Reconstruction de signatures de fluorescence innées unicellulaires par microscopie confocale

Résumé

Ici, un protocole est présenté pour extraire optiquement et cataloguer les signatures de fluorescence cellulaire innée (c’est-à-dire l’autofluorescence cellulaire) de chaque cellule vivante individuelle distribuée dans un espace tridimensionnel. Cette méthode convient à l’étude de la signature de fluorescence innée de divers systèmes biologiques à une résolution unicellulaire, y compris les cellules de bactéries, de champignons, de levures, de plantes et d’animaux.

Résumé

L’analyse de fluorescence innée unicellulaire (CRIF) assistée par microscopie confocale assistée par microscopie à réflexion confocale est décrite ici, une méthode mini-invasive pour reconstruire la signature de fluorescence cellulaire innée de chaque cellule vivante individuelle dans une population distribuée dans un espace tridimensionnel (3D). La signature de fluorescence innée d’une cellule est une collection de signaux de fluorescence émis par diverses biomolécules à l’intérieur de la cellule. Des études antérieures ont établi que les signatures de fluorescence innées reflètent diverses propriétés cellulaires et différences d’état physiologique et constituent une riche source d’information pour la caractérisation et l’identification cellulaires. Les signatures de fluorescence innées ont traditionnellement été analysées au niveau de la population, nécessitant une culture clonale, mais pas au niveau de la cellule unique. CriF est particulièrement adapté aux études qui nécessitent une résolution 3D et/ou une extraction sélective des signaux de fluorescence de cellules individuelles. Parce que la signature de fluorescence est une propriété innée d’une cellule, CRIF convient également à la prédiction sans étiquette du type et / ou de l’état physiologique des cellules intactes et uniques. Cette méthode peut être un outil puissant pour l’analyse cellulaire rationalisée, où le phénotype de chaque cellule dans une population hétérogène peut être directement évalué par sa signature d’autofluorescence sous un microscope sans marquage cellulaire.

Introduction

Diverses biomolécules au sein d’une ^cellule1 émettent des signaux d’autofluorescence, et la signature de fluorescence innée d’une cellule consiste en l’assemblage de ces signaux. Cette fluorescence caractéristique reflète diverses propriétés cellulaires ainsi que des différences d’état physiologique. L’analyse de la fluorescence innée est peu invasive et peut compléter les sondes microbiologiques traditionnelles plus invasives qui laissent une gamme de traces allant d’une légère modification métabolique à la destruction cellulaire complète. Bien que les techniques traditionnelles telles que l’extraction de l’ADN ou du contenu ^{cellulaire2,3}, l’hybridation fluorescente in ^situ4 et l’introduction de gènes rapporteurs fluorescents dans le génome soient efficaces pour déterminer le type de cellule ou l’état physiologique, elles nécessitent généralement une manipulation des cellules ou un marquage invasif.

Des études sur la fluorescence innée de diverses colonies microbiennes vivantes et intactes, y compris les suspensions de culture microbienne en ^vrac5,6, les boues ^actives7, les tissus de ^{mammifères8,9} et les cellules de ^{mammifères1,10}, ont montré que l’analyse de fluorescence innée facilite l’analyse sans étiquette des types de cellules et de l’état physiologique. Les signatures de fluorescence innées ont été traditionnellement analysées au niveau de la population et non au niveau de la cellule unique, et nécessitent donc une culture clonale. En revanche, la technique d’analyse de fluorescence inéscence unicellulaire assistée par microscopie unicellulaire assistée par réflection confocale11 décrite ici reconstruit et catalogue la signature de fluorescence cellulaire innée de chaque cellule microbienne vivante individuelle. De plus, criF peut systématiquement rassembler la signature de fluorescence innée d’une seule cellule microbienne au sein d’une population distribuée dans un espace tridimensionnel (3D).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Préparation de l’échantillon

1. Placez un joint en silicone de 1 mm d’épaisseur avec des puits sur une lame en verre.
2. Placez une dalle d’agarose de 1 mm d’épaisseur à 0,8 % (p/v) dans le puits du joint en silicone.
3. Diluer la densité cellulaire d’une culture cellulaire microbienne arbitraire à une densité optique de 600 nm (_OD660) = 1,0.
4. Placer une aliquote de 5 μL de suspension cellulaire sur la dalle d’agarose.
5. Couvrir doucement avec un couvercle en verre.

2. Installation d’un microscope

REMARQUE: La technique CRIF combine la microscopie confocale par réflexion (CRM) et la microspectroscopie confocale multicanal. Le CRM sert de source d’information pour la morphologie cellulaire et la localisation spatiale, qui est indépendante de la fluorescence cellulaire innée. La microspectroscopie confocale multicanal fournit l’information spectrale de la fluorescence cellulaire innée. Dans le protocole suivant, toute image acquise avec crm ou microspectroscopie à fluorescence confocale est appelée image CRM ou image de microspectroscopie confocale multicanal, respectivement.

1. Connectez un microscope confocal avec des canaux spectraux décannés à un tube photomultiplicateur (PMT) ou à un détecteur GaAsP.
   REMARQUE: Ces configurations sont disponibles auprès de plusieurs fabricants.
2. Équipez le microscope d’un objectif à grande ouverture numérique (NA) avec un grossissement adéquat.
   REMARQUE: Un objectif 63x avec NA > 1.4 est recommandé pour l’analyse des cellules bactériennes.
3. Équipez le microscope d’un miroir à demi-réflexion (p. ex., NT 80/20) pour s’adapter au CRM, qui repose sur la diffusion cellulaire de la lumière incidente pour visualiser la morphologie cellulaire.
4. Pour la microspectroscopie confocale multicanal, équipez le microscope de miroirs dichroïques. Par exemple, utilisez des séparateurs de faisceau MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 ou MBS 488/543/633 pour une excitation de 405, 458, 488, 514, 543 ou 633 nm, respectivement.
5. Ajustez l’intensité de l’éclairage pour chaque longueur d’onde d’excitation à l’aide d’un capteur de puissance laser. Gardez la sortie sous le microscope constante grâce aux longueurs d’onde d’excitation (par exemple, utilisez 50 μW avec l’objectif 63x).

3. Acquisition d’images

1. Réglez la taille du sténopé sur 1 UA à l’aide du logiciel de microscope.
2. Réglez le temps de séjour des pixels (c’est-à-dire la vitesse de balayage) pour chaque longueur d’onde d’excitation.
   REMARQUE: Un temps de séjour en pixels excessivement long peut endommager les cellules. Évitez le temps de séjour des pixels excessivement long pour minimiser les dommages photo aux cellules. Pour les échantillons bactériens, un temps de séjour en pixels <55,6 μs/^μm2 (lorsque la sortie d’irradiance au microscope est d’environ 17 μW/^cm2) est généralement approprié pour éviter l’inhibition de la croissance. Ce paramètre peut varier en fonction des organismes et des configurations expérimentales.
3. Définissez la résolution de numérisation. Pour les petites cellules telles que les bactéries, utilisez une zone de balayage de 1 024 x 1 024.
4. Définissez la plage de balayage Z de sorte que la région d’intérêt soit couverte.
   REMARQUE: Pour les échantillons de cellules bactériennes et de levure distribués sur une dalle d’agarose, une plage de balayage Z d’environ 15 μm est généralement suffisante.
5. Réglez le détecteur désenchanté pour qu’il capture la gamme de longueurs d’onde visible (p. ex., 416−691 nm). Utilisez une fenêtre spectrale de 8−10 nm.
6. Acquérir des images de microspectroscopie confocale multicanal dans une séquence allant des longueurs d’onde d’excitation les plus longues aux plus courtes pour créer des piles Z d’images de fluorescence.
7. Acquérir des images CRM.
8. Enregistrez les images acquises en tant que fichiers tiff 16 bits dans un répertoire. Nommez les fichiers à l’aide de la convention de dénomination XXXcYYzZZ.tif, où XXX est la longueur d’onde d’excitation, YY est le numéro de canal du détecteur, ZZ est le numéro de tranche Z et « c » et « z » sont des préfixes pour le numéro du détecteur et le numéro de tranche Z, respectivement.
   1. Par exemple, si une image de microspectroscopie confocale multicanal est prise avec une longueur d’onde d’excitation de 405 nm, 1er canal de détection du réseau de ^détecteurs, et est la ^5ème tranche de la pile Z, nommez-la « 405c01z05.tif ». Pour les images CRM, utilisez la chaîne « CRM » à la place de XXX (par exemple, « CRMc01z05.tif »).
      REMARQUE: Décidez si la segmentation 2D ou 3D est la plus appropriée pour les données d’image. Utilisez une méthode de segmentation 2D dans les situations où les petites cellules sont contraintes à un plan 2D (par exemple, une population bactérienne adhérant à une surface de verre). Utilisez la méthode de segmentation 3D dans les situations où la population cellulaire est distribuée dans un espace tridimensionnel (p. ex., biofilms et échantillons de tissus) ou où la taille des cellules est supérieure à l’épaisseur de la tranche optique (p. ex., cellules de levure, cellules de mammifères). Pour la segmentation 2D, reportez-vous à la section 4; pour la segmentation 3D, reportez-vous à la section 5.

4. Analyse d’images 2D

1. Équipez un poste de travail d’un logiciel d’analyse d’images (par exemple, MATLAB).
2. Effectuer la segmentation cellulaire et la reconstruction de signatures de fluorescence innées unicellulaires.
   1. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images.
   2. Double-cliquez et ouvrez l’un des scripts fournis « Script2D.m ».
   3. Accédez à l’onglet Éditeur , puis cliquez sur Exécuter. Une fenêtre de sélection de dossier doit apparaître.
   4. Sélectionnez le répertoire créé à l’étape 3.8, puis cliquez sur Ouvrir pour continuer. Une boîte de dialogue qui invite à saisir le paramètre de segmentation apparaîtra automatiquement.
      REMARQUE : À des fins de test, sélectionnez l’ensemble de données fourni (« Sample_2D »). L’exemple de jeu de données est fourni sous forme de fichier compressé et doit être extrait à l’avance.
   5. Entrez les paramètres de segmentation : Seuil de binarisation d’image (0−1) pour binarisation d’image = 0,45, Seuil supérieur pour une région cellulaire (en pixels) = 200, Seuil inférieur pour une région cellulaire (en pixels) = 10 et Nombre de détecteurs = 32. Cliquez sur OK pour continuer.
      REMARQUE: Ces paramètres peuvent nécessiter un ajustement en fonction de la qualité de l’image.
   6. Une nouvelle fenêtre d’image présentant une image CRM doit apparaître. Sélectionnez une région d’arrière-plan arbitraire (c.-à-d. une zone où les cellules sont absentes) à utiliser pour la soustraction d’arrière-plan. Dessinez un rectangle dans l’image CRM en faisant glisser la souris. Double-cliquez dans la région sélectionnée pour confirmer la sélection.
   7. Recherchez un nouveau répertoire nommé Signature dans le même répertoire sélectionné à l’étape 4.2.4.
      Remarque : Le code fourni crée automatiquement ce répertoire. Le répertoire « Signature » stocke la signature de fluorescence innée de chaque cellule microbienne d’une population sous forme de fichiers .png numérotés en série après un préfixe commun « Signature ».

5.3D analyse d’images

1. Équiper un poste de travail du logiciel d’analyse d’images (Table des matériaux).
2. Effectuer la segmentation cellulaire et la reconstruction de signatures de fluorescence innées unicellulaires.
   1. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images.
   2. Double-cliquez et ouvrez le script fourni « Script3D.m ».
   3. Accédez à l’onglet Éditeur , puis cliquez sur Exécuter. Une fenêtre de sélection de dossier doit apparaître.
   4. Sélectionnez le répertoire créé à l’étape 3.8, puis cliquez sur Ouvrir pour continuer. Une boîte de dialogue qui invite à saisir les paramètres de segmentation apparaîtra automatiquement.
      REMARQUE : À des fins de test, sélectionnez l’ensemble de données fourni (« Sample_3D »). L’exemple de jeu de données est fourni sous forme de fichier compressé et doit être extrait à l’avance.
   5. Entrez les paramètres de segmentation : Seuil de binarisation d’image (0–1) pour la binarisation d’image = 0,01, Seuil supérieur pour un volume de cellule (en pixels) = 1 000, Seuil inférieur pour une région cellulaire (en pixels) = 20, Taille de pixel X [μm/pixel] = 0,26, Taille de pixel Y [μm/pixel] = 0,26, Taille de pixel Z [μm/pixel] = 0,42 et Nombre de détecteurs = 32. Cliquez sur OK pour continuer; une boîte de dialogue qui invite l’entrée pour le nombre de longueurs d’onde d’excitation apparaîtra.
      REMARQUE: Ces paramètres peuvent nécessiter un ajustement en fonction de la qualité de l’image.
   6. Entrez le nombre de longueurs d’onde utilisées pour l’acquisition d’images (par exemple, si 405, 488, 561, 630 sont utilisées, entrez 4 dans la boîte de dialogue). Cliquez sur OK.
   7. Entrez les longueurs d’onde d’excitation dans une séquence allant de la plus courte (c.-à-d. nom de la boîte : Excitation n° 1) à la plus longue longueur d’onde dans les boîtes de dialogue. Cliquez sur OK pour continuer; une nouvelle fenêtre d’image qui présente une image CRM devrait apparaître.
   8. Sélectionnez la région d’arrière-plan arbitraire (c.-à-d. la zone où les cellules sont absentes) à utiliser pour la soustraction d’arrière-plan. Dessinez un rectangle dans l’image CRM en faisant glisser la souris. Double-cliquez dans la région sélectionnée pour confirmer la sélection.
   9. Recherchez le répertoire nommé Signature dans le répertoire sélectionné à l’étape 5.2.4.
      Remarque : Le code fourni crée automatiquement ce répertoire. Le répertoire « Signature » stocke la signature de fluorescence innée de chaque cellule microbienne d’une population sous forme de fichiers .png numérotés en série après un préfixe commun « Signature ».

6. Analyse statistique

REMARQUE : Effectuer des techniques de réduction dimensionnelle (p. ex., analyse en composantes principales [APC]) pour visualiser la distribution des hyperspectres des populations cellulaires. Le script fourni (PCA.py) exécute PCA pour deux populations de cellules (c’est-à-dire deux classes).

1. Équiper un poste de travail du langage de programmation et des bibliothèques et modules qui l’accompagnent (Table des matériaux).
2. Créez un répertoire vide dans le lecteur C (ou équivalent) et nommez le répertoire « Parent_directory » (c’est-à-dire, C:/ Parent_ répertoire).
3. Stockez les signatures de fluorescence (par exemple, les fichiers .png générés à l’étape 4.2.7) de chacune des deux populations cellulaires dans deux répertoires distincts.
   REMARQUE: Les deux répertoires doivent être tous deux situés dans le « Parent_directory ».
   
   C:/Parent_directory/
   putidaKT2440/
    Signature01.png
    Signature02.png
    :
   putidaKT2442/
    Signature01.png
    Signature02.png
    :
4. Téléchargez PCA.py dans le « Parent_directory ».
5. Ouvrez l’interface de ligne de commande du poste de travail.
6. Tapez « python C:/Parent_directory/PCA.py » dans l’interface de ligne de commande.
7. Sélectionnez le « Parent_directory » après l’affichage du message « Sélectionner le répertoire cible ».
8. Dans le « C:/Parent_directory », recherchez « PCA.png », qui contient un graphique PCA résultant.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

La figure 1A montre la signature de fluorescence unicellulaire typique d’une cellule bactérienne présentée sous la forme d’un diagramme de spectre traditionnel (en haut) et d’une carte thermique (au milieu). La figure 1B montre le résultat d’une segmentation cellulaire 2D précise superposée à l’image CRM originale d’une population de bactéries du sol (Pseudomonas putida KT2440)¹². Les signatures de fluorescenc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Il y a deux points critiques dans cette méthode qui doivent être suivis de près pour obtenir des résultats reproductibles: 1) maintenir la puissance de sortie laser sous l’objectif du microscope cohérente à travers les longueurs d’onde d’excitation et les expériences, et 2) effectuer une segmentation cellulaire précise.

Le premier point est particulièrement important lorsque l’on compare la signature de fluorescence innée entre différentes expériences. Évitez d’appliquer...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Wako Chemicals	312-01193
Beam splitters	Carl Zeiss, Nikon		MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss)
Confocal microscope	Carl Zeiss, Nikon		Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)
Cover slips	Matsunami Glass	C024601
Glass slides	Matsunami Glass	S011120
Half-reflection mirror	Carl Zeiss, Nikon		NT80/20
Laser power meter	Thorlabs		PM400 (power meter console) and S175C (sensor)
LB Broth	Nacalai tesque	20066-95	For bacteria culture
Image analysis software	The MathWorks		MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed
Microscope objective	Carl Zeiss, Nikon	440762-9904	e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)
Microscope software	Carl Zeiss, Nikon		ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)
PBS(-)	Wako Chemicals	166-23555
Programming language			Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script.
Silicone gasket	ThermoFisher Scientific	P24744
Workstation			A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended.
Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium	Sigma-Aldrich	Y1500-250G	For yeast culture
YPD medium	Sigma-Aldrich	Y1375-250G