JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, üç boyutlu bir alanda dağıtılan her canlı hücreden doğuştan gelen hücresel floresan imzalarının (yani hücresel otofluoresans) optik olarak çıkarılması ve kataloglanması için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, bakteri, mantar, maya, bitki ve hayvanlardan gelen hücreler de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sistemlerin doğuştan gelen floresan imzasını tek hücreli çözünürlükte incelemek için uygundur.

Özet

Burada açıklanan konfokal yansıma mikroskopi destekli tek hücreli doğuştan gelen floresan analizi (CRIF), üç boyutlu (3D) bir alanda dağılmış bir popülasyondaki her bir canlı hücreden doğuştan gelen hücresel floresan imzasını yeniden oluşturmak için minimal invaziv bir yöntemdir. Bir hücrenin doğuştan gelen floresan imzası, hücre içindeki çeşitli biyomoleküllerin yaydığı floresan sinyallerinin bir koleksiyonudur. Önceki çalışmalar, doğuştan gelen floresan imzaların fizyolojik durumdaki çeşitli hücresel özellikleri ve farklılıkları yansıttığını ve hücre karakterizasyonu ve tanımlanması için zengin bir bilgi kaynağı olduğunu ortaya konmuştur. Doğuştan gelen floresan imzalar geleneksel olarak nüfus düzeyinde analiz edilmiş, klonal bir kültür gerektirmiştir, ancak tek hücre düzeyinde değildir. CRIF özellikle 3D çözünürlük ve/veya bireysel hücrelerden floresan sinyallerinin seçici olarak çıkarılmasını gerektiren çalışmalar için uygundur. Floresan imzası bir hücrenin doğuştan gelen bir özelliği olduğundan, CRIF, sağlam ve tek hücrelerin türünün ve/veya fizyolojik durumunun etiketsiz tahmini için de uygundur. Bu yöntem, heterojen popülasyondaki her bir hücrenin fenotipinin hücre etiketlemesi olmadan bir mikroskop altında otofluoresans imzası ile doğrudan değerlendirilebileceği aerodinamik hücre analizi için güçlü bir araç olabilir.

Giriş

Bir hücre içinde çeşitli biyomoleküller1 otofluoresans sinyalleri yayar ve bir hücrenin doğuştan gelen floresan imzası bu sinyallerin montajından oluşur. Bu imza floresan çeşitli hücresel özellikleri ve fizyolojik durum farklılıklarını yansıtır. Doğuştan gelen floresan analizi minimal invazivdir ve hafif metabolik modifikasyondan hücre yıkımına kadar bir dizi iz bırakan geleneksel, daha invaziv mikrobiyolojik probları tamamlayabilir. DNA veya hücre içeriği ekstraksiyonu2,3, floresan in situ hibridizasyon4 ve floresan muhabir genlerinin genoma girmesi gibi geleneksel teknikler hücre tipinin veya fizyolojik durumun belirlenmesinde etkili olsa da, genellikle hücrelerin manipülasyonunu veya invaziv etiketlemeyi gerektirir.

Toplu mikrobiyal kültür süspansiyonları5,6, aktif çamurlar7, memeli dokuları8,9 ve memeli hücreleri1,10 dahil olmak üzere çeşitli canlı ve bozulmamış mikrobiyal kolonilerin doğuştan gelen floresan çalışmaları, doğuştan gelen floresan analizinin hücre tiplerinin ve fizyolojik durumun etiketsiz analizini kolaylaştırdığını göstermiştir. Doğuştan gelen floresan imzalar geleneksel olarak tek hücre düzeyinde değil, nüfus düzeyinde analiz edilmiştir ve bu nedenle klonal bir kültür gerektirmektedir. Buna karşılık, burada açıklanan confokal reflection mikroskopi destekli tek hücreli innate fluoresans analizi (CRIF) tekniği11, her bir canlı mikrobiyal hücrenin doğuştan gelen hücresel floresan imzasını yeniden yapılandırır ve kataloglar. Ayrıca CRIF, üç boyutlu (3B) bir alanda dağıtılan bir popülasyondaki tek bir mikrobiyal hücrenin doğuştan gelen floresan imzasını sistematik olarak harmanlayabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Numunenin hazırlanması

  1. Cam bir kaydırağın üzerine kuyulu 1 mm kalınlığında silikon conta yerleştirin.
  2. Silikon contanın kuyusuna 1 mm kalınlığında %0,8 (w/v) agarose levha yerleştirin.
  3. Rastgele bir mikrobiyal hücre kültürünün hücre yoğunluğunu 600 nm (OD660) = 1.0 optik yoğunluğa seyreltin.
  4. Agarose levhasına 5 μL hücre süspansiyonu yerleştirin.
  5. Cam bir kapakla hafifçe örtün.

2. Mikroskop kurulumu

NOT: CRIF tekniği konfokal yansıma mikroskopisi (CRM) ve çok kanallı konfokal mikspektoskopiyi birleştirir. CRM, hücresel morfoloji ve hücresel doğuştan gelen floresan bağımsız mekansal lokalizasyon için bilgi kaynağı olarak hizmet vermektedir. Çok kanallı konfokal mikspektif, hücresel doğuştan gelen floresan spektral bilgilerini sağlar. Aşağıdaki protokolde CRM veya konfokal floresan mikspektroskopi ile elde edilen herhangi bir görüntüye sırasıyla CRM görüntüsü veya çok kanallı konfokal mikspektroskopi görüntüsü denir.

  1. Descanned spektral kanallara sahip bir konfokal mikroskobu fotomultiplier tüpe (PMT) veya GaAsP dedektörüne bağlayın.
    NOT: Bu kurulumlar çeşitli üreticilerden edinilebilir.
  2. Mikroskobu yüksek sayısal diyafram açıklığı (NA) hedefiyle yeterli büyütme ile donatın.
    NOT: Bakteri hücrelerini analiz etmek için NA > 1.4 ile 63x hedefi önerilir.
  3. Hücre morfolojisini görselleştirmek için olay ışığının hücresel dağılımını sağlayan CRM'ye uyum sağlamak için mikroskobu yarı yansıma aynası (örneğin NT 80/20) ile donatın.
  4. Çok kanallı konfokal mikrospektroskopi için mikroskobu dikroik aynalarla donatın. Örneğin, sırasıyla 405, 458, 488, 514 veya 633 nm heyecan vericileri için MBS InVis405, MBS458, MBS488/514, MBS488/543/633 ışın ayırıcılarını kullanın.
  5. Lazer güç ölçer kullanarak her bir heyecan dalga boyu için aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın. Uyarılma dalga boyları aracılığıyla mikroskop altındaki çıkışı sabit tutun (örneğin, 63x hedefiyle 50 μW kullanın).

3. Görüntü alımı

  1. Mikroskop yazılımını kullanarak iğne deliği boyutunu 1 AU olarak ayarlayın.
  2. Her heyecan dalga boyu için piksel bekleme süresini (yani tarama hızını) ayarlayın.
    NOT: Aşırı uzun piksel bekleme süresi hücrelere zarar verebilir. Hücrelere fotodamajı en aza indirmek için aşırı uzun piksel bekleme süresinden kaçının. Bakteriyel numuneler için, bir piksel bekleme süresi <55.6 μs/μm2 (mikroskop altındaki ışınım çıkışı ~17 μW/cm2 olduğunda) genellikle büyüme inhibisyonunu önlemek için uygundur. Bu parametre organizmalara ve deneysel kurulumlara bağlı olarak değişebilir.
  3. Tarama çözünürlüğünü ayarlayın. Bakteri gibi küçük hücreler için 1.024 x 1.024 tarama alanı kullanın.
  4. Z tarama aralığını, ilgi alanı kapsanması için ayarlayın.
    NOT: Agarose levha üzerine dağıtılan bakteriyel ve maya hücre örnekleri için genellikle ~15 μm'lik bir Z tarama aralığı yeterlidir.
  5. Descanned dedektörünü görünür dalga boyu aralığını (örneğin, 416−691 nm) yakalayacak şekilde ayarlayın. 8−10 nm'lik bir spektral pencere kullanın.
  6. Floresan görüntülerin Z yığınlarını oluşturmak için en uzundan en kısa heyecan dalga boylarına kadar bir dizi sırayla çok kanallı konfokal mikspestoskopi görüntüleri elde edin.
  7. CRM görüntülerini alın.
  8. Alınan görüntüleri 16 bit tiff dosyaları olarak bir dizine kaydedin. XXX'in heyecan dalga boyu olduğu, YY'nin dedektör kanal numarası, ZZ'nin Z dilim numarası ve "c" ve "z" dedektör numarası ve Z-dilim numarası için sırasıyla önekler olduğu XXXcYYzZZ.tif adlandırma kuralını kullanarak dosyaları adlandırın.
    1. Örneğin, çok kanallı konfokal mikrospektroskopi görüntüsü, dedektör dizisinin 1. dedektör kanalı olan 405 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ile alınırsa ve Z.tif yığınının 5. CRM görüntüleri için XXX yerine "CRM" dizesini kullanın (örneğin, "CRMc01z05.tif").
      NOT: 2D veya 3D segmentasyonun görüntü verileri için en uygun olup olmadığına karar verin. Küçük hücrelerin 2D düzlemle sınırlandırıldığı durumlarda (örneğin, cam yüzeye yapışmış bakteri popülasyonu) bir 2D segmentasyon yöntemi kullanın. Hücre popülasyonunun üç boyutlu bir alana dağıtıldığı durumlarda (örneğin, biyofilmler ve doku örnekleri) veya hücre boyutlarının optik dilimin kalınlığından (örneğin, maya hücreleri, memeli hücreleri) daha büyük olduğu durumlarda 3D segmentasyon yöntemini kullanın. 2D segmentasyon için bölüm 4'e bakın; 3D segmentasyon için bölüm 5'e bakın.

4. 2D görüntü analizi

  1. Bir iş istasyonunu görüntü analiz yazılımıyla donatın (örneğin, MATLAB).
  2. Hücre segmentasyonunu ve tek hücreli doğuştan gelen floresan imzalarının yeniden yapılandırılmasıni gerçekleştirin.
    1. Görüntü analiz yazılımını açın.
    2. Sağlanan "Script2D.m" komut dosyalarından birini çift tıklatın ve açın.
    3. Düzenleyici sekmesine gidin ve Çalıştır'ı tıklatın. Bir klasör seçim penceresi görünmelidir.
    4. 3.8. adımda oluşturulan dizini seçin ve devam etmek için Aç'ı tıklatın. Segmentasyon parametresinin girişini soran bir iletişim kutusu otomatik olarak görüntülenir.
      NOT: Test amacıyla sağlanan veri kümesini seçin ("Sample_2D"). Örnek veri kümesi sıkıştırılmış bir dosya olarak sağlanır ve önceden ayıklanmalıdır.
    5. Segmentasyon parametrelerini girin: Görüntü Binarizasyonu için Görüntü Binarizasyon Eşiği (0−1) = 0,45, Hücre Bölgesi için Üst Eşik (piksel cinsinden) = 200, Hücre Bölgesi için Alt Eşik (piksel cinsinden) = 10 ve Dedektör Sayısı = 32. Devam etmek için Tamam'ı tıklatın.
      NOT: Bu parametreler görüntü kalitesine bağlı olarak ayarlama gerektirebilir.
    6. CRM görüntüsü sunan yeni bir görüntü penceresi görünmelidir. Arka plan çıkarma için kullanılacak rasgele bir arka plan bölgesi (örneğin, hücrelerin bulunmadığı alan) seçin. Fare sürükleyerek CRM görüntüsü içinde bir dikdörtgen çizin. Seçimi onaylamak için seçili bölgede çift tıklatın.
    7. 4.2.4 adımında seçilen aynı dizinde İmza adlı yeni bir dizin bulun.
      NOT: Sağlanan kod otomatik olarak bu dizini oluşturur. "İmza" dizini, bir popülasyondaki her mikrobiyal hücrenin doğuştan gelen floresan imzasını, ortak bir "İmza" önekinden sonra seri olarak numaralanan dosyaları .png olarak depolar.

5.3D görüntü analizi

  1. Bir iş istasyonunu görüntü analiz yazılımı (Malzeme Tablosu) ile donatın.
  2. Hücre segmentasyonunu ve tek hücreli doğuştan gelen floresan imzalarının yeniden yapılandırılmasıni gerçekleştirin.
    1. Görüntü analiz yazılımını açın.
    2. Sağlanan "Script3D.m" komut dosyasını çift tıklatın ve açın.
    3. Düzenleyici sekmesine gidin ve Çalıştır'ı tıklatın. Bir klasör seçim penceresi görünmelidir.
    4. 3.8. adımda oluşturulan dizini seçin ve devam etmek için Aç'ı tıklatın. Segmentasyon parametrelerinin girişini soran bir iletişim kutusu otomatik olarak görüntülenir.
      NOT: Test amacıyla sağlanan veri kümesini seçin ("Sample_3D"). Örnek veri kümesi sıkıştırılmış bir dosya olarak sağlanır ve önceden ayıklanmalıdır.
    5. Segmentasyon parametrelerini girin: Görüntü binarizasyonu için Görüntü Binarizasyon Eşiği (0–1) = 0,01, Hücre Birimi için Üst Eşik (piksel cinsinden) = 1.000, Hücre Bölgesi için Alt Eşik (piksel cinsinden) = 20, X Piksel Boyutu [μm/piksel] = 0,26, Y Piksel Boyutu [μm/piksel] = 0,26, Z piksel Boyutu [μm/piksel] = 0,42 ve Dedektör Sayısı = 32. Devam etmek için Tamam'ı tıklatın; heyecan dalga boylarının sayısını soran bir iletişim kutusu görüntülenir.
      NOT: Bu parametreler görüntü kalitesine bağlı olarak ayarlama gerektirebilir.
    6. Görüntü alma için kullanılan dalga boylarının sayısını girin (örneğin, 405, 488, 561, 630 kullanılıyorsa, diyalog kutusuna 4 girin). Tamam'ı tıklatın.
    7. Heyecan dalga boylarını diyalog kutularına en kısadan (yani kutu adı: Heyecanlandırma No. 1) ile en uzun dalga boyuna kadar bir sırayla girin. Devam etmek için Tamam'ı tıklatın; CRM görüntüsü sunan yeni bir görüntü penceresi açılmalıdır.
    8. Arka plan çıkarma için kullanılacak rasgele arka plan bölgesini (örneğin, hücrelerin bulunmadığı alan) seçin. Fare sürükleyerek CRM görüntüsü içinde bir dikdörtgen çizin. Seçimi onaylamak için seçili bölgede çift tıklatın.
    9. 5.2.4 adımında seçilen dizinde İmza adlı dizini bulun.
      NOT: Sağlanan kod otomatik olarak bu dizini oluşturur. "İmza" dizini, bir popülasyondaki her bir mikrobiyal hücrenin doğuştan gelen floresan imzasını, ortak bir "İmza" önekinden sonra seri olarak numaralanan dosyaları .png olarak depolar.

6. İstatistiksel analiz

NOT: Hücre popülasyonlarının hiperspektrumlarının dağılımını görselleştirmek için boyutsal azaltma teknikleri (örneğin, ana bileşen analizi [PCA]) gerçekleştirin. Sağlanan komut dosyası (PCA.py) iki hücre popülasyonu (yani iki sınıf) için PCA yürütür.

  1. Bir iş istasyonunu programlama dili ve beraberindeki kütüphaneler ve modüllerle donatın (Malzeme Tablosu).
  2. C sürücüsünde (veya eşdeğerinde) boş bir dizin oluşturun ve dizini "Parent_directory" (örneğin, C:/ Parent_ dizini).
  3. İki hücre popülasyonunun her birinin floresan imzalarını (örneğin, adım 4.2.7'de oluşturulan .png dosyaları) iki ayrı dizinde depolayın.
    NOT: İki dizin de "Parent_directory" içinde bulunmalıdır.

    C:/Parent_directory/
    figure-protocol-10415putidaKT2440/
    figure-protocol-10512 figure-protocol-10593İmza01.png
    figure-protocol-10686 figure-protocol-10767İmza02.png
    figure-protocol-10861 figure-protocol-10941:
    figure-protocol-11026putidaKT2442/
     figure-protocol-11125İmza01.png
     figure-protocol-11221İmza02.png
     figure-protocol-11317:
  4. PCA.py "Parent_directory" içine indirin.
  5. İş istasyonunun komut satırı arabirimini açın.
  6. Komut satırı arabirimine "python C:/Parent_directory/PCA.py" yazın.
  7. 'Hedef dizini seç' mesajı görüntülendikten sonra "Parent_directory" seçeneğini belirleyin.
  8. "C:/Parent_directory"nde, ortaya çıkan bir PCA çizimi içeren "PCA.png" bulun.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1A, geleneksel spektrum grafiği (üstte) ve ısı haritası (ortada) olarak sunulan bakteri hücresinin tipik tek hücreli floresan imzasını göstermektedir. Şekil 1B, toprak bakterisi popülasyonunun orijinal CRM görüntüsünün üzerine yerleştirilmiş doğru bir 2B hücre segmentasyonunun sonucunu göstermektedir (Pseudomonas putida KT2440)12. Popülasyon için ortaya çıkan floresan imzaları

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yöntemde tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için yakından takip edilmesi gereken iki kritik nokta vardır: 1) mikroskop altındaki lazer güç çıkışını uyarım dalga boyları ve deneyleri ile tutarlı tutmak ve 2) doğru hücre segmentasyonu gerçekleştirmek.

İlk nokta, farklı deneyler arasında doğuştan gelen floresan imzasını karşılaştırırken özellikle önemlidir. Maksimum güç çıkışı lazer hatları arasında büyüklük sırasına kadar farklılık göstereb...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Japonya Eğitim, Kültür, Spor ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (18K04843) Y. Yawata'ya, JST ERATO'dan (JPMJER1502) N. Nomura'ya bilimsel araştırmalar için bir hibe ile desteklendi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseWako Chemicals312-01193
Beam splittersCarl Zeiss, NikonMBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss)
Confocal microscopeCarl Zeiss, NikonModel LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)
Cover slipsMatsunami GlassC024601
Glass slidesMatsunami GlassS011120
Half-reflection mirrorCarl Zeiss, NikonNT80/20
Laser power meterThorlabsPM400 (power meter console) and S175C (sensor)
LB BrothNacalai tesque20066-95For bacteria culture
Image analysis softwareThe MathWorksMATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed
Microscope objectiveCarl Zeiss, Nikon440762-9904e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)
Microscope softwareCarl Zeiss, NikonZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)
PBS(-)Wako Chemicals166-23555
Programming languagePython and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script.
Silicone gasketThermoFisher ScientificP24744
WorkstationA high-performance workstation with discrete GPUs is recommended.
Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar mediumSigma-AldrichY1500-250GFor yeast culture
YPD mediumSigma-AldrichY1375-250G

Referanslar

  1. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
  2. Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
  3. Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
  4. Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
  5. Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
  6. Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
  7. Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289(2017).
  8. Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
  9. Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
  10. Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453(2016).
  11. Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
  12. Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
  13. Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
  14. Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
  15. Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
  16. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , Springer. Germany. (2006).
  17. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
  18. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 159konfokal mikroskopispektroskopiotofl oresanstek h creli analizdo u tan gelen floresankonfokal yans ma mikroskopisikonfokal mikspektroskopimikrobiyolojietiketsiz analizminimal invaziv analiz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır