JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، يتم تقديم بروتوكول لاستخراج بصريا وفهرسة التوقيعات الفلورية الخلوية الفطرية (أي، autofluorescence الخلوية) من كل خلية حية الفردية الموزعة في الفضاء ثلاثي الأبعاد. هذه الطريقة مناسبة لدراسة التوقيع الفلوري الفطري للأنظمة البيولوجية المتنوعة بدقة خلية واحدة ، بما في ذلك خلايا من البكتيريا والفطريات والخمائر والنباتات والحيوانات.

Abstract

الموصوفة هنا هو انعكاس الكونفوكوكال بمساعدة المجهر خلية واحدة تحليل الفلورية الفطرية (CRIF)، وهي طريقة طفيفة التوغل لإعادة بناء التوقيع الفلوري الخلوية الفطرية من كل خلية حية فردية في السكان موزعة في مساحة ثلاثية الأبعاد (3D). التوقيع الفلوري الفطري للخلية هو مجموعة من إشارات الفلورسينس المنبعثة من الجزيئات الحيوية المختلفة داخل الخلية. أثبتت الدراسات السابقة أن توقيعات الفلورسينس الفطرية تعكس مختلف الخصائص الخلوية والاختلافات في الحالة الفسيولوجية وهي مصدر غني للمعلومات لتحديد خصائص الخلايا وتحديدها. وقد تم تحليل التوقيعات الفلورية الفطرية تقليديا على مستوى السكان، مما استلزم ثقافة التخفي، ولكن ليس على مستوى الخلية الواحدة. CRIF مناسبة بشكل خاص للدراسات التي تتطلب دقة ثلاثية الأبعاد و / أو استخراج انتقائي للإشارات الفلورية من الخلايا الفردية. ولأن التوقيع الفلوري هو خاصية فطرية للخلية، فإن CRIF مناسب أيضا للتنبؤ الخالي من العلامات بنوع و/أو الحالة الفسيولوجية للخلايا السليمة والخلايا المفردة. قد تكون هذه الطريقة أداة قوية لتحليل الخلايا المبسطة ، حيث يمكن تقييم النمط الظاهري لكل خلية واحدة في مجموعة غير متجانسة مباشرة من خلال توقيعها autofluorescence تحت المجهر دون وضع علامات على الخلية.

Introduction

تنبعث من الجزيئات الحيوية المتنوعة داخل الخلية 1 إشارات الفلورة الذاتية ، ويتكون التوقيع الفلوري الفطري للخلية من تجميع هذه الإشارات. يعكس هذا التألق المميز خصائص خلوية مختلفة وكذلك اختلافات في الحالة الفسيولوجية. تحليل الفلورسينس الفطرية هو الحد الأدنى من الغازية ويمكن أن تكمل التقليدية، والتحقيقات الميكروبيولوجية أكثر الغازية التي تترك مجموعة من الآثار من تعديل التمثيل الغذائي المعتدل لتدمير الخلايا كاملة. في حين أن التقنيات التقليدية مثل الحمض النووي أو استخراج محتوى الخلية2،3 ، الفلورسنت في التهجين الموقع4 ، وإدخال جينات المراسل الفلوري إلى الجينوم فعالة في تحديد نوع الخلية أو الحالة الفسيولوجية ، فإنها تتطلب عادة إما التلاعب بالخلايا أو وضع علامات غازية.

وقد أظهرت الدراسات التي أجريت على الفلورة الفطرية لمختلف المستعمرات الميكروبية الحية وسليمة، بما في ذلك تعليق الاستزراع الميكروبي السائب5،6، والحمأة النشطة7، وأنسجة الثدييات8،9، وخلايا الثدييات1،10، أن تحليل الفلورسنت الفطري يسهل التحليل الخالي من العلامات لأنواع الخلايا والحالة الفسيولوجية. وقد تم تقليديا تحليل التوقيعات الفلورية الفطرية على مستوى السكان وليس على مستوى الخلية الواحدة ، وبالتالي تتطلب ثقافة التخفي. في المقابل ، فإن تقنية تحليل التوهج البؤري confocal بمساعدة المجهر وحيدة الخلية innate fluorescence (CRIF) التقنية11 الموصوفة هنا تعيد بناء وفهرسة التوقيع الفلوري الخلوي الفطري لكل خلية ميكروبية حية فردية. وعلاوة على ذلك، يمكن ل CRIF أن تجمع بشكل منهجي التوقيع الفلوري الفطري لخلية ميكروبية واحدة داخل مجموعة يتم توزيعها في مساحة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد العينة

  1. ضع طوقا من السيليكون سمكه 1 مم مع آبار على شريحة زجاجية.
  2. ضع لوح أغروز سمكه 1 مم 0.8٪ (ث/v) في بئر طوقا السيليكون.
  3. تخفيف كثافة الخلية من ثقافة الخلية الميكروبية التعسفي إلى كثافة بصرية في 600 نانومتر (OD660) = 1.0.
  4. وضع 5 ميكرولتر aliquot من تعليق الخلية على لوح agarose.
  5. يغطى بلطف بغطاء زجاجي.

2. إعداد المجهر

ملاحظة: تقنية CRIF يجمع بين المجهر انعكاس confocal (CRM) والمنظار المجهري confocal متعدد القنوات. يعمل CRM كمصدر للمعلومات للمورفولوجيا الخلوية والتوطين المكاني ، وهو مستقل عن الفلورسينس الفطري الخلوي. يوفر التحليل المجهري البؤري متعدد القنوات المعلومات الطيفية للفلورة الفطرية الخلوية. في البروتوكول التالي، يشار إلى أي صورة تم الحصول عليها باستخدام المجهر الفلوري CONFOCAL مع CRM أو صورة المجهر البؤري متعدد القنوات، على التوالي.

  1. قم بتوصيل مجهر كونفوجكال مع قنوات طيفية مقفرة بأنبوب فوتوموليلييه (PMT) أو كاشف GaAsP.
    ملاحظة: تتوفر هذه الاجهزة من عدة شركات مصنعة.
  2. تجهيز المجهر مع فتحة رقمية عالية (NA) الهدف مع التكبير الكافي.
    ملاحظة: يوصى ب 63x الهدف مع NA > 1.4 لتحليل الخلايا البكتيرية.
  3. تجهيز المجهر مع مرآة نصف انعكاس (على سبيل المثال، NT 80/20) لاستيعاب إدارة علاقات العملاء، والتي تعتمد على التشتت الخلوي للضوء الحادث لتصور مورفولوجيا الخلية.
  4. للمنظار المجهري متعدد القنوات، قم بتجهيز المجهر بالمرايا الديكهروية. على سبيل المثال، استخدم MBS InVis405 أو MBS458 أو MBS488 أو MBS458/514 أو MBS488/543 أو MBS 488/543/633 مقسمات الحزمة ل 405 أو 458 أو 488 أو 514 أو 543 أو 633 نانومتر على التوالي.
  5. ضبط كثافة الإضاءة لكل الطول الموجي الإثارة باستخدام مقياس طاقة الليزر. الحفاظ على الناتج تحت المجهر ثابت من خلال أطوال موجية الإثارة (على سبيل المثال، استخدام 50 μW مع الهدف 63x).

3. الحصول على صورة

  1. تعيين حجم الثقب إلى 1 الاتحاد الافريقي باستخدام برنامج المجهر.
  2. تعيين الوقت يسكن بكسل (أي سرعة المسح) لكل الطول الموجي الإثارة.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي وقت الشغل الطويل بشكل مفرط للبكسل إلى تلف الخلايا. تجنب وقتا طويلا للغاية للبكسل لتقليل التكميل الضوئي إلى الخلايا. بالنسبة للعينات البكتيرية، فإن الوقت الذي يسكن فيه البكسل <55.6 ميكروجرام/ميكرومتر2 (عندما يكون ناتج الإشعاع تحت المجهر ~ 17 μW/cm2) عادة ما يكون مناسبا لتجنب تثبيط النمو. قد تختلف هذه المعلمة اعتمادا على الكائنات الحية والإعدادات التجريبية.
  3. تعيين دقة المسح الضوئي. بالنسبة للخلايا الصغيرة مثل البكتيريا، استخدم منطقة مسح تبلغ 1,024 × 1,024.
  4. تعيين نطاق Z-المسح الضوئي بحيث يتم تغطية المنطقة ذات الاهتمام.
    ملاحظة: بالنسبة لعينات الخلايا البكتيرية والخميرة الموزعة على لوح الآغاروز، فإن نطاق المسح الضوئي Z الذي يبلغ ~ 15 ميكرومترا عادة ما يكون كافيا.
  5. تعيين كاشف descanned لالتقاط نطاق الطول الموجي المرئي (على سبيل المثال، 416−691 نانومتر). استخدم نافذة طيفية من 8−10 نانومتر.
  6. الحصول على صور المجهر البؤري متعدد القنوات في تسلسل من أطول إلى أقصر أطوال موجية الإثارة لإنشاء Z-أكوام من الصور الفلورية.
  7. الحصول على صور CRM.
  8. حفظ الصور المكتسبة كملفات tiff 16 بت في دليل. اسم الملفات باستخدام اصطلاح التسمية XXXcYYzZZ.tif، حيث XXX هو الطول الموجي الإثارة، YY هو رقم قناة كاشف، ZZ هو رقم Z-شريحة، و "ج" و "ض" هي بادئات لرقم الكاشف ورقم Z-شريحة، على التوالي.
    1. على سبيل المثال، إذا تم التقاط صورة مجهرية متعددة القنوات مجهرية مع طول موجي مثير يبلغ 405 نانومتر، قناة كاشف 1 من صفيف الكاشف، وهي الشريحة الخامسة من المكدس Z، سمها "405c01z05.tif". بالنسبة لصور CRM، استخدم السلسلة "CRM" بدلا من XXX (على سبيل المثال، "CRMc01z05.tif").
      ملاحظة: حدد ما إذا كان التقسيم ثلاثي الأبعاد أو ثلاثي الأبعاد هو الأكثر ملاءمة لبيانات الصورة. استخدم طريقة تجزئة 2D في الحالات التي تكون فيها الخلايا الصغيرة مقيدة بسطح 2D (على سبيل المثال ، السكان البكتيرية التي تلتزم بسطح زجاجي). استخدم طريقة التقسيم ثلاثي الأبعاد في الحالات التي يتم فيها توزيع مجموعة الخلايا في مساحة ثلاثية الأبعاد (مثل الأغشية الحيوية وعينات الأنسجة) أو تكون أحجام الخلايا أكبر من سمك الشريحة البصرية (على سبيل المثال، خلايا الخميرة وخلايا الثدييات). بالنسبة للتجزئة 2D الرجوع إلى القسم 4; للتجزئة ثلاثية الأبعاد، راجع القسم 5.

4. تحليل الصور 2D

  1. تجهيز محطة عمل مع برامج تحليل الصور (على سبيل المثال، MATLAB).
  2. إجراء تجزئة الخلية وإعادة بناء توقيعات الفلورسينس الفطرية أحادية الخلية.
    1. افتح برنامج تحليل الصور.
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق أحد البرامج النصية المتوفرة "Script2D.m" وفتحه.
    3. انتقل إلى علامة التبويب محرر ، ثم انقر فوق تشغيل. يجب أن تظهر نافذة تحديد مجلد.
    4. حدد الدليل الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.8، ثم انقر فوق فتح للمتابعة. سيظهر مربع حوار يطالب بإدخال معلمة التقسيم تلقائيا.
      ملاحظة: لأغراض الاختبار حدد مجموعة البيانات المتوفرة ("Sample_2D"). يتم توفير مجموعة البيانات عينة كملف مضغوط وينبغي استخراج مقدما.
    5. إدخال معلمات التقسيم: عتبة إعادة تنسيق الصورة (0−1) ل Binarization الصورة = 0.45، والعتبة العليا لمنطقة الخلية (بالبكسل) = 200، والعتبة السفلية لمنطقة الخلية (بالبكسل) = 10، وعدد أجهزة الكشف = 32. انقر فوق موافق للمتابعة.
      ملاحظة: قد تتطلب هذه المعلمات ضبط حسب جودة الصورة.
    6. يجب أن تظهر نافذة صورة جديدة تعرض صورة CRM. حدد منطقة خلفية عشوائية (أي منطقة حيث الخلايا غائبة) لاستخدامها في طرح الخلفية. رسم مستطيل داخل صورة CRM بواسطة الماوس السحب. انقر نقرا مزدوجا فوق المنطقة المحددة لتأكيد التحديد.
    7. البحث عن دليل جديد يسمى التوقيع في نفس الدليل المحدد في الخطوة 4.2.4.
      ملاحظة: التعليمات البرمجية المتوفرة تلقائيا بإنشاء هذا الدليل. يخزن الدليل "Signature" التوقيع المضان الفطري لكل خلية ميكروبية ضمن مجموعة سكانية كملفات .png مرقمة بشكل متسلسل بعد بادئة شائعة "Signature".

تحليل الصور 5.3D

  1. تجهيز محطة عمل مع برنامج تحليل الصور (جدول المواد).
  2. إجراء تجزئة الخلية وإعادة بناء توقيعات الفلورسينس الفطرية أحادية الخلية.
    1. افتح برنامج تحليل الصور.
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق ثم افتح البرنامج النصي المتوفر "Script3D.m".
    3. انتقل إلى علامة التبويب محرر ، ثم انقر فوق تشغيل. يجب أن تظهر نافذة تحديد مجلد.
    4. حدد الدليل الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.8، ثم انقر فوق فتح للمتابعة. سيظهر مربع حوار يطالب بإدخال معلمات التقسيم تلقائيا.
      ملاحظة: لأغراض الاختبار حدد مجموعة البيانات المتوفرة ("Sample_3D"). يتم توفير مجموعة البيانات عينة كملف مضغوط وينبغي استخراج مقدما.
    5. إدخال معلمات التقسيم: عتبة Binarization الصورة (0-1) ل binarization الصورة = 0.01، العتبة العليا لوحدة تخزين الخلية (بالبكسل) = 1000، الحد الأدنى لمنطقة الخلية (بالبكسل) = 20، X حجم بكسل [μm/pixel] = 0.26، Y حجم بكسل [μm/pixel] = 0.26، Z حجم بكسل [μm/pixel] = 0.42، وعدد أجهزة الكشف = 32. انقر فوق موافق للمتابعة; سيظهر مربع حوار يطالب بإدخال عدد الأطوال الموجية للإثارة.
      ملاحظة: قد تتطلب هذه المعلمات ضبط حسب جودة الصورة.
    6. إدخال عدد الأطوال الموجية المستخدمة لاكتساب الصورة (على سبيل المثال، إذا تم استخدام 405، 488، 561، 630، أدخل 4 في مربع الحوار). انقر فوق موافق.
    7. أدخل أطوال الموجة الإثارة في تسلسل من أقصر (أي، اسم مربع: الإثارة رقم 1) إلى أطول طول موجي في مربعات الحوار. انقر فوق موافق للمتابعة; يجب أن تظهر نافذة صورة جديدة تقدم صورة CRM.
    8. حدد منطقة الخلفية التعسفية (أي المنطقة التي تكون فيها الخلايا غائبة) لاستخدامها في طرح الخلفية. رسم مستطيل داخل صورة CRM بواسطة الماوس السحب. انقر نقرا مزدوجا فوق المنطقة المحددة لتأكيد التحديد.
    9. البحث عن الدليل المسمى التوقيع في الدليل المحدد في الخطوة 5.2.4.
      ملاحظة: التعليمات البرمجية المتوفرة تلقائيا بإنشاء هذا الدليل. يخزن الدليل "Signature" التوقيع المضان الفطري لكل خلية ميكروبية واحدة داخل مجموعة سكانية كملفات .png مرقمة بشكل متسلسل بعد بادئة شائعة "Signature".

6. التحليل الإحصائي

ملاحظة: تنفيذ تقنيات الحد من الأبعاد (على سبيل المثال، تحليل المكون الرئيسي [PCA]) لتصور توزيع hyperspectrums من مجموعات الخلايا. ينفذ البرنامج النصي المقدم (PCA.py) PCA لمحتوى خلية اثنين (أي فئتين).

  1. تجهيز محطة عمل مع لغة البرمجة والمكتبات المصاحبة والوحدات (جدول المواد).
  2. إنشاء دليل فارغ في محرك الأقراص C (أو ما يعادلها) واسم الدليل "Parent_directory" (أي C:/ Parent_ الدليل).
  3. تخزين التوقيعات الفلورية (مثل ملفات .png التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.7) لكل من مجموعتي الخلية في دليلين منفصلين.
    ملاحظة: يجب أن يكون كلا الدلائل اثنين الموجودة في "Parent_directory".

    جيم: /Parent_directory/
    figure-protocol-9135وضعية PUTIDAKT2440/
    figure-protocol-9238 figure-protocol-9319التوقيع01.png
    figure-protocol-9415 figure-protocol-9496التوقيع02.png
    figure-protocol-9593 figure-protocol-9673:
    figure-protocol-9758وضعية PUTIDAKT2442/
     figure-protocol-9863التوقيع01.png
     figure-protocol-9962التوقيع02.png
     figure-protocol-10061:
  4. تحميل PCA.py في "Parent_directory".
  5. افتح واجهة سطر الأوامر لمحطة العمل.
  6. اكتب "python C:/Parent_directory/PCA.py" في واجهة سطر الأوامر.
  7. حدد "Parent_directory" بعد عرض الرسالة "تحديد الدليل الهدف".
  8. في "C:/Parent_directory"، ابحث عن "PCA.png"، الذي يحتوي على مؤامرة PCA الناتجة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يظهر الشكل 1A التوقيع النموذجي للفلورسينس أحادي الخلية لخلية بكتيرية مقدم كمؤامرة طيف تقليدية (أعلى) وكخريطة حرارية (وسط). ويبين الشكل 1B نتيجة تجزئة دقيقة للخلايا 2D فوق صورة CRM الأصلية لجمعية من بكتيريا التربة (Pseudomonas putida KT2440)12. يتم تقديم الت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هناك نقطتان حاسمتان في هذه الطريقة التي تحتاج إلى متابعة عن كثب للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ: 1) الحفاظ على إخراج طاقة الليزر تحت هدف المجهر متسقة من خلال أطوال الموجات والتجارب الإثارة، و 2) إجراء تجزئة دقيقة للخلايا.

النقطة الأولى مهمة بشكل خاص عند مقارنة التوقيع الفلو?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا بمنحة في المعونة للبحث العلمي من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والتكنولوجيا في اليابان (18K04843) إلى Y. Yawata، وJST ERATO (JPMJER1502) إلى ن. نومورا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseWako Chemicals312-01193
Beam splittersCarl Zeiss, NikonMBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss)
Confocal microscopeCarl Zeiss, NikonModel LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)
Cover slipsMatsunami GlassC024601
Glass slidesMatsunami GlassS011120
Half-reflection mirrorCarl Zeiss, NikonNT80/20
Laser power meterThorlabsPM400 (power meter console) and S175C (sensor)
LB BrothNacalai tesque20066-95For bacteria culture
Image analysis softwareThe MathWorksMATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed
Microscope objectiveCarl Zeiss, Nikon440762-9904e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)
Microscope softwareCarl Zeiss, NikonZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)
PBS(-)Wako Chemicals166-23555
Programming languagePython and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script.
Silicone gasketThermoFisher ScientificP24744
WorkstationA high-performance workstation with discrete GPUs is recommended.
Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar mediumSigma-AldrichY1500-250GFor yeast culture
YPD mediumSigma-AldrichY1375-250G

References

  1. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
  2. Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
  3. Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
  4. Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
  5. Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
  6. Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
  7. Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289(2017).
  8. Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
  9. Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
  10. Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453(2016).
  11. Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
  12. Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
  13. Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
  14. Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
  15. Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
  16. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , Springer. Germany. (2006).
  17. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
  18. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved