Ricostruzione delle firme di fluorescenza innata unicellulare mediante microscopia confocale

Riepilogo

Qui, viene presentato un protocollo per estrarre otticamente e catalogare le firme di fluorescenza cellulare innata (cioè l'autofluorescenza cellulare) da ogni singola cellula viva distribuita in uno spazio tridimensionale. Questo metodo è adatto per studiare la firma di fluorescenza innata di diversi sistemi biologici a una risoluzione unicellulare, comprese le cellule di batteri, funghi, lieviti, piante e animali.

Abstract

Qui è descritta l'analisi di fluorescenza innata a singola cellula assistita da microscopia a riflessione confocale (CRIF), un metodo minimamente invasivo per ricostruire la firma di fluorescenza cellulare innata da ogni singola cellula viva in una popolazione distribuita in uno spazio tridimensionale (3D). La firma di fluorescenza innata di una cellula è una raccolta di segnali di fluorescenza emessi da varie biomolecole all'interno della cellula. Studi precedenti hanno stabilito che le firme di fluorescenza innata riflettono varie proprietà cellulari e differenze nello stato fisiologico e sono una ricca fonte di informazioni per la caratterizzazione e l'identificazione cellulare. Le firme di fluorescenza innata sono state tradizionalmente analizzate a livello di popolazione, rendendo necessaria una coltura clonale, ma non a livello di singola cellula. Il CRIF è particolarmente indicato per studi che richiedono risoluzione 3D e/o estrazione selettiva di segnali di fluorescenza da singole cellule. Poiché la firma di fluorescenza è una proprietà innata di una cellula, il CRIF è adatto anche per la previsione senza tag del tipo e/o dello stato fisiologico di cellule intatte e singole. Questo metodo può essere un potente strumento per l'analisi cellulare semplificata, in cui il fenotipo di ogni singola cellula in una popolazione eterogenea può essere valutato direttamente dalla sua firma di autofluorescenza al microscopio senza marcatura cellulare.

Introduzione

Diverse biomolecole all'interno di una ^cellula1 emettono segnali di autofluorescenza e la firma di fluorescenza innata di una cellula consiste nell'assemblaggio di questi segnali. Questa fluorescenza distintiva riflette varie proprietà cellulari e anche differenze nello stato fisiologico. L'analisi della fluorescenza innata è minimamente invasiva e può integrare le sonde microbiologiche tradizionali e più invasive che lasciano una serie di tracce dalla lieve modificazione metabolica alla completa distruzione cellulare. Mentre le tecniche tradizionali come l'estrazione del DNA o del contenuto ^cellulare2,3, l'ibridazione fluorescente in ^situ4 e l'introduzione di geni reporter fluorescenti nel genoma sono efficaci nel determinare il tipo di cellula o lo stato fisiologico, comunemente richiedono la manipolazione delle cellule o l'etichettatura invasiva.

Studi sulla fluorescenza innata di varie colonie microbiche vive e intatte, tra cui sospensioni di colture microbiche ^sfuse5,6, fanghi ^attivi7, tessuti di ^mammiferi8,9 e cellule di ^{mammifero1,10}, hanno dimostrato che l'analisi della fluorescenza innata facilita l'analisi senza tag dei tipi cellulari e dello stato fisiologico. Le firme di fluorescenza innata sono state tradizionalmente analizzate a livello di popolazione e non a livello di singola cellula, e quindi richiedono una coltura clonale. Al contrario, la tecnica di analisi della fluorescenza dell'innato a singola cellula assistita da microscopia a reflezione confocale11 qui descritta ricostruisce e cataloga la firma di fluorescenza cellulare innata di ogni singola cellula microbica viva. Inoltre, CRIF può raccogliere sistematicamente la firma di fluorescenza innata di una singola cellula microbica all'interno di una popolazione distribuita in uno spazio tridimensionale (3D).

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Posizionare una guarnizione in silicone di 1 mm di spessore con pozzetti su una slitta di vetro.
2. Posizionare una lastra di agarosio dello 0,8% (p/v) di spessore 1 mm nel pozzetto della guarnizione in silicone.
3. Diluire la densità cellulare di una coltura cellulare microbica arbitraria a una densità ottica a 600 nm (_OD660) = 1.0.
4. Posizionare un'aliquota di 5 μL di sospensione cellulare sulla lastra di agarosio.
5. Coprire delicatamente con una copertura di vetro.

2. Configurazione di un microscopio

NOTA: La tecnica CRIF combina microscopia a riflessione confocale (CRM) e microscopia confocale multicanale. Il CRM funge da fonte di informazioni per la morfologia cellulare e la localizzazione spaziale, che è indipendente dalla fluorescenza innata cellulare. La microspettroscopia confocale multicanale fornisce le informazioni spettrali della fluorescenza innata cellulare. Nel seguente protocollo, qualsiasi immagine acquisita con CRM o microspettroscopia a fluorescenza confocale viene definita rispettivamente immagine CRM o immagine di microspettroscopia confocale multicanale.

1. Collegare un microscopio confocale con canali spettrali descanned a un tubo fotomoltiplicatore (PMT) o a un rivelatore GaAsP.
   NOTA: queste configurazioni sono disponibili da diversi produttori.
2. Dotare il microscopio di un obiettivo ad alta apertura numerica (NA) con un ingrandimento adeguato.
   NOTA: un obiettivo 63x con NA > 1.4 è raccomandato per l'analisi delle cellule batteriche.
3. Dotare il microscopio di uno specchio a semiriflesso (ad esempio, NT 80/20) per ospitare il CRM, che si basa sulla diffusione cellulare della luce incidente per visualizzare la morfologia cellulare.
4. Per la microspettroscopia confocale multicanale, dotare il microscopio di specchi dicroici. Ad esempio, utilizzare MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 o MBS 488/543/633 beam splitter per 405, 458, 488, 514, 543 o 633 nm di eccitazione, rispettivamente.
5. Regolare l'intensità dell'illuminazione per ogni lunghezza d'onda di eccitazione utilizzando un misuratore di potenza laser. Mantenere costante l'output al microscopio attraverso lunghezze d'onda di eccitazione (ad esempio, utilizzare 50 μW con l'obiettivo 63x).

3. Acquisizione di immagini

1. Impostare la dimensione del foro stenopeico su 1 UA utilizzando il software del microscopio.
2. Impostare il tempo di permanenza dei pixel (ad esempio, la velocità di scansione) per ogni lunghezza d'onda di eccitazione.
   NOTA: un tempo di permanenza in pixel eccessivamente lungo può danneggiare le celle. Evitare un tempo di permanenza dei pixel eccessivamente lungo per ridurre al minimo il fotodanno alle celle. Per i campioni batterici, un tempo di permanenza in pixel <55,6 μs/^μm2 (quando l'uscita di irraggiamento al microscopio è ~ 17 μW/^cm2) è solitamente adatto per evitare l'inibizione della crescita. Questo parametro può variare a seconda degli organismi e delle configurazioni sperimentali.
3. Impostare la risoluzione di scansione. Per le piccole cellule come i batteri, utilizzare un'area di scansione di 1.024 x 1.024.
4. Impostare l'intervallo di scansione Z in modo che la regione di interesse sia coperta.
   NOTA: per i campioni di cellule batteriche e di lievito distribuiti su una lastra di agarosio, di solito è sufficiente un intervallo di scansione Z di ~ 15 μm.
5. Impostare il rivelatore descanned per catturare l'intervallo di lunghezze d'onda visibili (ad esempio, 416-691 nm). Utilizzare una finestra spettrale di 8−10 nm.
6. Acquisisci immagini di microspettroscopia confocale multicanale in una sequenza dalle lunghezze d'onda di eccitazione più lunghe a quelle più corte per creare pile Z di immagini a fluorescenza.
7. Acquisisci immagini CRM.
8. Salvare le immagini acquisite come file tiff a 16 bit in una directory. Denominare i file utilizzando la convenzione di denominazione XXXcYYzZZ.tif, dove XXX è la lunghezza d'onda di eccitazione, YY è il numero del canale del rivelatore, ZZ è il numero Z-slice e "c" e "z" sono prefissi per il numero del rivelatore e il numero Z-slice, rispettivamente.
   1. Ad esempio, se un'immagine di microspettroscopia confocale multicanale viene scattata con una lunghezza d'onda di eccitazione di 405 nm, 1 ^° canale del rivelatore dell'array di rivelatori, ed è la ^{quinta fetta dello} stack Z, denominarla "405c01z05.tif". Per le immagini CRM, utilizzare la stringa "CRM" al posto di XXX (ad esempio, "CRMc01z05.tif").
      NOTA: decidere se la segmentazione 2D o 3D è più adatta per i dati dell'immagine. Utilizzare un metodo di segmentazione 2D in situazioni in cui le piccole cellule sono vincolate a un piano 2D (ad esempio, la popolazione batterica che aderisce a una superficie di vetro). Utilizzare il metodo di segmentazione 3D in situazioni in cui la popolazione cellulare è distribuita in uno spazio tridimensionale (ad esempio, biofilm e campioni di tessuto) o le dimensioni delle cellule sono maggiori dello spessore della fetta ottica (ad esempio, cellule di lievito, cellule di mammifero). Per la segmentazione 2D fare riferimento alla sezione 4; per la segmentazione 3D, fare riferimento alla sezione 5.

4. Analisi delle immagini 2D

1. Dotare una workstation di un software di analisi delle immagini (ad esempio, MATLAB).
2. Eseguire la segmentazione cellulare e la ricostruzione delle firme di fluorescenza innata a singola cellula.
   1. Aprire il software di analisi delle immagini.
   2. Fare doppio clic e aprire uno degli script forniti "Script2D.m".
   3. Vai alla scheda Editor , quindi fai clic su Esegui. Dovrebbe apparire una finestra di selezione della cartella.
   4. Selezionare la directory creata nel passaggio 3.8, quindi fare clic su Apri per procedere. Verrà visualizzata automaticamente una finestra di dialogo che richiede l'input del parametro di segmentazione.
      NOTA: a scopo di test, selezionare il set di dati fornito ("Sample_2D"). Il set di dati di esempio viene fornito come file compresso e deve essere estratto in anticipo.
   5. Immettere i parametri di segmentazione: Soglia di binarizzazione dell'immagine (0−1) per la binarizzazione dell'immagine = 0,45, Soglia superiore per una regione di cella (in pixel) = 200, Soglia inferiore per una regione di cella (in pixel) = 10 e Il numero di rilevatori = 32. Fare clic su OK per procedere.
      NOTA: questi parametri potrebbero richiedere una regolazione in base alla qualità dell'immagine.
   6. Dovrebbe apparire una nuova finestra di immagine che presenta un'immagine CRM. Selezionare un'area di sfondo arbitraria (ad esempio, un'area in cui le celle sono assenti) da utilizzare per la sottrazione dello sfondo. Disegna un rettangolo all'interno dell'immagine CRM trascinando il mouse. Fare doppio clic all'interno dell'area selezionata per confermare la selezione.
   7. Trovare una nuova directory denominata Firma nella stessa directory selezionata nel passaggio 4.2.4.
      NOTA: il codice fornito crea automaticamente questa directory. La directory "Firma" memorizza la firma di fluorescenza innata di ogni cellula microbica all'interno di una popolazione come file .png numerati in serie dopo un prefisso comune "Firma".

5.3D analisi delle immagini

1. Dotare una postazione di lavoro del software di analisi delle immagini (Table of Materials).
2. Eseguire la segmentazione cellulare e la ricostruzione delle firme di fluorescenza innata a singola cellula.
   1. Aprire il software di analisi delle immagini.
   2. Fare doppio clic e aprire lo script fornito "Script3D.m".
   3. Vai alla scheda Editor , quindi fai clic su Esegui. Dovrebbe apparire una finestra di selezione della cartella.
   4. Selezionare la directory creata nel passaggio 3.8, quindi fare clic su Apri per procedere. Apparirà automaticamente una finestra di dialogo che richiede l'input dei parametri di segmentazione.
      NOTA: a scopo di test, selezionare il set di dati fornito ("Sample_3D"). Il set di dati di esempio viene fornito come file compresso e deve essere estratto in anticipo.
   5. Immettere i parametri di segmentazione: Soglia di binarizzazione dell'immagine (0-1) per la binarizzazione dell'immagine = 0,01, Soglia superiore per un volume di cella (in pixel) = 1.000, Soglia inferiore per una regione di cella (in pixel) = 20, Dimensione pixel X [μm/pixel] = 0,26, Dimensione pixel Y [μm/pixel] = 0,26, Dimensione pixel Z [μm/pixel] = 0,42 e Numero di rilevatori = 32. Fare clic su OK per procedere; verrà visualizzata una finestra di dialogo che richiede l'input per il numero di lunghezze d'onda di eccitazione.
      NOTA: questi parametri potrebbero richiedere una regolazione in base alla qualità dell'immagine.
   6. Immettere il numero di lunghezze d'onda utilizzate per l'acquisizione delle immagini (ad esempio, se vengono utilizzati 405, 488, 561, 630, immettere 4 nella finestra di dialogo). Fare clic su OK.
   7. Immettere le lunghezze d'onda di eccitazione in una sequenza dalla più corta (ad esempio, nome della casella: Eccitazione n. 1) alla lunghezza d'onda più lunga nelle finestre di dialogo. Fare clic su OK per procedere; dovrebbe apparire una nuova finestra di immagine che presenta un'immagine CRM.
   8. Selezionare l'area di sfondo arbitraria (ad esempio, l'area in cui le celle sono assenti) da utilizzare per la sottrazione dello sfondo. Disegna un rettangolo all'interno dell'immagine CRM trascinando il mouse. Fare doppio clic all'interno dell'area selezionata per confermare la selezione.
   9. Individuare la directory denominata Firma nella directory selezionata nel passaggio 5.2.4.
      NOTA: il codice fornito crea automaticamente questa directory. La directory "Firma" memorizza la firma di fluorescenza innata di ogni singola cellula microbica all'interno di una popolazione come file .png numerati in serie dopo un prefisso comune "Firma".

6. Analisi statistica

NOTA: Eseguire tecniche di riduzione dimensionale (ad esempio, analisi dei componenti principali [PCA]) per visualizzare la distribuzione degli iperspettri delle popolazioni cellulari. Lo script fornito (PCA.py) esegue PCA per due popolazioni di cellule (cioè due classi).

1. Dotare una postazione di lavoro del linguaggio di programmazione e delle librerie e dei moduli di accompagnamento (Tabella dei materiali).
2. Creare una directory vuota nell'unità C (o equivalente) e denominare la directory "Parent_directory" (ad esempio, C:/ Parent_).
3. Memorizzare le firme di fluorescenza (ad esempio, i file di .png generati nel passaggio 4.2.7) di ciascuna delle due popolazioni cellulari in due directory separate.
   NOTA: le due directory devono trovarsi entrambe nella "Parent_directory".
   
   C:/Parent_directory/
   putidaKT2440/
    Firma01.png
    Firma02.png
    :
   putidaKT2442/
    Firma01.png
    Firma02.png
    :
4. Scarica PCA.py nel "Parent_directory".
5. Aprire l'interfaccia della riga di comando della workstation.
6. Digita "python C:/Parent_directory/PCA.py" nell'interfaccia della riga di comando.
7. Seleziona "Parent_directory" dopo aver visualizzato il messaggio "Seleziona directory di destinazione".
8. Nel "C:/Parent_directory", trova "PCA.png", che contiene un grafico PCA risultante.

Risultati

La Figura 1A mostra la tipica firma di fluorescenza a singola cellula di una cellula batterica presentata come un grafico dello spettro tradizionale (in alto) e come una mappa di calore (al centro). La Figura 1B mostra il risultato di un'accurata segmentazione cellulare 2D sovrapposta all'immagine CRM originale di una popolazione di batteri del suolo (Pseudomonas putida KT2440)¹². Le firme di fluorescenza innata risultanti per la...

Discussione

Ci sono due punti critici in questo metodo che devono essere seguiti da vicino per ottenere risultati riproducibili: 1) mantenere coerente la potenza del laser sotto l'obiettivo del microscopio attraverso lunghezze d'onda di eccitazione ed esperimenti e 2) eseguire un'accurata segmentazione cellulare.

Il primo punto è particolarmente importante quando si confronta la firma di fluorescenza innata tra diversi esperimenti. Evita di applicare semplicemente le stesse impostazioni di "uscita percen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Wako Chemicals	312-01193
Beam splitters	Carl Zeiss, Nikon		MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss)
Confocal microscope	Carl Zeiss, Nikon		Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)
Cover slips	Matsunami Glass	C024601
Glass slides	Matsunami Glass	S011120
Half-reflection mirror	Carl Zeiss, Nikon		NT80/20
Laser power meter	Thorlabs		PM400 (power meter console) and S175C (sensor)
LB Broth	Nacalai tesque	20066-95	For bacteria culture
Image analysis software	The MathWorks		MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed
Microscope objective	Carl Zeiss, Nikon	440762-9904	e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)
Microscope software	Carl Zeiss, Nikon		ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)
PBS(-)	Wako Chemicals	166-23555
Programming language			Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script.
Silicone gasket	ThermoFisher Scientific	P24744
Workstation			A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended.
Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium	Sigma-Aldrich	Y1500-250G	For yeast culture
YPD medium	Sigma-Aldrich	Y1375-250G