactos significativos na mobilidade e qualidade de vida do paciente. Até o momento, não existem terapias curativas existentes para OA capazes de retardar ou inibir a degeneração da cartilagem. Atualmente, há um extenso corpo de pesquisas em andamento para entender a patologia da OA e descobrir novas abordagens terapêuticas ou agentes que podem reduzir eficientemente, parar ou até mesmo reverter o OA. Assim, é fundamental ter uma abordagem quantitativa e reprodutível para avaliar com precisão as alterações patológicas associadas à OA na cartilagem articular, no sinóvio e no osso subcondral. Atualmente, a gravidade e a progressão da OA são avaliadas principalmente usando os sistemas de pontuação Da Osteoarthritis Research Society International (OARSI) ou Mankin. Apesar da importância desses sistemas de pontuação, eles são semiquantitativos e podem ser influenciados pela subjetividade do usuário. Mais importante, não conseguem avaliar com precisão mudanças sutis, mas importantes, na cartilagem durante os estados precoces da doença ou fases de tratamento precoce. O protocolo que descrevemos aqui usa um sistema de software histomorfométrico computadorizado e semi-automatizado para estabelecer uma metodologia quantitativa padronizada, rigorosa e reprodutível para a avaliação de mudanças conjuntas na OA. Este protocolo apresenta uma poderosa adição aos sistemas existentes e permite uma detecção mais eficiente de alterações patológicas na articulação.

Introdução

Uma das doenças articulares mais prevalentes nos Estados Unidos, a OA é caracterizada pela degeneração progressiva da cartilagem articular, principalmente nas articulações do quadril e do joelho, o que resulta em impactos significativos na mobilidade do paciente e na qualidade de vida^1,2,3. Cartilagem articular é o tecido conjuntivo especializado das articulações diartrodiais projetadas para minimizar o atrito, facilitar o movimento e suportar a compressão articular⁴. A cartilagem articular é composta por dois componentes primários: condrócitos e matriz extracelular. Os condrócitos são células especializadas e metabolicamente ativas que desempenham um papel primordial no desenvolvimento, manutenção e reparo da matriz extracelular⁴. A hipertrofia condrócito (CH) é um dos principais sinais patológicos do desenvolvimento da OA. Caracteriza-se pelo aumento do tamanho celular, diminuição da produção de proteoglicano e aumento da produção de enzimas degradantes da matriz de cartilagem que eventualmente levam à degeneração da cartilagem^5,6,7. Além disso, alterações patológicas no osso subcondral e no sinóvio da articulação desempenham um papel importante no desenvolvimento e progressão da OA^{8,,9,10,11,12}. Até o momento, não existem terapias curativas existentes que inibam a degeneração da cartilagem^1,2,3,13,14. Assim, há extensas pesquisas em andamento que visam compreender a patologia da OA e descobrir novas abordagens terapêuticas que são capazes de retardar ou até mesmo parar o OA. Assim, há uma necessidade crescente de uma abordagem quantitativa e reprodutível que permita uma avaliação precisa das alterações patológicas associadas à OA na cartilagem, sinóvio e osso subcondral da articulação.

Atualmente, a gravidade e a progressão do OA são avaliadas principalmente usando os sistemas de pontuação OARSI ou Mankin¹⁵. No entanto, esses sistemas de pontuação são apenas semiquantitativos e podem ser influenciados pela subjetividade do usuário. Mais importante, eles não conseguem avaliar com precisão mudanças sutis que ocorrem na articulação durante a doença ou em resposta à manipulação genética ou a uma intervenção terapêutica. Há relatos esporádicos na literatura descrevendo análises histomorfométricas da cartilagem, sinóvio ou osso subcondral^{16,,17,,18,,19,,20,21}. No entanto, ainda falta um protocolo detalhado para análise histomorfométrica rigorosa e reprodutível de todos esses componentes articulares, criando uma necessidade não atendida no campo.

Para estudar alterações patológicas na OA usando análise histomorfométrica, utilizou-se um modelo cirúrgico de rato oa para induzir OA através da desestabilização do menisco medial (DMM). Entre os modelos estabelecidos de Murine OA, a DMM foi selecionada para o nosso estudo por envolver um mecanismo menos traumático de lesão^{22,,23,24,25,26}. Em comparação com as cirurgias de lesão meniscal-ligamento (MLI) ou lesão do ligamento cruzado anterior (ACLI), a DMM promove uma progressão mais gradual da OA, semelhante ao desenvolvimento de OA em humanos^22,24,25,26. Os camundongos foram eutanizados doze semanas após a cirurgia de DMM para avaliar alterações na cartilagem articular, osso subcondral e sinóvio.

O objetivo deste protocolo é estabelecer uma abordagem padronizada, rigorosa e quantitativa para avaliar as mudanças conjuntas que acompanham a OA.

Protocolo

Os ratos C57BL/6 de 12 semanas foram comprados da Jax Labs. Todos os ratos foram alojados em grupos de 3-5 ratos por gaiola micro-isolador em uma sala com um cronograma de luz/escuro de 12 horas. Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com o Guia do Instituto Nacional de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso animal da Universidade Estadual da Pensilvânia.

1. Modelo cirúrgico de osteoartrite pós-traumática (PTOA)

1. Anestesia camundongos usando uma combinação de cetamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) através de injeção intraperitoneal, administram buprenorfina (1 mg/kg) através de injeção intraperitoneal para alívio da dor e raspam o cabelo sobre o joelho. Verifique a falta de um reflexo do pedal antes de iniciar a cirurgia.
2. Realizar a desestabilização da cirurgia do menisco medial (DMM) como descrito anteriormente^22,23.
   NOTA: Consulte as referências de Glasson et al. e Singh et al. para obter informações mais detalhadas sobre o protocolo cirúrgico^22,23.
   1. Faça uma incisão longitudinal de 3 mm da patela distal ao platô tibial proximal da articulação do joelho direito. Use uma sutura para deslocar o tendão patelar.
   2. Abra a cápsula articular medial para o tendão e mova a almofada de gordura infrapatelar para visualizar a região intercondylar, o menisco medial e o ligamento meniscotibial²³.
   3. Transcção do ligamento meniscotibial medial para completar o DMM e desestabilizar a articulação^22,23. Feche o local da incisão com grampos ou suturas.
3. Realizar cirurgias falsas após um procedimento semelhante, mas sem transsecção do ligamento meniscotibial medial.
   NOTA: Os camundongos foram randomizados para receber uma cirurgia de DMM ou falsa. De acordo com a literatura publicada anteriormente, os camundongos desenvolvem Um PTOA significativo 12 semanas após a cirurgia DMM^22,23,24.

2. Eutanásia do rato e coleta de amostras

1. Eutanásia do rato
   1. Doze semanas após o DMM, anestesiar camundongos usando uma combinação de cetamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg) através de injeção intraperitoneal.
   2. Faça uma incisão midline através da pele ao longo do tórax e retraia a caixa torácica para expor o coração para fixação por perfusão²⁷.
      NOTA: Consulte a referência gage et al. para obter informações adicionais sobre o protocolo para fixação adequada de roedores, bem como a representação em vídeo da montagem e procedimentos adequados do equipamento²⁷.
   3. Configure o aparelho de perfusão de acordo com o protocolo do fabricante.
   4. Eutanie o rato por perfucidade de soro fisiológico heparinizado através do ventrículo esquerdo até que o sangue seja limpo e o fígado fique pálido. Perfuja o mouse com formalina tamponada neutra de 10% até que a fixação completa do mouse seja alcançada.
      NOTA: Um mouse perfundido com sucesso ficará rígido. O tempo médio de perfusão usando o sistema de bomba automatizado é de 5 a 7 min.
2. Coleta e preparação de amostras
   1. Isole os joelhos cortando o osso no meio do fêmur e na tíbia média e disseque o tecido muscular circundante.
   2. Continue a fixação armazenando as articulações do joelho em formalina tampão 10% neutra à temperatura ambiente por 24 h, depois a 4 °C por 6 dias.
   3. Descalcifique o osso armazenando a amostra no tampão de decalcificação EDTA por 1 semana a temperatura ambiente com leve agitação²⁸. Altere a solução de buffer de decalcificação a cada 3 dias.
      NOTA: O tampão de descalcificação foi preparado dissolvendo 140 g de tetrasódio edta ultrapuro em uma solução de 850 mL de água destilada mais 15 mL de ácido acético glacial. O tampão foi equilibrado para 7,6 por adição de ácido acético glacial à solução. Ao atingir o pH = 7,6, o tampão foi trazido para 1 L de volume total com água destilada. O tampão de descalcificação foi preparado fresco e usado dentro de uma semana de preparação.
   4. Lave os joelhos com 50% de etanol, depois 70% de etanol por 15 min cada, depois processe para incorporação.
      NOTA: O processamento da transferência de fluidos foi realizado pelo Núcleo molecular e histopatológico do Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Consulte o núcleo de histologia da instituição para obter recomendações sobre o processamento ideal da amostra.
   5. Incorporar os joelhos do rato na parafina com o aspecto medial da articulação voltado para a superfície inferior do bloco de parafina. Aplique uma leve pressão no lado tibial da articulação durante a incorporação para garantir que as superfícies tibiais e femorais estejam o mais próximo possível do mesmo plano.

3. Secção de microtome e seleção de slides

1. Secção de microtomes
   1. Use os botões de ajuste do plano no suporte do bloco do microtome para garantir a adequada face do bloco de amostra.
   2. Enfrente o bloco de parafina para que o aspecto distal do fêmur, região proximal da tíbia, e chifres anteriores e posteriores do menisco medial apareçam no mesmo plano para coleta de seção(Figura Suplementar 1A). Comece a coletar seções em slides quando os chifres anteriores e posteriores do menisco medial começam a se separar um do outro.
   3. Certifique-se de que a tíbia, fêmur e menisci apareçam no mesmo plano comparando tamanhos de estrutura. A tíbia e o fêmur devem ser de tamanho comparável, com ambos os chifres meniscos semelhantes em tamanho e forma(Figura Suplementar 1A). Se uma estrutura parece muito grande em comparação com sua contraparte, isso indica que são necessários enfrentamentos adicionais. Importante, confirme que o espaço articular permanece intacto.
   4. Pegue as seções sagitais dos joelhos do mouse embutidos para fina através do compartimento articular medial em seções de 5 μm e colete as seções em slides. Coletar aproximadamente 30 seções por bloco de parafina.
2. Seleção de slides
   1. Selecione três seções representativas com 50 μm de distância para cada amostra a partir da quinta seção (ou seja, slides 5, 15 e 25). Slides selecionados serão usados para coloração subseqüente, pontuação OARSI e análise histomorfométrica.
      NOTA: A partir de um bloco com 30 seções totais, selecione slides desde o início (slides 5-10), médio (slides 15-20) e final (slides 25-30) do conjunto para representar claramente toda a amostra. Selecione slides de níveis semelhantes de profundidade entre as amostras.

4. Hematoxilina, Laranja Safranin e Coloração verde rápida

1. Deparafinaos os slides selecionados com três alterações de xileno. Hidrate os slides com duas variações de 100% de etanol, duas variações de 95% de etanol e uma variação de 70% de etanol.
2. Manche as lâminas com hematoxilina por 7 min e depois lave com água corrente por 10 min. Manche com verde rápido por 3 min e enxágue em ácido acético glacial de 1,0% para 10 s. Manche com Safranin-O por 5 min e enxágue rapidamente mergulhando em 0,5% de ácido acético glacial.
3. Enxágüe slides em duas mudanças de água destilada e deixe o ar secar.
4. Desça slides em três mudanças de xileno por 5 min cada, em seguida, monte com mídia de montagem baseada em xileno e um deslizamento de cobertura.
   NOTA: A hematoxilina serve como mancha nuclear para identificar áreas de medula óssea. Safranin-O é usado para colorir cartilagem, proteoglicanos, mucina e grânulos de células de mastro. Fast Green é usado como contra-mancha para osso.

5. Slide imaging

1. Imagem os slides manchados Safranin-O e Fast Green usando uma câmera disponível conectada a um microscópio e software de imagem baseado em computador.
2. Abra o software de imagem (ver Tabela de Materiais) e organize a região de interesse da articulação do joelho (ROI) no centro da janela de imagem. Se utilizar um estágio de slide de microscópio rotacional, alinhe o slide de modo que a superfície da tíbia atravesse a largura do eixo horizontal da região de imagem.
3. Defina o balanço de branco da câmera antes de começar a visualizar um conjunto de amostras(Figura Suplementar 2). Imagem do compartimento articular em ampliação de 4x e 10x, garantindo que tanto a superfície articular tibial quanto femoral e o osso subcondrato tibial estejam incluídos em cada um dos ROIs de imagem(Figura Suplementar 1A, B). Salvar imagens para cada um dos três níveis selecionados a serem usados para pontuação OARSI.
   NOTA: A definição do balanço de branco da câmera dependerá do software e dos sistemas de câmera que estão sendo usados. Geralmente, navegue até a guia da câmera ou menu principal de imagem e role para baixo para definir balanço de branco. Selecione Definir balanço de branco e um pequeno cursor ou ícone deve aparecer(Figura Suplementar 2A). Usando o cursor, selecione uma área dentro da imagem/amostra livre de manchas, como o espaço articular, para definir o balanço de branco.

6. Sociedade Internacional de Pesquisa de Osteoartrite (OARSI) marcando^{15 pontos}

1. Alesuamente os três slides selecionados safranin-o e fast green manchados de todas as amostras.
2. Executar pontuação OARSI de forma cegacom três observadores. Resumidamente, exiba uma imagem de cada vez em uma ordem aleatória e permita que três observadores marquem cada imagem, correlacionando-se com um dos três níveis selecionados para cada amostra.
   NOTA: Consulte a tabela de pontuação OARSI para obter descrições detalhadas da escala de classificação¹⁵.
3. Calcule a pontuação média de cada seção usando pontuações individuais de cada observador. Determine a pontuação média por amostra, tomando a pontuação média das três seções representativas.

7. Análise histomorfométrica

NOTA: Imagens ao vivo da articulação do joelho são visualizadas em um monitor touchscreen usando uma câmera de microscópio, e uma caneta é usada para rastrear manualmente os ROIs. Algoritmos incorporados do software de histomormormetria quantificam os parâmetros especificados (ver Protocolo abaixo) nos ROIs definidos. É importante ressaltar que as mesmas seções manchadas safranin-O e fast green utilizadas na pontuação OARSI são usadas para análise histomorfométrica.

1. Preparação e medição de software
   1. Ligue o microscópio, a câmera, o computador e o monitor touchscreen. Clique no Ícone do Software para iniciar o programa de software. Coloque o slide no estágio do microscópio para visualização.
   2. Centralizar a amostra dentro da janela de medição. Certifique-se de que a grade de medição está configurada para a ampliação adequada para corresponder ao objetivo utilizado no microscópio(Figura Suplementar 3).
   3. Vá para a guia Arquivo na parte superior da tela e role para baixo para As Configurações de Leitura. Abra a janela Configurações e selecione o arquivo de configurações apropriada para os parâmetros a serem medidos.
   4. Selecione o parâmetro a ser medido a partir da lista no lado direito da tela(Figura Suplementar 3). Use o cursor de estilete ou mouse para rastrear imagens de acordo com as etapas descritas abaixo, a fim de medir os ROIs específicos do tecido. Quando concluído com cada medição, clique com o botão direito do mouse para finalizar a medição e continuar até o próximo parâmetro.
      NOTA: A lista de parâmetros a serem medidos é criada por meio de um arquivo de preferência distinto que é configurado em consulta com a empresa de software com o objetivo de medir os ROIs descritos. Consulte a discussão para obter mais detalhes sobre a configuração completa.
   5. Complete todas as medições e navegue até a guia Dados resumidos na parte inferior da tela do software(Figura Suplementar 3). Clique na janela da tela, clique na tecla Inserir no teclado ou copiar e cole os dados em uma planilha separada.
      NOTA: Realize a análise histomorfométrica de forma aleatória e cega. Após completar todas as medições de parâmetros para todas as amostras, organize os dados e média das medições das três lâminas de cada amostra.
2. Medições das áreas de cartilagem total, calcificada e não calcificada
   NOTA: Use um software comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais)para executar essas etapas. Consulte a Figura Suplementar 1B,C para esclarecimento sobre as regiões da cartilagem, junções e regiões ósseas subcondradas discutidas ao longo desta seção.
   1. Desenhe uma linha através da borda superior da superfície da cartilagem tibial onde a cartilagem encontra o espaço articular. Desenhe uma segunda linha na junção condro-osséous onde a cartilagem calcificada encontra o osso subcondral (Figura 1B). Use a função Área do software para obter automaticamente a medição total da área da cartilagem.
   2. Desenhe uma linha ao longo da maré, uma linha de ocorrência natural que separa as regiões calcificadas e não calcificadas da cartilagem. Desenhe uma segunda linha na junção condro-osséous onde a cartilagem calcificada encontra o osso subcondral (Figura 1B). Use a função Área do software para obter automaticamente a medição da área de cartilagem calcificada.
   3. Calcular a área de cartilagem não calcificada subtraindo a área de cartilagem calcificada da área total da cartilagem (Figura 1B).
3. Determinação do número de condrócito e fenótipo
   1. Crie funções de contagem separadas dentro das configurações do software de histomormormetria para distinguir a matriz produtora e a matriz de condrócitos não-produtores(Figura 1B).
   2. Determine o número de matrizes que produzem ou não produzem condrócitos usando o estilete para fazer um pequeno pontilhado sobre cada condrócito expressando o fenótipo especificado(Figura 1B).
      NOTA: Conte células de acordo com seu fenótipo como produção de matriz (ou seja, forte coloração de Safranin-O) ou não-produção de matriz (ou seja, muito fraca ou sem coloração de Safranin-O).
4. Medição do perímetro de superfície articular tibial
   1. Meça o perímetro absoluto da superfície articular tibial traçando uma linha através da superfície da cartilagem tibial, definindo cuidadosamente fibrilações individuais(Figura 1C).
   2. Desenhe uma segunda linha ao longo da marca de maré para servir como um controle interno para o plano de cada seção (Figura 1C).
   3. Calcule o índice de fibrilação da superfície articular tibial dividindo o perímetro da superfície articular tibial pelo perímetro da maré.
      NOTA: Os perímetros de maré são geralmente iguais entre as amostras, de modo que a diferença nos perímetros articulares entre a farsa e o DMM foi geralmente pequena se o perímetro absoluto ou o índice de fibrilação foram usados.
5. Medição das áreas de espaço subcondral de osso e medula
   1. Meça a área espacial da medula subcondral usando a função Área delineando regiões na região subcondral manchadas apenas com hematoxilina (ou seja, negativo para Verde Rápido) para determinar a área total da medula dentro do osso subcondrado. Desenhe linhas ao redor do perímetro dessas áreas para determinar a área total de todo o espaço da medula dentro do osso subcondrato tibial (Figura 2B).
   2. Meça a área subcondral total utilizando a função de área delineando a região entre a junção condro-osséous e a borda superior da placa de crescimento, estendendo-se lateralmente às regiões dos osteófitos anteriores e posteriores(Figura 2B).
   3. Calcular a área óssea subcondral subtraindo a área de espaço da medula óssea subcondral da área subcondral total (Figura 2B,C).
6. Medição das áreas osteófitos anterior e posterior
   1. Para medir a área dos osteófitos, trace os osteófitos anteriores e posteriores da tíbia proximal utilizando a função Área (Figura 2B,E,F).
      NOTA: Osteófitos são projeções ósseas que se formam entre a cartilagem articular e a placa de crescimento, anterior ou posterior à região subcondral. As áreas de osteófitos nos lados anterior e posterior da tíbia são determinadas traçando a área anterior ou posterior ao osso subcondral. A junção entre os osteófitos e osso subcondral é claramente delineada por uma linha de células que se estende da cartilagem articular até a placa de crescimento. A junção entre o osteófito e o sinóvio é definida por uma transição entre tecido ósseo e fibroso.
7. Medição da espessura sinovial
   1. Meça a espessura do femoral anterior usando a função Área desenhando uma linha do ponto de inserção interna do sinóvio anterior no fêmur em direção ao seu ponto de fixação no menisco(Figura 3B).
   2. Desenhe uma segunda linha da inserção externa do sinóvio no fêmur em direção ao seu apego ao menisco (Figura 3B).
   3. Calcule a espessura sinovial dividindo a área sinovial total pelo perímetro sinovial.

8. Análise estatística

1. Coletar os parâmetros medidos e média dos resultados das três seções representativas para cada amostra. Analise os dados usando um teste t de student não emparelhado para comparar dois grupos ou ANOVA unidirecional para comparar três ou mais grupos.
2. Exibir os dados como erro médio ± padrão de média.
   NOTA: A significância estatística foi alcançada em p ≤ 0,05.

Resultados

OA induzido por DMM resulta em degeneração da cartilagem articular e perda de condrócito
A OA induzida pelo DMM resultou em um aumento da pontuação de OARSI em comparação com camundongos falsos, caracterizado distintamente pela erosão da superfície e perda de cartilagem(Figura 1A,D). O protocolo de histomormormetria detalhado aqui detectou várias alterações associadas à OA, incluindo uma diminuição na área total da cartilagem e na área de...

Discussão

Pesquisas recentes de osteoartrite melhoraram nossa compreensão do crosstalk entre os diferentes tecidos dentro da articulação e o papel que cada tecido desempenha na iniciação ou progressão da doença^8,9,10,35,36. Assim, tornou-se óbvio que a avaliação da OA não deve se limitar à análise da cartilagem, mas também deve incluir a análise do osso s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher Chemical	SF100-20	For sample fixation following harvest
Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)	Fisher Chemical	A38S-212	For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining
Cintiq 27QHD Creative Pen Display	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	For histomorphometric analysis and imaging
Cintiq Ergo stand	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	For histomorphometric analysis and imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%	Acros Organics	AC446080010	For Decalcification Buffer preparation
Fast Green stain	SIGMA Life Sciences	F7258	For sample staining
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher	12-550-15	For sample section collection
HistoPrep Xylene	Fisherbrand	HC-700-1GAL	For sample deparrafinization and staining
Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base	Fisher	15-182-701A	For sample processing and embedding
HP Z440 Workstation	HP	Product number: Y5C77US#ABA	For histomorphometric analysis and imaging
Manual Rotary Microtome	Leica	RM 2235	For sample sectioning
Marking pens	Leica	3801880	For sample labeling, cassettes and slides
OLYMPUS BX53 Microscope	OLYMPUS	https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/	For histomorphometric analysis and imaging
OLYMPUS DP 73 Microscope Camera	OLYMPUS	https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/	For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)
ORION STAR A211 pH meter	Thermo Scientific	STARA2110	For Decalcification Buffer preparation
OsteoMeasure Software	OsteoMetrics	https://www.osteometrics.com/index.htm	For histomorphometric measurement and analysis
Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system	Leica	Model # 39471005	For mouse knee harvest
PRISM 7 Software	GraphPad	Institutional Access Account	Statistical Analysis
Safranin-O stain	SIGMA Life Sciences	S8884	For sample staining
ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage	Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)	http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php	For histomorphometric analysis and imaging
Wacom Pro Pen Stylus	Wacom	https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch	For histomorphometric analysis and imaging
Weigerts Iron Hematoxylin A	Fisher	5029713	For hematoxylin staining
Weigerts Iron Hematoxylin B	Fisher	5029714	For hematoxylin staining